绿豆抗豆象基因VrPGIP、其功能性分子标记及应用
【专利摘要】本发明提供绿豆抗豆象基因VrPGIP、其功能性分子标记及应用。本发明采用染色体步移、生物信息学分析和候选基因克隆测序的方法，分离到绿豆抗豆象基因VrPGIP，该基因位于绿豆第5号染色体SSR标记Vr05?5561和Vr05?5625之间，物理距离分别为36kb和27kb。本发明首次鉴定了绿豆抗豆象基因VrPGIP，并成功开发出基因VrPGIP的功能性分子标记，对绿豆抗豆象育种工作具有重要意义，通过育种手段可有效控制绿豆豆象的发生，减轻该虫害造成的经济损失，并为绿豆资源抗豆象的分子育种提供新的基因资源。
【专利说明】
绿豆抗豆象基因 VrPG IP、其功能性分子标记及应用
技术领域
[0001]本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及绿豆抗豆象基因 VrPGIP、 其功能性分子标记及应用。
【背景技术】
[0002] 绿豆(Vigna radiata(Linn. )Wilczek.)，属于豆科，在中国已有两千年的栽培史。 是我国重要的粮食作物。因其具有重要的营养价值和医用价值，现已作为重要的功能型食 品进行开发。近年来，随着种植业结构的调整和人们膳食结构的改变，人们对绿豆的需求量 日益增加，种植面积逐年扩大。研究表明病虫害严重影响绿豆种子萌发和产量等方面。鉴于 此，深入研究抗虫绿豆品种中参与抗虫的基因及抗虫机理，对筛选抗虫能力较强的优势品 种及抗虫育种材料的筛选具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供绿豆抗豆象基因 VrPGIP。
[0004] 本发明的另一目的是提供绿豆抗豆象基因 VrPGIP的功能性分子标记及应用。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明采用染色体步移、生物信息学分析和候选基因克隆 测序的方法，分离到绿豆抗豆象基因 VrPGIP，基因 VrPGIP的序列为：
[0006] i)SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列；或
[0007] ii)SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且 表达相同功能蛋白质的核昔酸序列;或
[0008] iii)在严格条件下与SEQ ID NO: 1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸 序列，所述严格条件为在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下杂交，并用该溶液洗膜;或
[0009] iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表达相同功能蛋白质的 核苷酸序列。
[0010] 本发明还提供含有所述绿豆抗豆象基因 VrPGIP的载体、工程菌或转基因细胞系。
[0011] 本发明还提供所述绿豆抗豆象基因 VrPGIP在绿豆资源抗豆象的分子育种中的应 用。
[0012] 本发明还提供所述绿豆抗豆象基因 VrPGIP在制备转基因植物中的应用。例如，采 用农杆菌介导的方法，将含有所述绿豆抗豆象基因的载体转入植物组织中，筛选转基因植 株。
[0013] 绿豆抗豆象野生种TC1966及感豆象品种中绿1号的表型比较见图1。为了明确绿豆 抗豆象野生种TC1966和ACC41，抗豆象品种V1128、V2802、中绿3号、中绿6号、中绿7号和苏绿 2号的抗豆象基因 VrPGIP，本发明对抗豆象候选基因 VrPGIP的核苷酸序列进行测序。基因 VrPGIP序列分析结果显示，与感豆象品种中绿1号、中绿5号、中绿10号、中绿12号、冀绿7号 相比，抗豆象野生种TC1966和ACC41，抗豆象品种V1128、V2802、中绿3号、中绿6号、中绿7号 和苏绿2号在第573、958、969、972、995、1003和1008位核苷酸存在碱基替换，其中第958、995 和1003位核苷酸碱基替换导致翻译过程中移码突变并造成VrPGIP蛋白第320位(丙氨酸到 丝氨酸）、第332位(亮氨酸到脯氨酸)和第335位(苏氨酸到脯氨酸)氨基酸的改变，从而引起 PGIP蛋白功能的变化。
[0014] 为此，本发明进一步提供绿豆抗豆象基因 VrPGIP的功能性分子标记，所述功能性 分子标记包括6个SNP位点，其中有3个影响氨基酸变化的主要SNP位点，分别位于绿豆抗豆 象基因 VrPGIP序列的第958、995和1003位碱基，上述三个位点的碱基分别为G、T和A的绿豆 为感豆象品种，上述三个位点的碱基分别为T、C和C的绿豆为抗豆象品种；所述功能性分子 标记的序列如SEQ ID N0:6所示。
[0015] 本发明还提供用于检测所述功能性分子标记的引物，包括上游引物F5'-ACAGGGTGGGGAATTGCATA-3 ' 和下游引物R5 ' -GAGGGCGGAAGTAGAGAGAC-3 '。
[0016] 本发明还提供含有所述引物的用于鉴定绿豆抗豆象品种的PCR检测试剂盒。
[0017] 本发明还提供所述功能性分子标记在鉴定绿豆抗豆象品种中的应用。
[0018] 所述应用包括以下步骤：
[0019] 1)提取待测绿豆的DNA;
[0020] 2)以DNA作为模板，利用扩增所述功能性分子标记的引物，通过PCR反应扩增出绿 豆抗豆象基因 VrPGIP大小为169bp的DNA片段；
