脂肪酶变体以及编码其的多核苷酸的制作方法

2024-11-28 44次浏览

脂肪酶变体以及编码其的多核苷酸的制作方法
【专利摘要】本发明涉及分离的脂肪酶变体，这些脂肪酶变体在对应于SEQ?ID?NO：2的成熟多肽的位置I86D,E,N,Q、E87C、I90D,E,Q、以及N92D,E,Q的一个或多个位置处包括取代，其中该变体具有脂肪酶活性。在一些实施例中，本发明涉及对这些变体进行编码的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；产生这些变体的方法；以及包含这些变体的组合物。本发明还涉及获得脂肪酶变体的方法；清洁的方法；以及脂肪酶变体用于清洁的用途。
【专利说明】脂肪酶变体以及编码其的多核苷酸
[0001] 序列表的引用
[0002] 本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
[0003] 发明背景发明领域
[0004] 本发明涉及脂肪酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法以及使用这些变体的方法。
[0005] 相关技术说明
[0006] 脂肪酶被包括在洗涤剂组合物中以提高洗涤性能并且特别用以改进脂质污物去除。除其他之外，助洗剂也被包括在洗涤剂组合物中，其目的是用于降低钙浓度，这是由于钙沉积可以导致被处理表面的"泛灰"。低水平的钙可以显示导致脂肪酶活性的降低。
[0007] 在许多脂肪酶中的催化位点被盖结构域（盖区域或盖）掩盖，并且研究已经指示该盖对于脂肪酶活性是重要的并且具有激活脂肪酶的作用。在水/脂质界面的存在下增强的催化活性称为"界面激活"，并且描述了两亲表面环即盖与界面接触时打开时的情形。舒 (Shu)等人在《酶与微生物技术》48(2011) 129-133中生成了四个黑曲霉脂肪酶（ANL)突变体，其中一个没有盖并且三个具有处于打开构象的盖，目的是鉴定不依赖于界面激活的脂肪酶突变体。
[0008] 因此，对于具有改进的脂肪酶活性的、特别是用于洗涤剂组合物的脂肪酶存在需要。
[0009] 发明概述
[0010] 诸位发明人已经出人意料地发现在亲本脂肪酶的盖区域中的突变导致如在此所述的具有改变的激活的脂肪酶变体，更确切地说，在本发明的一些实施例中，与亲本脂肪酶相比，这些变体在低浓度的钙的情况下具有改进的比活性，并且在本发明的一些实施例中，与亲本脂肪酶相比，这些变体具有改进的洗涤性能。
[0011] 本发明涉及分离的脂肪酶变体，这些变体包括在对应于SEQ ID N0 :2的成熟多肽的位置86、87、90、和/或92的一个或多个位置处的取代，尤其是被取代为D、E、Q、N、或C，并且确切地是取代I86D，E，N，Q、E87C、I90D，E，Q、以及N92D，E，Q，其中该变体具有脂肪酶活性。
[0012] 本发明还涉及对这些变体进行编码的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；用于产生这些变体的方法；以及包含这些变体的组合物。
[0013] 本发明还涉及获得脂肪酶变体的方法；清洁的方法；以及脂肪酶变体用于清洁的用途。
[0014] 定义
[0015] 脂肪酶：术语"脂肪酶"或"脂解酶"或"脂质酯酶"是如酶命名法所定义的EC3. 1，1 类中的一种酶。它可以具有脂肪酶活性（三酰基甘油脂肪酶，EC3. 1. 1.3)、角质酶活性 (EC3. 1. 1. 74)、固醇酯酶活性（EC3. 1. 1. 13)和/或蜡酯水解酶活性（EC3. 1. 1. 50)。出于本发明的目的，根据实例中所述的程序确定脂肪酶活性。在一个方面，本发明的变体具有SEQ ID NO :2或3的成熟多肽的脂肪酶活性的至少20%、例如至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少100%。
[0016] 等位基因变体：术语"等位基因变体"意指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是静默的（在所编码的多肽中没有改变）或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
[0017] cDNA :术语"cDNA"意指一种DNA分子，该分子可以通过由获自一种真核或原核细胞的一种成熟剪接的mRNA分子反转录而制备。cDNA缺乏可以存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
[0018] 编码序列：术语"编码序列"意指一种多核苷酸，该多核苷酸直接规定了一种变体的氨基酸序列。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子（如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子（如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
[0019] 控制序列：术语"控制序列"意指为编码本发明的一种变体的一种多核苷酸的表达所需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生（native)的 (即，来自相同基因）或外源的（即，来自不同基因），或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
[0020] 表达：术语"表达"包括涉及一种变体的产生的任何步骤，包括（但不限于）转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。
[0021] 表达载体：术语"表达载体"意指一种直链或环状DNA分子，该分子包括编码一种变体的一种多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
[0022] 片段：术语"片段"意指在一种成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在一个或多个（例如若干个）氨基酸的一种多肽；其中该片段具有脂肪酶活性。在一个方面，一个片段含有成熟多肽的氨基酸数目的至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%、以及至少95%。
