一种非药物诱导的脾气虚伴随肠道菌群紊乱动物模型制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中医和西医动物模型领域，具体涉及一种非药物诱导的脾气虚伴随肠 道菌群紊乱动物模型的制备方法。
【背景技术】
[0002] 我国的中医理论著作《黄帝内经》中指出："劳则喘息汗出，外内皆越，故气耗矣"。 即是，过度疲劳可致气虚。《黄帝内经》中又指出："今脾病不能为胃行其津液，四肢不得禀 水谷气，气日以衰，脉道不利，筋骨肌肉，皆无气以生，故不用焉。"即，脾主肌肉及四肢，脾的 功能低下，则表现为四肢困倦、乏力。另外，脾气虚的临床症状主要表现为腹胀、便溏、疲乏 等。
[0003] 肠道菌群是人体正常的微生物，健康人群的胃肠道内寄居有种类繁多的肠道菌 群。肠道菌群按一定的比例组合，各菌间互相拮抗，互相协同，在质和量上形成一种生态平 衡，一旦机体内外环境发生变化，敏感肠菌被抑制，未被抑制的细菌便乘机繁殖，从而引起 菌群失调。肠道菌群失调在中医上主要属于腹痛、泄泻范畴，内因主要以脾虚为主，脾失健 运，肠不能分清泌浊传化糟柏，从而造成肠道菌群紊乱。
[0004] 中医认为脾为后天之本，气血生化之源，与机体的免疫功能等密切相关。脾气虚腹 泻时，肠蠕动加快，肠道中的有益菌增殖减少，有害菌增加，正常菌群的生理作用减弱，加重 腹泻。另外脾气虚时机体免疫力下降，当机体遇急性冷刺激时，加快有害菌的侵入和繁殖， 加重肠道菌群失调，由此形成恶性循环。由此可见，肠道菌群失调与脾气虚互为因果，两者 之间存在着密切关系。近年来，学者对脾气虚和肠道菌群失调动物模型的制作做出了有益 的探索，产生了一些原创性的造模方法。例如，有学者采用精神刺激法制备肝郁脾虚型动物 模型，实验中夹住大鼠尾巴让其相互撕咬，且实验过程中引诱禁食。但此法制备的脾虚模型 不能表征大鼠肠道菌群紊乱状态。另外，有学者将乙酸注入大鼠结肠，然后以〇. 9%氯化钠 溶液冲洗模拟结肠炎，该方法只涉及肠道菌群紊乱状态，不能兼顾脾气虚状态。也有学者用 5%乙酸灌注大鼠结肠加高浓度大黄灌胃法同时制备结肠炎肝郁脾虚症模型，但是给药会 对机体的自身特异性和耐受性差异产生干预，与非药物诱导的肠道菌群紊乱状态存在一定 的本质差异。因此，需要一个新的非药物诱导的模型来表征脾气虚伴随肠道菌群紊乱状态， 为相关代谢通路的探讨提供可靠的动物模型。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种非药物诱导的脾气虚及肠道菌群紊乱模型的制备方法。 通过基于UPLC-MS技术的代谢组学方法和基于16SrRNART-PCR技术的肠道菌群组成和丰 度表征方法对模型进行评价，最终验证了模型造模成功，为研宄中医脾气虚伴随肠道菌群 紊乱和中药干预研宄提供合适的动物模型。
[0006] 本发明通过如下技术方案实现。
[0007] -种非药物诱导的脾气虚及肠道菌群紊乱模型的制备方法，采用大鼠负重游泳加 冰水刺激方法，得到动物模型。
[0008] 1.模型制备
[0009] 在本发明中，用于造模的大鼠体重为180-250g。用于造模大鼠采用如下饲养条件： 动物饲养于SPT环境。室温20-30°C，相对湿度30-60 %，每天12h光照，12h黑暗，自由饮 食。
[0010] 在本发明中，随机将大鼠分为空白和模型组，模型组大鼠尾部悬挂自身体重 2% -10%的重物。将负重大鼠放入水温为20-30°C的容器中强迫其游泳，每天进行1-4次， 间隔0?l-3h，每次游泳至力竭为止。连续力竭游泳7-20天，第10-20天将游泳水温降为 〇-5°C，即模型建立。空白组动物正常饲养，不参与游泳。
[0011] 优选的方案为：随机将大鼠分为空白和模型组，模型组大鼠尾部悬挂自身体重 5%的重物。将负重大鼠放入水温为25±5°C的容器中强迫其游泳，每天进行2次，间隔 0. 5h，每次游泳至力竭为止。连续力竭游泳14天，第14天将游泳水温降为0°C，即模型建 立。空白组动物正常饲养，不参与游泳。
[0012] 造模结束后，眼眶取血。收集新鲜粪便，代谢笼收集尿样。样品于-80°c冰箱保存， 待分析。
[0013] 2?样品分析
[0014] (1)基于UPLC-MS的代谢组学分析
[0015] 采用UPLC-Q-TOF-MS分析收集到的血浆和尿样。
[0016] 色谱条件：WatersACQUITYHSST3 色谱柱（2.ImmXIOOmm，I.D.，1. 8ym);流 动相A-0. 1 %甲酸水，B-含0. 1 %甲酸的乙腈，梯度洗脱：5-50%B(2-8min)，50-95 % B(8-8. 2min)，95%B(8. 2-llmin);流速0? 4mL"化-1;柱温箱和自动进样器温度分别为35， l〇°C;进样量1yL。