[0021] 3)检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中第35、72和80位碱基分别为T、C和C，则 待测绿豆为抗豆象品种。
[0022] 优选地，步骤2)中使用的引物为上述引物F和R。
[0023] PCR反应体系：40ng DNA，lXTaq酶缓冲液，lmmol L-MNTPs，正、反向引物各0.25μ mol L-1和IU Taq DNA聚合酶，ddH20补至10μ1;其中，IXTaq酶缓冲液的组成如下：IOmmol L-1Tris-HCLpHS-S 5IOmmol !/1KCMOmmol IZ1(NH4)2SO4; 1.5mmol !/1MgCl2A-I^Triton X-IOO0
[0024] 反应程序：95°C 预变性 5min;95°C 变性 3〇8,55°(：退火458,72°(：延伸458,32~35个 循环;最后72°C延伸5min。
[0025] 本发明还提供所述功能性分子标记在绿豆分子标记辅助育种中的应用。
[0026]本发明首次鉴定了绿豆抗豆象基因 VrPGIP，并成功开发出基因 VrPGIP的功能性分 子标记，对绿豆抗豆象育种工作具有重要意义，通过育种手段可有效控制绿豆豆象的发生， 减轻该虫害造成的经济损失，并为绿豆抗豆象的分子育种提供新的基因资源。
【附图说明】
[0027] 图1为本发明绿豆抗豆象野生种TC1966及感豆象品种中绿1号的表型比较。
[0028]图2为本发明实施例2中基因 VrPGIP在绿豆第5号染色体上的初步定位结果。
[0029]图3为本发明实施例3中绿豆主要抗豆象品种及感豆象品种基因 PGIP主要差异位 点的DNA序列比对结果;其中，中绿3号、中绿6号、中绿7号、苏绿2号、V2802、V1128为抗豆象 绿豆品种，TC1966和ACC41为抗豆象绿豆野生种，中绿1号，中绿5号，中绿10号，中绿12号，冀 绿7号为感豆象绿豆品种。
【具体实施方式】
[0030]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning:a Laboratory Manual ,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。 [0031] 实施例1TC1966/中绿1号Fl和F2群体构建及表型鉴定
[0032] 以抗豆象绿豆品种TC1966为父本，以感豆象绿豆品种中绿1号为母本，配制杂种， 构建了包含1350个单株的TC1966/中绿1号分离群体，每个F2单株通过自交获得相应的 TC1966/中绿1号F2:3家系，进行抗豆象鉴定。具体方法如下：
[0033] 每份材料随机选取30粒健康种子，包括2份感豆象中绿1号、抗豆象TC1966对照，置 于抗豆象鉴定室塑料箱内，温度保持在25°C-29°C之间，湿度控制在70%-80 %之间。每个塑 料箱内放入400-500头刚羽化1-3天的绿豆象成虫，让其随机产卵，当每粒种子落卵量在5个 以上时，除去成虫。40-45天后调查抗虫种子粒数及抗虫率，参照程须珍等（2001)的方法对 每个单株进行抗性评价。达到中抗以上材料进行重复鉴定，设3次重复。抗豆象鉴定分级标 准见表1。
[0034] 表1绿豆抗豆象特性分级标准
[0036] 抗豆象鉴定结果显示，TC1966、中绿1号以及TC1966/中绿1号杂交获得的Fl种子全 抗，表明TC1966抗豆象特性由显性基因控制。根据对豆象的抗虫级别将F2: 3家系分为抗豆 象、抗感分离和感豆象三种表现型，而相应的F2单株的基因型则分别为记为RR(纯合抗虫）、 Rr (杂合抗虫)和rr (纯合感虫)三种。F2群体对豆象的抗感分离符合1:2:1的比例，说明抗豆 象基因由一对显性核基因控制。
[0037] 实施例2绿豆抗豆象基因 VrPGIP的获得
[0038]利用抗豆象亲本TC1966与感豆象亲本中绿1号杂交的F2分离群体和抗、感池筛选 出多态性SSR标记。将该抗豆象基因初步定位于绿豆第5号染色体SSR标记Vr05-5561和 Vr05-5625之间，
[0039] 物理距离分别为36kb和27kb，所述物理位置参考已测序绿豆种VC1973A即中绿1号 (图2)，通过测序发现此区间仅包括一个基因（基因 PGIP)编码多聚半乳糖醛酸酶，基因 PGIP 的DNA序列如SEQ ID NO: 1所示，在抗、感虫材料中存在碱基变异，并引起其编码蛋白的氨基 酸序列变化，从而为绿豆资源抗豆象的分子育种提供新的基因资源。
[0040]实施例3抗豆象资源和品种中抗豆象基因的鉴定 [00411提取待测绿豆的DNA，以DNA为模板进行PCR扩增。
[0042] 根据基因 VrPGIP序列设计引物，上游引物：5' -ATGCGAAGCCTGTTAATG-3';下游引 物：5' -CTACTTGGTGCAGGGCAGAA-3'。以DNA为模板，进行PCR反应。10μ1 PCR反应体系包括： 40ng DNA，lXTaq酶缓冲液（IOmM Tris-HCl，pH8.8;10mM KCl;10mM(NH4)2S〇4;1.5mM MgCl2;0.1%Triton X-100)，lmM dNTPs，上、下游引物各0·25μΜ和IU Taq DNA聚合酶，CldH2O 补至1(^1。反应程序:95°(：预变性51^11;95°(：变性3〇8,55°(：退火458,72°(：延伸458,32~35个 循环;最后72°C延伸5min。整个反应在东胜EDC-810PCR扩增仪上进行。用3%的琼脂糖凝胶 电泳分离扩增产物。
