快速检测新疆出血热病毒的荧光定量rt-pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学检测领域，特别涉及一种快速检测新疆出血热病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒，试剂盒的检测方法及该试剂盒在临床、口岸检验新疆出血热病毒的应用。
背景技术：
新疆出血热(Xinjian hemorrhagic fever，XHF)是由布尼亚病毒科内罗病毒属的新疆出血热病毒(Xinjian hemorrhagic fever virus，简称XHFV，又称克里米亚-刚果出血热病毒)引起的急性传染病，经蜱媒传播，主要流行于欧、亚、非三大洲，新疆出血热的发生有明显的季节性，每年4 5月为流行高峰，与蜱在自然界的消长情况及牧区活动的繁忙季节相符合。临床特征有发热、头痛、困倦乏力、呕吐、血尿、蛋白尿甚至休克等。目前对新疆出血热尚无特效治疗，原则应采取综合治疗措施，以控制出血和抗休克为主。因此早期快速诊断是控制病情，提高治愈率，避免临床误诊贻误治疗时机的关键。我国部分地区的地理、气候、传播媒介-蜱、传染源等条件与欧、亚、非三大洲流行区相似，随着全球经济的发展，国际间的人群交往更为便利，全球贸易一体化和都市化生活等趋势使得病毒和传播媒介更易在各个国家之间传播。所以有必要建立新疆出血热病毒的快速分子生物学检测方法，在国境口岸对出入境人群和媒介生物进行早期快速的检测和监控，防止该传染病在口岸的传入，做到及时预防、控制疾病的传播，对保障我国的经济发展和人民身体健康有着重要的意义。目前国内对新疆出血热病毒的研究较少，仅建立了该病毒的组织培养和RT-PCR 检测方法。国外对新疆出血热病毒的诊断方法主要包括组织培养、血清学诊断和新发展的分子生物学方法。新疆出血热病毒的培养要求实验室的生物安全等级高，需在BSL-3实验室进行，病毒分离、鉴定的时间较长，且检测灵敏度不高；血清学方法主要包括(1)补体结合试验主要检测补体结合抗体，阳性反应出现较迟，临床实验室较少采用；(2)中和试验 方法很复杂，一般不应用于临床；(3)血凝抑制试验，需采集双份血清标本，以第二份血清的抗体效价呈4倍以上升高为近期感染指标。此外，尚有报道采用捕获ELISA、间接免疫荧光等方法检测特异性抗体。分子生物学方法与组织培养、血清学诊断相比，具有检测灵敏度高，特异性强和检测时间短等优点，但目前尚没有适合口岸快速检测新疆出血热病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术缺点，提供一种快速检测新疆出血热病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒及检测方法，以适合临床、口岸等场新疆出血热病毒的快速检验。本发明的检测新疆出血热病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒，其包括 (I)RT-PCR 反应选用的试剂盒为 AgPath-ID One-Step RT-PCR Kit (美国 Ambion 公司产品)。内含25XRT-PCR酶混合液包含反转酶、热启动Taq酶；2XRT-PCR反应buffer 和ROX阳性参照染料。(2)正向引物 100 μ L，浓度为 12. 5μΜ;
(3)反向引物100μ L，浓度为17. 5μΜ;
(4)荧光探针50μ L，浓度为12. 5μΜ；
(5)无菌DEPC 7jC :5mL
(6)阳性对照即含有新疆出血热病毒特异的基因RNA片断；
(7)阴性对照无菌DEPC处理水。所述引物对及荧光探针是合成的DNA片段，碱基序列分别为 正向引物5’ -TGACAGCATT TCTTTAACAGACATCA-3，，
反向引物5’ -AAACACGGCAGCCTTAAGCA-3，， 荧光探针5，-FAM-TCGCCAGGGACTTTATATTCTGCAAGG-TAMRA-3，。上述引物、探针是用Lasergene软件包中的kqMan程序分析从Genbank上获得的新疆出血热病毒核苷酸序列，选择有核苷酸特异的区域，用I^rimer Express〗.0软件设计得到的特异性引物和探针，该引物和探针在新疆出血热病毒基因组上的定位依据是GenBank 序列号为HQ833035. 1的毒株序列，相关信息详见表1。表权利要求
1.快速检测新疆出血热病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征是包括以下试剂(1)RT-PCR反应试剂盒，内含25 X RT-PCR酶混合液包含反转酶、热启动Taq酶； 2 X RT-PCR反应buffer和ROX阳性参照染料；(2)正向引物100μ L，浓度为12. 5μΜ；(3)反向引物100μ L，浓度为17. 5μΜ；(4)荧光探针50μ L，浓度为12. 5μΜ；(5)无菌DEPC 7jC :5mL ；(6)阳性对照即含有新疆出血热病毒特异的基因片断的质粒；(7)阴性对照无菌DEPC处理水；所述引物对及荧光探针是合成的DNA片段，碱基序列分别为 正向引物5’ -TGACAGCATT TCTTTAACAGACATCA-3，， 反向引物5，-AAACACGGCAGCCTTAAGCA-3，， 荧光探针5，-FAM-TCGCCAGGGACTTTATATTCTGCAAGG-TAMRA-3，。
2.采用权利要求1所述试剂盒检测新疆出血热病毒的方法(1)提取待测样品的RNA;(2)RT-PCR扩增，方法如下在 RT-PCR 试剂管内加入 25 X RT-PCR 酶混合液 1 μ 1，2 X RT-PCR 反应 buffer 12. 5 μ 1， 正向引物1μ 1，反向引物1μ 1，荧光探针0.5μ 1，模板RNA IOOpg至Iyg (彡5 μ )，用 DEPC处理水补充至25 μ 1 ；瞬时离心混勻；同时设立阴性对照和阳性对照一起置RT-PCR仪扩增扩增条件为45°C反应10分钟；95°C反应15分钟；进入扩增循环，95°C反应15秒， 60°C反应45秒，循环40次；(3)RT-PCR结果判定无Ct值或Ct > 45，且无明显扩增曲线，判定为阴性； Ct ^ 40，并有明显扩增曲线，判定为阳性；40 < Ct ^ 45，重新检测，若见有明显扩增曲线，则为阳性，否则为阴性。
全文摘要
本发明涉及一种快速检测新疆出血热病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒，本发明根据新疆出血热病毒所特有的一段保守序列设计特异引物并成功建立了新疆出血热病毒的PCR检测方法的基础上，研制成简单快速敏感的RT-PCR检测试剂盒。用本发明试剂盒及检测方法检测新疆出血热病毒，检测过程方便快速，2-3小时即可得知检测结果，检测灵敏度及准确性高，特别适合口岸出入境检验检疫的需要。
文档编号C12Q1/70GK102424866SQ20121000536
公开日2012年4月25日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者丁永健, 孙立新, 朱临, 朱光耀, 朱国强, 杨庆贵, 胡红霞 申请人:中华人民共和国江苏出入境检验检疫局
文档序号 :
【 601792 】
技术研发人员：孙立新,丁永健,胡红霞,朱临,朱光耀,朱国强,杨庆贵
技术所有人：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：孙立新,丁永健,胡红霞,朱临,朱光耀,朱国强,杨庆贵
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