完全弗氏佐剂在制备胫骨炎症痛模型中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及骨炎症痛模型，尤其涉及完全弗氏佐剂(CFA)在制 备胫骨炎症痛模型中的用途。
背景技术：
骨髓炎是一种常见病，由于炎症反复刺激骨膜引起的剧痛严重影响了患者的生活 质量。然而目前对骨炎症引起的疼痛的研究仍鲜见报道，因此应用简单易行的方法建立稳 定的骨炎症模型具有重要的实践意义。骨炎症痛模型的建立将为研究骨髓炎引起的疼痛提 供了一种有价值的动物模型。完全弗氏佐剂(CFA)是一种常用的致炎剂，现有技术公开了完全弗氏佐剂(CFA) 被广泛应用于脚掌皮肤、踝关节炎症痛等慢性疼痛模型的制作，尚未见有报道可应用CFA 制作骨炎症痛模型。骨炎症痛模型的建立能为开展骨癌痛的研究提供很有价值的对照模型。癌症引起 的疼痛即癌症痛，是临床上常见的慢性病理性疼痛之一，据有关观察得知，约三分之一的晚 期癌症患者都会发生骨转移，肿瘤引起的疼痛已严重影响了患者的生活质量。目前，临床实 践中，由于对癌痛机理认识不足，加之各种药物、疗法的诸多局限性，致使相当一部分的癌 痛得不到理想控制。近年来的研究表明，癌痛是一种机理复杂的慢性疼痛，与神经痛、炎症痛既有相似 但又有不同之处，提示癌痛可能同时具有神经痛和炎症痛两种因素。以往的研究均是采用 癌痛与脚掌或深部组织炎症痛模型进行比较研究，其中，有研究表明皮肤等浅表组织与关 节、肌肉等机体深部组织感觉纤维投射不同，因此认为，机体浅表组织与深部组织的炎症疼 痛机理上存在差别。由此可见，采用脚掌或深部组织炎症痛模型与癌痛进行比较所得结论 尚存在一定的局限性。
发明内容
本发明的目的是提供完全弗氏佐剂(CFA)在制备胫骨炎症痛模型中的用途。本发明的进一步目的是提供应用完全弗氏佐剂(CFA)制备的胫骨炎症痛模型。本发明的应用CFA制作骨炎症痛模型，能为开展骨癌痛研究提供更合适的骨炎症 对照模型，也为骨炎症痛研究提供一个有用的实验动物模型。本发明通过下述方法制备所述的骨炎症痛模型实验动物麻醉以后，膝关节部位剔毛，皮肤消毒，膝关节屈曲状态下，采用本领域 常规方法技术将CFA置入实验动物胫骨骨髓腔内后，碘敷消毒，继续饲养2 16天即建成 胫骨炎症痛模型。本发明中，采用的实验动物优选为大鼠，更优选SD或者Wistar大鼠，体重100 300 克。具体的，所述的大鼠经8%水合氯醛腹腔注射麻醉后，膝关节部位剔毛，皮肤以碘敷或70%酒精消毒，膝关节屈曲状态下，在膝关节处(髌韧带边缘)沿胫骨纵轴走向往胫骨 远端腔内，置入CFA5 30ul，碘敷消毒继续饲养2 16天即建成胫骨炎症痛模型。本发明实验中，实验大鼠取膝关节屈曲状态，CFA置入点紧贴大鼠膝关节膑韧带的 外侧或内侧斜至胫骨髁间隆起处，CFA置入方向与胫骨纵轴方向一致。本发明实验中，所述的CFA制备骨炎症痛模型在无菌条件下进行。本发明对应用CFA制备的骨炎症痛模型进行了胫骨组织病理和行为学指标测试， 所述的行为学指标包括热痛阈值变化、机械痛阈值变化等相关指标，结果显示，实验鼠的 炎症显著，行为学指标水平较低。本发明采用CFA制得胫骨炎症痛模型。该骨炎症痛模型将为骨癌痛研究尤其是癌 痛的机制研究提供有价值的骨炎症痛对照模型；为研究临床骨髓炎引起的疼痛提供了有价 值的实验模型，用时丰富了慢性疼痛实验动物模型类型，具有重要的学术研究价值和应用 前景。
图1为胫骨炎症痛模型第2天的大鼠胫骨HE病理切片，其中，A、B为生理盐水组，C、D为CFA组第2天，E、F为CFA组第14天。图2为胫骨炎症痛模型大鼠CFA接种侧后肢机械性痛阈变化情况。图3为胫骨炎症痛模型大鼠CFA接种对侧后肢机械性痛阈变化情况。图4为胫骨炎症痛模型大鼠CFA接种侧后肢脚掌热痛阈变化情况。图5为胫骨炎症痛模型大鼠CFA接种对侧后肢脚掌热痛阈变化情况。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此实施例11.材料和方法致炎剂完全弗氏佐剂(CompleteFreund ‘ s adjuvant, CFA)，购自 Sigma-Aldrich中国分公司；动物SD雌性大鼠，体重140 160克，由中国科学院上海实验动物中心提供；主要仪器vonFrey hair (Stoelting, Wood Dale, Illinois,USA)；辐射热测痛仪 (Model 390 Paw Stimulator Analgesia Meter, IITC/Life ScienceInstruments, USA)；造模方法模型组大鼠经8%水合氯醛腹腔注射麻醉后，膝关节部位剔毛，表面皮肤以碘敷 或70%酒精消毒，膝关节屈曲状态下，在大鼠膝关节处(髌韧带边缘)沿胫骨纵轴走向往胫 骨远端处髓腔内，置入5 30ul CFA，碘敷消毒；对照组大鼠胫骨髓腔内置入等体积的生理盐水，其余操作同模型组。2.指标测定2. 1胫骨组织病理学大鼠以8 %水合氯醛麻醉后，经4 %多聚甲醛灌流后取胫骨，经脱钙石蜡包埋切片(7um)，HE染色，镜下观察胫骨炎症情况。