[0043]将纯化后的PCR产物克隆到pEASY-Tl载体(购自北京全式金生物技术有限公司）， 进行测序。测序结果表明，来自绿豆抗豆象野生种TC1966和ACC41，抗豆象品种V1128、 V2802、中绿3号、中绿6号、中绿7号及苏绿2号的绿豆抗豆象基因 VrPGIP(R)序列如SEQ ID N0:2所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。而感豆象绿豆品种中绿1号、中绿 5号、中绿10号、中绿12号及冀绿7号中基因 VrPGIP(S)序列如SEQ ID N0:4所示，其编码蛋白 的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0044] 与感豆象品种中绿1号、中绿5号、中绿10号、中绿12号及冀绿7号序列相比，抗豆象 野生种TC1966和ACC41，抗豆象品种V1128、V2802、中绿3号、中绿6号、中绿7号及苏绿2号在 VrPGIP序列的第573、958、969、972、995、1003和1008位核苷酸存在碱基替换，其中第958、 995和1003位核苷酸碱基替换导致翻译过程中移码突变并造成VrPGIP蛋白第320位(丙氨酸 到丝氨酸）、第332位(亮氨酸到脯氨酸)和第335位(苏氨酸到脯氨酸)氨基酸的改变，从而引 起PGIP蛋白功能的变化。抗?象资源和品种及感?象品种基因 VrPGIP的序列比对结果见图 3〇
[0045] 实施例4绿豆抗豆象基因 VrPGIP的功能性分子标记及应用
[0046] 为此，进一步开发绿豆抗豆象基因 VrPGIP的功能性分子标记，所述功能性分子标 记包括6个SNP位点，其中有3个影响氨基酸变化的主要SNP位点，分别位于绿豆抗豆象基因 VrPGIP序列的第958、995和1003位碱基，上述三个位点的碱基分别为G、T和A的绿豆为感豆 象品种，上述三个位点的碱基分别为T、C和C的绿豆为抗豆象品种。所述功能性分子标记的 序列如SEQ ID NO:6所示。
[0047] 根据所述功能性分子标记的序列，设计一对用于检测所述功能性分子标记的引 物:包括正向引物F5 ' -ACAGGGTGGGGAATTGCATA-3 ' 和反向引物R5 ' -GAGGGCGGAAGTAGAGAGAC-3，。
[0048] 利用上述功能性分子标记鉴定绿豆抗豆象品种，包括以下步骤：
[0049] 1、提取待测绿豆的DNA。
[0050] 2、以DNA作为模板，利用扩增所述功能性分子标记的引物F和R，通过PCR反应扩增 出绿豆抗豆象基因 VrPGIP大小为169bp的DNA片段。
[00511 3、检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中第35、72和80位碱基分别为T、C和C，则 待测绿豆为抗豆象品种。
[0052]其中，PCR反应体系和反应程序同实施例3所述。
[0053] 利用上述功能分子标记可以快速准确地鉴定抗豆象绿豆品种中绿3号、中绿6号、 中绿7号、苏绿2号、V2802和￥1128，抗豆象野生种1'(：1966和40：41，以及感豆象绿豆品种中绿 1号、中绿5号、中绿10号、中绿12号和冀绿7号（图3)。
[0054]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0055] 参考文献
[0056] I.Ishimoto M,Kaga A ,Sugawara F,Kitamura K. Novel cyclopeptide alkaloids are responsible for the bruchid resistance of a wild accession of mungbean,Vigna radiata var sublobata.Plant Physiology,1997,114(3):221-226
[0057] 2.Reis C MjCalvet M MjSales M P,et al.alpha-amylase inhibitors of legume seeds and their involvement in the resistance to Bruchid beetles.Arq Biol Tecnol，1997,40(2):413-418
[0058] 3.Goossens AjQuintero CjDillen ff,et al.Analysis of bruchid resistance in the wild common bean accession G02771: no evidence for insecticidal activity of arcelin 5.Journal of Experimental Botany，2000，51(348):1229-1236
[0059] 4.Chen K CjLin C YjKuan C C,et al.A novel defensin encoded by a mungbean cDNA exhibits insecticidal activity against bruchid. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2002,50(25):7258-7263