[0023] 高严谨度条件：术语"高严谨度条件"是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准 DNA 印迹（Southern blotting)程序，在 42°C下在 5X SSPE、0·3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0. 2% SDS，在65°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0024] 宿主细胞：术语"宿主细胞"意指易于用包括本发明的一种多核苷酸的一种核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语"宿主细胞"涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
[0025] 改进的特性：术语"改进的特性"意指与一种变体相关的相对于亲本有所改进的特征。此类改进的特性包括但不限于：改进的催化速率；改进的比活性；改进的底物裂解；改进的盖打开；降低的钙离子依赖性；改进的助洗剂耐受性，和/或改进的洗涤性能。
[0026] 分离的：术语"分离的"意指在自然界中不存在的一种形式或环境中的一种物质。分离的物质的非限制性实例包括（1)任何非天然存在的物质；（2)至少部分地从与其在自然界中相关联的一种或多种或全部天然存在的组分中除去的任何物质，包括但不局限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；（3)相对于自然界中发现的那种物质通过人工手动修饰的任何物质；或者（4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质（例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用）。一种分离的物质可以存在于发酵液样品中。
[0027] 低严谨度条件：术语"低严谨度条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针来说，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、 0. 2% SDS，在50°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0028] 成熟多肽：术语"成熟多肽"意指在翻译和任何翻译后修饰（例如N-端加工、C-端截短、糖基化、磷酸化等）之后处于其最终形式的多肽。在一方面，成熟多肽是SEQ ID N0: 2的氨基酸1至269。在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO :3的氨基酸1至269。
[0029] 成熟多肽编码序列：术语"成熟多肽编码序列"意指编码具有脂肪酶活性的一种成熟多肽的一种多核苷酸。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID N0 :1的核苷酸67至 873。
[0030] 中严谨度条件：术语"中严谨度条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑精 DNA和35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0. 2% SDS，在55 °C下洗涤三次，每次15分钟。
[0031] 中-高严谨度条件：术语"中-高严谨度条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针来说，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及或者35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0. 2% SDS，在60°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0032] 突变体：术语"突变体"意指编码一种变体的多核苷酸。
[0033] 核酸构建体：术语"核酸构建体"意指单链或双链核酸分子，其分离自天然存在的基因，或其被修饰成以本来在自然界中不存在的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其包含一个或多个控制序列。
[0034] 可操作地连接：术语"可操作地连接"意指一种配置，其中一个控制序列相对于一种多核苷酸的编码序列放置在一个适当位置处，以使得控制序列指引编码序列的表达。
[0035] 亲本或亲本脂肪酶：术语"亲本"或"亲本脂肪酶"意指一种脂肪酶，对该脂肪酶进行一个改变以产生本发明的酶变体。亲本可以是天然存在的（野生型）多肽或其变体或片段。
[0036] 序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数"序列一致性"描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :欧洲分子生物学开放软件套件（The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯（Rice)等人，2000，《遗传学趋势》（Trends Genet.) 16:276-277)(优选5. 0. 0版或更新版本）的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（尼德尔曼和翁施，1970,《分子生物学杂志》(J. Mol. Biol. )48:443-453)来测定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0. 5,以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一致性"的输出（使用-非简化选项获得）被用作百分比一致性，并且如下计算：