[0017] 质谱条件：WatersSYNAPTG2-SQ-TOF质量分析器；电喷雾离子源，正负离子模式 扫描；Q-TOF采集率0. 2s;质量扫描范围50~900Da;毛细管电压3000V;锥孔电压35V;离 子源温度l〇〇°C;去溶剂化温度450°C，流速800L?h-1;锥孔气流速50L?h一1。
[0018] 数据处理：多变量数据分析采用EZinfosoftware2. 8(Waters Corp.，Milford，USA)，数据进行偏最小二乘辨别分析（PLS-DA)，根据载荷图 (loading-plot)和S-plot来筛选差异代谢物。
[0019] (2)基于16SrRNART-PCR的肠道菌群组成表征分析
[0020] 采用InviMagStoolDNA试剂盒提取粪便样品中的基因组DNA，PCR扩增的焦磷酸 测序，主要针对细菌16SrRNA基因V3-V4区。
[0021] 3.实验结果及分析
[0022] (1)基于UPLC-MS的代谢组学分析结果
[0023] 通过对空白组和模型组血浆样品进行偏最小二乘辨别分析（PLS-DA)，在得分图 (图1A)上2组样品得到很好的区分，表明其血浆存在明显差异。根据Loading-plot(图 1B)和S-plot(图1C)寻找贡献较大的生物标志物，并鉴定了 13个化合物，结果如表1所示， 其中有9个代谢物含量发生显著性的变化。与空白组相比，模型组大鼠血浆中的色氨酸、苯 丙氨酸、丁酰肉碱、LPC16:0等含量显著性降低，而胆酸、LPC18:2含量显著性升高。同时 他们参与了体内的能量代谢、卵磷脂代谢等，与脾气虚密切相关，他们的含量变化，揭示了 相关代谢通路的异常，表明了脾气虚模型造模成功。
[0024] 表1血浆样品中生物标志物的鉴别。
【主权项】
1. 一种非药物诱导的脾气虚伴随肠道菌群紊乱动物模型的制备方法，其特征在于非 药物诱导和强迫大鼠连续负重游泳加冰水刺激，同时得到脾气虚伴随肠道菌群紊乱动物模 型。
2. 根据权利要求1所述非药物诱导的脾气虚伴随肠道菌群紊乱动物模型的制备方法， 其特征在于非药物诱导。
3. 根据权利要求1所述非药物诱导的脾气虚伴随肠道菌群紊乱动物模型的制备方法， 其特征在于模型表现出疲劳、腹泻症状。
4. 根据权利要求1所述非药物诱导的脾气虚伴随肠道菌群紊乱动物模型的制备方法， 其特征在于强迫大鼠负重游泳，负重自身体重的2-10%。
5. 根据权利要求1所述非药物诱导的脾气虚伴随肠道菌群紊乱动物模型的制备方法， 其特征在于强迫大鼠连续负重游泳加冰水刺激。
6. 根据权利要求1所述非药物诱导的脾气虚伴随肠道菌群紊乱动物模型的制备方法， 其特征在于强迫大鼠每天负重游泳1-4次。
7. 根据权利要求1所述非药物诱导的脾气虚伴随肠道菌群紊乱动物模型的制备方法， 其特征在于负重游泳每次间隔0. l-3h。
8. 根据权利要求1所述非药物诱导的脾气虚伴随肠道菌群紊乱动物模型的制备方法， 其特征在于冰水刺激为负重游泳的第10-20天水浴改为冰水浴。
9. 根据权利要求1所述非药物诱导的脾气虚伴随肠道菌群紊乱动物模型的制备方法， 其特征在于冰水浴温度为0-5 °C。
10. 根据权利要求1所述非药物诱导的脾气虚伴随肠道菌群紊乱动物模型的制备方 法，其特征在于模型的评价同时采用代谢组学分析和肠道菌群组成表征分析方法。
【专利摘要】本发明提供一种非药物诱导脾气虚伴随肠道菌群紊乱动物模型的制备方法，涉及中医及西医动物模型。所述非药物诱导脾气虚及肠道菌群紊乱动物模型的制备方法，强迫大鼠连续负重游泳7-20天后，第10-20天为冰水浴游泳，得到脾气虚伴随肠道菌群紊乱动物模型。本发明提供的脾气虚伴随肠道菌群紊乱动物模型的制备方法，经代谢组学分析和肠道菌群组成及丰度表征分析，验证了脾气虚伴随肠道菌群紊乱动物模型造模成功。
【IPC分类】A01K67-027
【公开号】CN104621048
【申请号】CN201510021828
【发明人】李松林, 周姗姗, 朱贺, 沈红
【申请人】江苏省中医药研究院
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月15日
文档序号 :
【 8304124 】
技术研发人员：李松林,周姗姗,朱贺,沈红
技术所有人：江苏省中医药研究院
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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