[0060] 5.Lin C, Chen C S,Horng S B. Characterization of resistance to Callosobruchus maculatus(Coleoptera:Bruchidae)in mungbean variety VC6089A and its resistance-associated protein VrDl.J Econ Entomol,2005,98(4):1369-1373
[0061] 6.Shiau YSjHorng SBjChen CSjHuang PTjLin CjHsueh YC,et al. Structural analysis of the unique insecticidal activity of novel mungbean defensin VrDl reveals possibility of homoplasy evolution between plant defensins and scorpion neurotoxins.Journal of Molecular Recognition，2006,19(5):441-450
[0062] 7.程须珍，王素华，金达生，杨又迪，吴绍宇，周吉红.绿豆抗豆象遗传的初步研究. 植物遗传资源科学.2001,2(4) :12-15^
【主权项】
1. 绿豆抗豆象基因 VrPGIP，其特征在于，基因 VrPGIP的序列为： i) SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列；或 ii) SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达 相同功能蛋白质的核昔酸序列;或 iii) 在严格条件下与SEQ ID NO: 1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序 列，所述严格条件为在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下 杂交，并用该溶液洗膜;或 iv) 与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷 酸序列。2. 含有权利要求1所述基因 VrPGIP的载体或工程菌。3. 权利要求1所述基因 VrPGIP在绿豆资源抗豆象分子育种中的应用。4. 绿豆抗豆象基因 VrPGIP的功能性分子标记，其特征在于，所述功能性分子标记包括6 个SNP位点，其中有3个SNP位点引起氨基酸变化，分别位于绿豆抗豆象基因 VrPGIP序列的第 958、995和1003位碱基，上述三个位点的碱基分别为G、T和A的绿豆为感豆象品种，上述三个 位点的喊基分别为T、C和C的绿?为抗?象品种； 所述功能性分子标记的序列如SEQ ID NO:6所示。5. 用于检测权利要求4所述功能性分子标记的引物，其特征在于，包括正向引物F5 ' -ACAGGGTGGGGAATTGCATA-3 ' 和反向引物R5 ' -GAGGGCGGAAGTAGAGAGAC-3 '。6. 含有权利要求5所述引物的用于鉴定绿豆抗豆象品种的PCR检测试剂盒。7. 权利要求4所述功能性分子标记在鉴定绿豆抗豆象品种中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤： 1) 提取待测绿豆的DNA; 2) 以DNA作为模板，利用扩增所述功能性分子标记的引物，通过PCR反应扩增出绿豆抗 豆象基因 VrPGIP大小为169bp的DNA片段； 3) 检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中第35、72和80位碱基分别为T、C和C，则待测 绿?为抗?象品种； 其中，步骤2)中使用的引物，其序列同权利要求5所述。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于， PCR反应体系：40ng DNA，1 X Taq酶缓冲液，lmmol L-MNTPs，正、反向引物各0.25μπιο 1 L-1和1U Taq DNA聚合酶，ddH20补至10μ1;其中，lXTaq酶缓冲液的组成如下：10mmol L一 ^Tris-HCLpHS.SdOmmol L-kCMOmmol L-L-^gChA.l^Triton X-100； 反应程序：95°(：预变性511^11;95°(：变性3〇8,55°(：退火458,72°(：延伸458,32~35个循环 ； 最后72°C延伸5min。10. 权利要求4所述功能性分子标记在绿豆分子标记辅助育种中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK105861516SQ201610224823
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月12日
【发明人】陈红霖, 程须珍, 王丽侠, 王素华
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所
文档序号 :
【 10505926 】
技术研发人员：陈红霖,程须珍,王丽侠,王素华
技术所有人：中国农业科学院作物科学研究所
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：陈红霖,程须珍,王丽侠,王素华
技术所有人：中国农业科学院作物科学研究所
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除