2. 2 行为学分别于造模前及造模后第2、4、6、8、10、12、14、16天用von Freyhair和辐射热法 测定机械痛阈值和热痛阈值。机械痛阈测定安静环境中，室温22士 1°C，大鼠置于底为网格的特制有机玻璃格 子Q6X20 X Hcm)内，适应20分钟后，根据Dixon介绍的up-and-down法，将一系列von Frey 细丝(0. 4g，0. 6g，1. 4g，2. 0g, 4. 0g, 6. 0g, 8. 0g, 15. Og)按照一定的顺序刺激大鼠脚掌 中部皮肤，观察大鼠缩足反应。每根细丝每次刺激时间为1 2秒，前后两次不同刺激间隔 10分钟，然后用软件计算出50% von Frey反应阈值作为机械性痛阈值。热痛阈值测定安静环境中，室温22士 1°C，热痛觉过敏采用，大鼠置于底为光滑 玻璃的有机玻璃格子内，适应20分钟待大鼠安静后，将强热光束照射至大鼠脚掌中心皮 肤，引起大鼠缩爪反应的时间为大鼠缩爪潜伏期(paw withdrawal latency，PWL)，辐射热 强度设定在引起正常大鼠缩爪潜伏期为10 12秒，取3次算平均值，两次间隔10分钟，结 果以痛觉过敏分数(=模型侧缩爪潜伏期-正常侧缩爪潜伏期)表示。为防止大鼠热辐射 烫伤，将的上限值(cut-off time)定为20秒。统计学处理采用SPSSl 1. 0软件进行方差分析，以P < 0. 05认为差异有显著性。3.结果3.1胫骨组织病理学造模后第二天的胫骨病理切片显示，与注射生理盐水组相比，注射CFA组大鼠胫 骨骨髓腔内细胞核固缩、碎裂显著，有大量的嗜中性粒细胞，同时可观察到明显的纤维素性 渗出，提示炎症显著。注射CFA第14天胫骨内可观察到显著的组织纤维化(如图1所示，)。3. 2行为学机械痛阈(如图2所示)与正常组、生理盐水注射组相比，CFA10ul、20ul、30ul模 型组大鼠CFA注射侧后肢对von Frey刺激引起的机械性痛阈值在造模后第2天开始显著 降低(P < 0. 01)，直到造模后第16天一直维持在较低水平。注射CFAlOul、20ul、30ul各组 间注射侧后肢机械性痛阈无显著性差异(P > 0. 05)。(如图3所示)与正常组、生理盐水 组相比，CFAlOul、20ul、30ul模型组大鼠CFA注射对侧后肢对von Frey刺激引起的机械性 痛阈值在造模后第2天开始均有不同程度降低，以后逐渐降低，直到造模后第16天一直维 持在较低水平(P < 0. 05)。而注射生理盐水组大鼠双侧后肢机械性痛阈与正常组大鼠无显 著性差异(P > 0. 05)。热痛阈(如图4、5所示)与正常组大鼠相比，注射生理盐水对照组、注射 CFAlOul、20ul、30ul模型组大鼠双侧后肢对辐射热刺激引起的热痛阈无显著改变(ρ > 0. 05)。
权利要求
1.完全弗氏佐剂在制备胫骨炎症痛模型中的用途。
2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的胫骨炎症痛模型是大鼠胫骨炎症痛 模型。
3.按权利要求1或2所述的用途，其中所述的胫骨炎症痛模型按下述方法制备实验 大鼠麻醉以后，膝关节部位剔毛，皮肤消毒，膝关节屈曲状态下，采用本领域常规方法技术 将完全弗氏佐剂置入实验大鼠胫骨骨髓腔内后，碘敷消毒，继续饲养2 16天，建成胫骨炎 症痛模型。
4.按权利要求3所述的用途，其中所述的实验大鼠为SD或Wistar大鼠，体重为100 300 克。
5.按权利要求3所述的用途，其特征在于所述的实验大鼠采用8%水合氯醛腹腔麻 醉，其皮肤以碘敷或70%酒精消毒；所述的完全弗氏佐剂的置入量为5 30ul。
6.按权利要求3所述的用途，其中所述的胫骨炎症痛模型在无菌条件下制备。
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及骨炎症痛模型，尤其涉及完全弗氏佐剂CFA在制备胫骨炎症痛模型中的用途。本发明对应用完全弗氏佐剂CFA制备的骨炎症痛模型进行了胫骨组织病理和热痛阈值和机械痛阈值等行为学指标测试，结果显示，实验模型的炎症显著，行为学指标水平较低。本发明制得胫骨炎症痛模型将为骨癌痛研究尤其是癌痛的机制研究提供有价值的骨炎症痛对照模型；为研究临床骨髓炎引起的疼痛提供了有价值的实验模型，用时丰富了慢性疼痛实验动物模型类型，具有重要的学术研究价值和应用前景。
文档编号A01K67/027GK102068693SQ20091019923
公开日2011年5月25日 申请日期2009年11月20日 优先权日2009年11月20日
发明者杨长江, 毛应启梁, 王彦青 申请人:复旦大学
文档序号 :
【 338269 】
技术研发人员：毛应启梁,杨长江,王彦青
技术所有人：复旦大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：毛应启梁,杨长江,王彦青
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