一种与胃癌相关的血清/血浆lncRNA标志物试剂盒的制作方法
[0060] 进一步分析运巧巾IncRNA的组合用于胃癌诊断的效果，发现其组合对胃癌发病诊 断的AUC[Area under the R0C curve,R0C曲线（Receiver Operating 畑aracteristic curve,受试者工作特征曲线）下面积]与单个IncRNA相比增加。如图2(A)所示为胃癌患者 MALAT1的AUC曲线，曲线下面积为0.849;图2 (B)为胃癌患者册TAIR的AUC曲线，曲线下面积 为0.752;图2(C)为胃癌患者MALAT1和册TAIR联合AUC曲线，曲线下面积为0.869。由图可知， 两种IncRNAs的结合检测将显著提高早期胃癌检出率。
[0061] 根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于胃癌诊断的试剂盒，包含测定受 试者血清/血浆中稳定存在且可检测的成熟MLAT1和册TAIR的引物和其他检测试剂。
[0062] 具体而言，运两种IncRNAs,或者运两种IncRNAs的引物组合构成的相关诊断试剂 盒有助于胃癌的诊断，为临床医生快速准确掌握患者疾病状态和病情严重程度，及时采取 更具个体化的防治方案提供支持，从而最大限度提高胃癌患者的生存率。
[0063] 实施例1样品的收集和样品资料的整理
[0064] 病例为2010年6月至2014年12月在江苏省人民医院及靖江市人民医院收集的新发 胃癌病例，均经病理组织学确诊。对照为同期进行社区疾病筛查的健康个体，按性别和年龄 与病例进行频数匹配。用于研究的样本为同期收取，采样、分装、保存条件均一，通过对样品 资料的整理，发明人从中选择了 6例符合下列标准的样本作为IncRNA忍片检测和后续一系 列qRT-PC閲金证的实验样品：
[006引1.新发胃癌病例
[0066] 2.采血前未经过手术和放化疗，无手术前放化疗
[0067] 3.与病例年龄、性别匹配的健康人对照
[0068] 并系统采集了运些样本的人口学资料、临床资料等情况。
[0069] 实施例2血清/血浆中IncRNA的IncRNA忍片检测
[0070] 将3例胃癌患者和3例健康人对照经IncRNA忍片检测获得相关结果。具体步骤为：
[0071] 1、分别取"胃癌病例"组和"健康人对照"组患者的血清1ml，加入等体积的化izol 试剂1ml，冰上放置5min;
[0072] 2、加入氯仿 1ml/管，用力振摇 15s<a5-30°C下解育2-3min，离屯、（4°C，12,000g， 15min)。离屯、后液体分为Ξ层(上层-无色水样层为RNA，中层白色为DNA和底层红色为蛋白 质），小屯、吸取上层无色液体移入一新的EP管中。
[0073] 3、加入等体积异丙醇，0.4-0.5ml，混匀，15-30°C下解育10-30min，离屯、（4°C，12， OOOg，lOmin)。去上清，沉淀加入75%乙醇1ml，縱满振荡30s，离屯、(4°C，7,500g，5min)。小屯、 去上清，管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min。加入20ul DEPC水溶解。
[0074] 4、测量浓度:一般浓度为2. Omg/lml血清。
[0075] 5、用逆转录试剂盒通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括0.8ul逆 转录引物(l〇X)，〇.化1 lOOmM dNTPs混合物，1.5ul逆转录酶(50U/ul)，0.8ul 10X逆转录 缓冲液，0.9ul 25mM氯化儀，0. lul RNA抑制剂W及0.化1无核酸酶水。加入3ul的总RNA。反 应步骤为16°C解育2分钟，42°C反应1分钟，50°C反应1秒，上述3步经40个循环反应，再85°C 解育5分钟。
[0076] 6、对待进行忍片检测的RNA进行预扩增W增加表达所需的cDNA的量。预扩增的反 应体系包括：12.加1预扩增Master Mix(2 X )，2.加1预扩增引物（10 X )，7 .加1无核酸水， 2.5ul cDNA。反应步骤为95°C 10分钟，55°C2分钟，72°C2分钟，95°C 15秒，60°C4分钟，12个循 环，99.9°C 10分钟，反应结束后加入75ul 0.1 X TE稀释。