[0037] (-致的残基X 100V (比对长度-比对中的空位总数）
[0038] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000,同上）（优选5. 0. 0版或更新版本）的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法（尼德尔曼和翁施，1970,同上）来测定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分〇. 5以及EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的 EMBOSS版本）取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一致性"的输出（使用-非简化选项获得）被用作百分比一致性，并且如下计算：
[0039] (一致的脱氧核糖核苷酸X 100V (比对长度-比对中的空位总数）
[0040] 子序列：术语"子序列"意指使一个或多个（例如，若干个）核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺少的多核苷酸；其中该子序列编码具有脂肪酶活性的一个片段。在一个方面，一个子序列含有成熟多肽编码序列的核苷酸的数目的至少50%、至少 55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、以及至少 95%。
[0041] 变体：术语"变体"意指具有脂肪酶活性的、在一个或多个（例如，若干个）位置处包含改变（即取代、插入和/或缺失）的一个多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸被一个不同的氨基酸替代；缺失意指占据一个位置的氨基酸的去除；并且插入意指邻近于并且紧跟着占据一个位置的氨基酸之后添加一个或多个（例如，若干个）氨基酸。本发明的这些变体具有SEQ ID N0 :2或3的成熟多肽的至少20%、例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少100%的脂肪酶活性。
[0042] 非常高严谨度条件：术语"非常高严谨度条件"是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0. 2% SDS，在70°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0043] 非常低严谨度条件：术语"非常低严谨度条件"是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0. 2% SDS，在45°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0044] 野生型脂肪酶：术语"野生型"脂肪酶意指由见于自然界中的一种天然存在的微生物（如一种细菌、酵母或丝状真菌）表达的一种脂肪酶。
[0045] 变体命名惯例
[0046] 出于本发明的目的，将SEQ ID N0:2中披露的成熟多肽用以确定另一种脂肪酶中的对应的氨基酸残基。将另一种脂肪酶的氨基酸序列与SEQ ID N0:2中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用尼德曼-翁施算法（尼德曼和翁施，1970,《分子生物学杂志》48:443-453)来确定与SEQ ID N0:2中披露的成熟多肽的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号，该算法如EMBOSS软件包（EMBOSS :欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人， 2000,《遗传学趋势》16:276-277)(优选5. 0.0版或更新版本）的尼德尔程序所实施的。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0. 5,以及EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS 版本）取代矩阵。
[0047] 另一种脂肪酶中的相对应的氨基酸残基的鉴别可以通过多个多肽序列使用若干种计算机程序使用其对应的缺省参数的一个比对来测定，这些计算机程序包括（但不限于）MUSCLE (通过对数-期望的多序列比较；3. 5版或更新版；埃德加（Edgar)，2004,《核酸研究》（Nucleic Acids Research) 32:1792-1797)、MAFFT (6. 857 版或更新版；加藤（Katoh) 和库马（Kuma)，2002,《核酸研究》30:3059-3066 ;加藤等人，2005,《核酸研究》33:511-518 ; 加藤和都（Toh)，2007,《生物信息学》（Bioinformatics) 23:372-374 ;加藤等人，2009,《分子生物学方法》（Methods in Molecular Biology)537:_39-64;加藤和都，2010,《生物信息学》26:_1899-1900)以及使用 ClustalW 的 EMBOSS ΕΜΜΑ(1· 83 或更新；汤普森（Thompson) 等人，1994,《核酸研究》22:4673-4680)。