[00八]7、取9ul稀释后的预扩增产物，加入450ul基因表达Master Mix，441ul无核酸酶 水，充分混匀后，在忍片上加入lOOul/孔，10(K)rpm离屯、1分钟，离屯、2次。该忍片实验使用的 是ABI Prism 7900巧光定量PCR仪。选择384-well Taqman Low Density Array特定程序进 行反应。
[007引 8、数据分析与处理:将Ct阔值设为0.2, Δ Ct = C啦φ-Ctgapdh，两组样品血清IncRNAs 的表达量比值可用方程Δ Δ Ct表示，A Δ Ct= A时跡广A Ct娜3。通过忍片检测发现"胃癌病 例"组和"健康人对照"组中血清表达差异的微小核糖核酸已列出。
[0079] 实施例3血清/血浆中IncRNA的qRT-PCR实验
[0080] 根据上述忍片结果，选择满足下列条件的IncRNAs用qRT-PCR方法进一步验证：
[0081] 1)忍片中两组研究对象的CT值均不大于35W提高检测效率；
[0082] 2)忍片中Δ Δ打大于2。对所选择的MLAT1、册TAIR两个IncRNAs设计qRT-PCR的引 物（见表1)。对"胃癌病例"组和"健康人对腮'组的血清单个个体进行IncRNA的qRT-PCR检 巧。。在整个研究过程中均实施严格的质控。每个样本连续检测Ξ次。所有检测均采用盲法， 即在不清楚样本背景的情况下完成W避免偏倚。用SY服染料法进行qRT-PCR检测。
[008引表1相关IncRNA引物信息
[0084]
[0085] (1)制备RNA样品：具体步骤同上述；
[0086] (2)SYBR染料法:a)通过RNA逆转录反应得到cDNA。染料法的逆转录的反应体系包 括4ul 5XAMV缓冲液，2ull0mM dNTP混合物（Takara公司），0.加 1 RNase抑制剂（Takara公 司），化lAMWhkara公司）W及1.加1 IncRNA特异性反向引物一种或几种的混合物。反应步 骤为16 °C解育15分钟，42 °C反应1小时，85 °C解育5分钟。
[0087] (3)qRT-PCR:将cDNA按1/5体积稀释，取0.加1稀释后的cDNA，加入0.15ul Taq酶 (Takara公司），0.加 1 20XEVA GREEN，0.1ull0uM正向引物一种，O.lullOuM反向引物一种， 0.6ul 25mM MgC12,0.8ul2.5mM dNTP混合物（Takara公司），lul 10XPCR缓冲液，6.7加1 双 蒸水，lOul体系进行qRT-PCR。仪器使用的是ABI Prism St巧One巧光定量PCR仪，PCR的反应 条件是:95°C，5分钟进行1个循环，95°C，15秒，60°C，1分钟进行45个循环。
[0088] (4)数据处理与分析:两组样品血清IncRNAs的表达量比值可用方程2-AGt表示，其 中Δ Ct = Ciffl^CT^#，我们在每一个样本提取时加入GAPDH的RNA作为参照，计算相对表达量。
[0089] 染料法qRT-PCR结果发现在120例样本中，有巧巾lncRNAs(MLATl和册TAIR)在两组 间的表达情况存在显著性差异。
[0090] 实施例4利用R0C曲线方法进一步分析巧巾IncRNA的组合对胃癌发病的诊断
[0091] 根据上述qRT-PCR结果，本发明人通过对2组血浆样品Γ胃癌病例组"和"健康人对 照组"）的IncRNAs表达水平的分析，W对照组MALAT1和册TAIR表达量为标准，绘制R0C曲线 来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估运两种IncRNAs对胃癌发病的判断能力。就单个 1 η C R N A而言，Μ A L A T1 W 8 4.9 %的A U C将对照组和病例组分开，最佳临界点的灵敏度为 68.3 %，特异度为85.0 % ;册TAIR W75.2 %的AUC将对照组和病例组分开，最佳临界点的灵 敏度为58.3%，特异度为81.7%。对2个标志物的联合分析发现，运巧巾IncRNAs的组合W 86.3%的AUC将健康人对照组和胃癌病例组分开，最佳临界点的灵敏度为76.7%，特异度为 86.7% (图2)。因此，本发明人证明了采用MALAT1和册TAIR的组合能够很好地将健康人对照 和胃癌患者区分。
[0092] 实施例5用于胃癌辅助诊断的IncRNA试剂盒的制作
[〇〇9引 LncRNA试剂盒的制作和操作流程是基于IncRNA忍片检测，RT-PCR和real-time PCR等技术。试剂盒包括血清/血浆IncRNA引物(包括下列引物:MALAT1的引物为SEQ No.l和 沈9齡.2;册了41如勺引物为沈9齡.3和沈9齡.4)，还可^有相应?0?反应所需的常用酶和/ 或试剂，如逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgC12，去核酸水，巧光染料，Taq酶等，可根据具体采用 的实验方法选用，运些常用酶和/或试剂是本领域技术人员熟知的。此试剂盒的价值在于只 需要血清/血浆而不需要其他组织样品，通过最精简的巧光法检测IncRNA的变化趋势，再通 过该趋势辅助诊断胃癌，不仅稳定，检测方便，且定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和 特异性，因此将此试剂盒投入实践，可W帮助指导临床准确做出诊断。
【主权项】
1. 一种与胃癌相关的血清/血浆IncRNA标志物试剂盒，其特征在于血清/血浆IncRNA标 志物为MALAT1和HOTAIR的组合。2. 根据权利要求1所述的一种与胃癌相关的血清/血浆IncRNA标志物试剂盒，其特征在 于该引物为MALAT1和HOTAIR的引物，其中MALAT1的上下游引物序列是SEQ No . 1和SEQ No.2;H0TAIR的上下游引物序列是SEQ No.3和SEQ No.4。3. 根据权利要求1所述的一种与胃癌相关的血清/血浆IncRNA标志物试剂盒，其特征在 于该试剂盒用于检测血清/血浆中MALAT1和HOTAIR。4. 根据权利要求1所述的一种与胃癌相关的血清/血浆IncRNA标志物试剂盒，其特征在 于该试剂盒还包括PGR反应常用的酶和试剂。
【专利摘要】本发明涉及一种与胃癌相关的血清/血浆lncRNA标志物试剂盒。本发明血清/血浆lncRNA标志物为MALAT1和HOTAIR的组合，所述该引物为MALAT1和HOTAIR的引物，其中MALAT1的上下游引物序列是SEQ？No.1和SEQ？No.2；HOTAIR的上下游引物序列是SEQ？No.3和SEQ？No.4。本发明克服了仅采用一种血清/血浆lncRNA作为肿瘤标志物试剂盒敏感度和特异度均较低，从而导致早期胃癌诊断的错诊率和漏诊率大大增加的缺陷。本发明提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类lncRNA生物标志物的成功开发有助于胃癌的辅助诊断，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴，采用lncRNA芯片检测以获取疾病特异和异常表达的血清/血浆lncRNAs表达谱，并应用qRT-PCR的方法进行单个验证，采用了染料法进行验证。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105586399
【申请号】CN201510569987
【发明人】张国新, 周晓颖
【申请人】张国新, 周晓颖
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2015年9月7日
文档序号 :
【 9823106 】
技术研发人员：张国新,周晓颖
技术所有人：张国新,周晓颖
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：张国新,周晓颖
技术所有人：张国新,周晓颖
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除