[0048] 当其他酶与SEQ ID N0 :2的成熟多肽已经相分歧使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时（Lindahl (林达尔）和Elofsson (埃洛弗松），2000,《分子生物学杂志》）295 :613-615)，可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示（特征曲线）来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物（阿特休尔（Atschul)等人，1997,《核酸研究》25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序如 GenTHREADER(琼斯（Jones)，1999,《分子生物学杂志》287:797-815 ;麦古芬（McGuffin)和琼斯，2003,《生物信息学》19:874-881)利用来自不同来源（PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势）的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫（Gough)等人，2000,《分子生物学杂志》313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SC0P数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定这类模型的准确度。
[0049] 对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SC0P超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵（奥尔姆（Holm)和桑德（Sander)，1998,蛋白质 (Proteins) 33:88-96)或者组合延伸（Shindyalov和伯恩（Bourne) ,1998,《蛋白质工程》 11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物（例如，奥尔姆和帕克（Park)， 2000,《生物信息学》16:566-567)。
[0050] 在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。使用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
[0051] 取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法:原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为"Thr226Ala"或者"T226A"。多个突变由加号 (" + "）分开，例如"Gly205Arg+Ser411Phe"或"G205R+S411F"代表分别在位置205和位置 411处甘氨酸（G)被精氨酸（R)取代，并且丝氨酸（S)被苯丙氨酸（F)取代。
[0052] 缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，在位置195 处的甘氨酸缺失表示为"Glyl95*"或者"G195*"。多重缺失通过加号（" + "）分开，例如， "Glyl95*+Ser411*" 或 "G195*+S411*"。
[0053] 插入。对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为"Glyl95GlyLys"或者 "G195GK"。多重氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2 ;等]。例如，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为 "Glyl95GlyLysAla" 或 "G195GKA"。
[0054] 在这类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：
[0055]
【权利要求】
1. 一种脂肪酶变体，该脂肪酶变体在对应于SEQ ID NO :2的成熟多肽的位置 I86D，E，N，Q、E87C、I90D，E，Q、以及N92D，E，Q的盖螺旋中的一个或多个位置处包括取代，其中该变体具有脂肪酶活性。
2. 如权利要求1所述的变体，该变体是一种选自下组的亲本脂肪酶的变体，该组由以下各项组成： a. 与SEQ ID NO :2或3的成熟多肽具有至少60%的序列一致性的一种多肽； b. -种由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严谨度条件下与（i)SEQ ID NO :1的成熟多肽编码序列，或（ii) (i)的全长互补体杂交； c. 一种由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO :1的成熟多肽编码序列具有至少60 %的一致性；以及 d. SEQ ID NO :2或3的成熟多肽的一个片段，该片段具有脂肪酶活性。
3. 如权利要求1-2中任一项所述的变体，该变体与SEQ ID NO :2或3的成熟多肽具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%、但小于100%的序列一致性。
4. 如权利要求1-3中任一项所述的变体，其中改变的数目是1-20个，例如1-10个和 1-5个，如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、 15个、16个、17个、18个、19个、19个或20个改变。
5. 如权利要求1-4中任一项所述的变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO :2的成熟多肽的位置86的位置处的取代。
6. 如权利要求5所述的变体，其中该取代是用Asn、Asp、Gin、或Glu的取代。
7. 如权利要求1-4中任一项所述的变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO :2的成熟多肽的位置87的位置处的取代。
8. 如权利要求7所述的变体，其中该取代是用Cys的取代。
9. 如权利要求1-4中任一项所述的变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO :2的成熟多肽的位置90的位置处的取代。
10. 如权利要求9所述的变体，其中该取代是用Asp、Gin、或Glu的取代。
11. 如权利要求1-4中任一项所述的变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO :2的成熟多肽的位置92的位置处的取代。
12. 如权利要求11所述的变体，其中该取代是用Asp、Gin、或Glu的取代。
13. 如权利要求1-12中任一项所述的变体，该变体包括在两个位置处的取代，这两个位置对应于SEQ ID NO :2的成熟多肽的位置I86D，E，N，Q、E87C、I90D，E，Q、以及N92D，E，Q 中的任何。
14. 如权利要求1-12中任一项所述的变体，该变体包括在三个位置处的取代，这三个位置对应于SEQ ID NO :2的成熟多肽的位置I86D，E，N，Q、E87C、I90D，E，Q、以及N92D，E，Q 中的任何。
15. 如权利要求1-12中任一项所述的变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO :2的成熟多肽的位置I86D，E，N，Q、E87C、I90D，E，Q、以及N92D，E，Q的每个位置处的取代。
16. 如权利要求1-15中任一项所述的变体，该变体包括对应于SEQ ID NO :2的成熟多肽的选自下组的位置的一个或多个取代，该组由以下各项组成：D62C ;S83T ;R84G ;I86P ; E87T, A, Q ；W89L ；G91L, A ；L93T ；N94D, S ；F95Y ；D96T, I ；L97P, F ；K98Q, D, T〇
17. 如权利要求1-16中任一项所述的变体，该变体包括对应于SEQ ID NO :2的成熟多肽的位置的任何以下取代组或由其组成： a) S83T+R84G+I86D+E87T+W89L+I90Q+G91L+N92D+L93T+F95Y+D96T+K98T ； b) S83T+E87T+G91L+N92D+F95Y+D96T+L97P+K98Q ； c) I86P+E87A+G91A+N94D+D96I+L97F+K98D ； d) S83T+R84G+I86D+E87Q+W89L+I90Q+G91L+N92E+L93T+N94S+F95Y+D96T+K98T ； e) D62C+S83T+R84G+I86D+E87C+W89L+I90Q+G91L+N92D+L93T+F95Y+D96T+K98T ； f) D62C+S83T+E87C+G91L+N92D+F95Y+D96T+L97P+K98Q ； g) D62C+I86P+E87C+G91A+N94D+D96I+L97F+K98D ； h) D62C+S83T+R84G+I86D+E87C+W89L+I90Q+G91L+N92E+L93T+N94S+F95Y+D96T+K98T ； i) S83T+R84G+I86D+E87T+W89L+I90Q+G91L+N92D+L93T+F95Y+D96T+K98T+T231R+N233 R; j) S83T+E87T+G91L+N92D+F95Y+D96T+L97P+K98Q+T231R+N233R ； k) I86P+E87A+G91A+N94D+D96I+L97F+K98D+T231R+N233R ； l) S83T+R84G+I86D+E87Q+W89L+I90Q+G91L+N92E+L93T+N94S+F95Y+D96T+K98T+T231R+ N233R ； m) D62C+S83T+R84G+I86D+E87C+W89L+I90Q+G91L+N92D+L93T+F95Y+D96T+K98T+T231R+ N233R ； n) D62C+S83T+E87C+G91L+N92D+F95Y+D96T+L97P+K98Q+T231R+N233R ； o) D62C+I86P+E87C+G91A+N94D+D96I+L97F+K98D+T231R+N233R ;或 p) D62C+S83T+R84G+I86D+E87C+W89L+I90Q+G91L+N92E+L93T+N94S+F95Y+D96T+K98T+T 231R+N233R。
18. 如权利要求1-17中任一项所述的变体，该变体相对于亲本具有一种改进的特性，其中该改进的特性选自：改进的催化速率；改进的比活性；改进的底物裂解；改进的盖打开；降低的钙离子依赖性；改进的助洗剂耐受性，或改进的洗涤性能。
19. 一种编码如权利要求1-18中任一项所述的变体的分离的多核苷酸。
20. -种包括如权利要求19所述的多核苷酸的核酸构建体。
21. -种包括如权利要求19所述的多核苷酸的表达载体。
22. -种包括如权利要求19所述的多核苷酸的宿主细胞。
23. -种产生脂肪酶变体的方法，该方法包括： a. 在适合于表达该变体的条件下培养如权利要求22所述的宿主细胞；并且 b. 回收该变体。
24. -种产生如权利要求1-18中任一项所述的变体的方法，该方法包括： a. 在有益于产生该变体的条件下，培养包括一种编码该变体的多核苷酸的一种转基因植物或植物细胞；并且 b. 回收该变体。
25. -种用于获得脂肪酶变体的方法，该方法包括：在亲本脂肪酶中在对应于SEQ ID NO :2的成熟多肽的位置I86D，E，N，Q、E87C、I90D，E，Q、以及N92D，E，Q的一个或多个位置处引入取代，其中该变体具有脂肪酶活性；并且回收该变体。
26. -种包括如权利要求1-18中任一项所述的变体的组合物。
27. 如权利要求26所述的组合物，处于一种单位剂型。
28. -种在织物护理和家居护理中清洁纺织品表面或硬质表面或其他表面的方法，该方法包括以下步骤： a) 使该表面与一种水性溶液接触，该水性溶液包括（i)如权利要求1-18中任一项所述的变体； b) 对该纺织品表面或硬质表面进行漂洗并干燥。
29. -种使用如权利要求1-18中任一项所述的变体产生一种清洁组合物的方法。
30. 如权利要求1-18中任一项所述的变体用于清洁的用途。
【文档编号】C12N15/00GK104204198SQ201380017421
【公开日】2014年12月10日申请日期:2013年3月22日优先权日:2012年4月2日
【发明者】J.思克乔德-乔尔根森, J.文德, A.斯文德森申请人:诺维信公司

文档序号 : 【 467124 】

技术研发人员：J.思克乔德-乔尔根森,J.文德,A.斯文德森
技术所有人：诺维信公司

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J.思克乔德-乔尔根森丨J.文德丨A.斯文德森丨诺维信公司