一种CpGDNA新型佐剂及其制造方法和含有该佐剂的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种CpG DNA新型佐剂。更具体地说，涉及一种含有SEQ ID NO1的CpG DNA基序序列，该CpG DNA基序序列是安全、高效、廉价的DNA分子新型佐剂，特别是用作猪疫苗中的DNA分子佐剂。本发明还涉及利用基因工程技术生产上述含SEQ ID NO1的CpG DNA基序序列的方法，以及包含所述CpG DNA基序序列的新型疫苗组合物。
背景技术：
自从上世纪20年代以来，许多物质被尝试作为免疫佐剂，但只有铝胶佐剂获得了人类疫苗的许可，并大量用于动物疫苗。它作为抗原的储存库和载体，缓慢释放抗原从而延长诱导机体的体液免疫反应，但缺点是仅诱导Th2体液免疫反应，抗体以IgG1型为主，无TCL反应。油佐剂和弗氏完全佐剂虽能明显提高免疫应答能力，但在实际应用中常出现不良反应，如注射部位肿胀、疼痛、发烧，或发生过敏等，仅限用于实验室动物试验。206佐剂是目前商品化的高效动物疫苗油佐剂，已广泛使用于动物疫苗中，实践证实是可靠的、有效的和安全的，但需要进口，价格较高。
非甲基化CpG基序的免疫增强作用已被许多研究所证实含非甲基化的CpG寡核苷酸序列(简称CpG ODN)能使B、T细胞激活，同时增强机体的特异性细胞免疫和体液免疫，它能诱导强烈的Th1型反应，以IgG2a型为主，有TCL反应，同时能与铝胶等其他佐剂配伍使用，有较好的协同作用(Risini D.W，M J.McCluskie，Yu Xu，等人.CpGDNA induces stronger immune responses with less toxicity thanother adjuvant.Vaccine，2000，181755-1762)。
目前在国内外已有用人工合成且进行硫代修饰的CpG ODN或从其他低等生物中提取含CpG基序的基因组DNA作为疫苗新型佐剂，证明免疫增强效果好，具有替代传统佐剂的优势。但存在的问题是人工合成的CpG ODN很容易降解，而硫代修饰的序列费用太高，不能被生产所接受(Mannon R B，Natara C，Pisetsky D S.Stimulation ofthymocyte by phosphorothioate DNA oligonucleotide.CellImmunol，2000，201(1)14-21)；低等生物的基因组DNA虽含有未甲基化的CpG基序，但有可能引入有害基因或物质到机体，盲目性较大。
我国是养猪大国。我国生猪饲养量在11亿头以上，在畜牧业生产中占有较大的比重，同时养猪业也是我国部分省区的主要生产支柱和新的经济增长点。但面对当前养猪业重大疫病发生和流行愈加复杂的形势——旧病未除，新病又起，疫情不断，这就要求我们必须运用新的科学理论和生产技术来发展猪用安全、高效疫苗，预防和控制各种疫病的发生和流行，而佐剂研制是疫苗研究的主要组成部分。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术和理论的缺陷，提供一种基于非甲基化CpG基序的安全、高效、廉价的新型疫苗佐剂以及其生产方法。
为达到该目的，本发明人依据非甲基化CpG基序激发脊椎动物的先天性免疫保护机制的原理，按照其空间结构效应和宿主特异性，设计合成多种CpG基序序列，在小鼠、家兔和猪体上进行重要疫病疫苗(口蹄疫、猪瘟和猪囊虫病)的配伍试验，筛选出具有良好佐剂效应的CpGODN，即5’-T CGT CGT TTG TCG TTT TGT CGT T-3’，将其命名为SEQID NO1。
将上述CpG ODN克隆入质粒DNA后，得到CpG DNA(即含有CpG ODN的重组质粒)。该CpG DNA具有较高的稳定性，并且该CpG DNA具有明显的免疫增强效果，可以用作多种疫苗的佐剂，特别是用于预防和/或治疗常见猪疫病的疫苗佐剂。本发明CpG DNA的佐剂效应具体表现在(1)能增强小鼠抗猪囊尾蚴免疫反应，同时具有较高的体液免疫和细胞免疫即Th1反应，CpG DNA诱导的抗体水平比铝胶、206佐剂均较高，可持续120天以上，与铝胶、206佐剂配伍均有协同作用，其中与206佐剂配伍效果最好；(2)能明显增强猪口蹄疫灭活疫苗的免疫效果，其免疫后45天的抗体滴度可达134，是标准疫苗的4倍以上。具有使用剂量小，毒性低的特性。20μg CpG DNA的小鼠免疫剂量可达到比铝胶、206佐剂标准剂量更好的免疫效果，在1000μg剂量也未发现对小鼠的毒副作用。
因此，在一方面，本发明提供了含有SEQ ID NO1的DNA基序序列，其中SEQ ID NO1是非甲基化的，并且该DNA基序序列中除SEQID NO1之外的其它序列不应干扰SEQ ID NO1的佐剂效应。
另外，发明人发现CpG ODN与较大的DNA序列相连可以显著提高CpG ODN的稳定性和安全性，而又保持其佐剂效应和低毒性。所述较大的DNA序列优选为质粒载体，如基因工程中常用的质粒载体。优选为puc18载体。
在另一方面，本发明提供了生产和扩增上述含有SEQ ID NO1的DNA序列的方法，包括下列步骤(1)人工合成两端添加酶切位点部分碱基的SEQ ID NO1及其互补序列，采用DNA变性、复性技术使其成为双链形式的DNA序列；(2)采用基因工程重组技术，将其克隆入质粒载体；(3)用步骤(2)所得的质粒载体转化原核宿主菌，挑选阳性克隆，测序鉴定后，再进行扩增培养；和(4)大量提取和纯化含有目的DNA序列的重组质粒DNA。
其中步骤(2)中的质粒载体可以是基因工程中常用的载体，用于使插入的DNA序列得到扩增，并增加该DNA序列的稳定性，同时保持其佐剂效应，例如puc18质粒载体。这类载体是本领域普通技术人员熟知的。添加酶切位点和克隆的方法是现有技术中的常规手段，酶切位点例如可以是EcoRI和SalI酶切位点。
步骤(3)中的原核宿主菌也是基因工程领域中常用的，其不具有甲基化的能力，例如大肠杆菌。宿主的转化、阳性克隆的筛选、序列测定、宿主菌株的培养以及核酸序列的提取纯化都是本领域技术人员熟知的，例如描述于Sambrook等人的《Molecular CloningALaboratory Manual》(纽约，冷泉港实验室，2001年)。
本发明方法与现有技术相比，具有明显的特点和优势按本发明方法制造的猪疫苗用CpG DNA新型佐剂，其中的CpG基序佐剂序列具有在原核中不被甲基化的特性，而保持了其非特异性的免疫刺激作用；能使CpG基序佐剂序列在大肠杆菌等原核宿主菌中简单易行地得到扩增和大量提取，成本比合成方法低得多；该制造方法制备的CpG DNA新型佐剂含量可达2.5-4.0g/L，纯度可达1.78-1.85(OD260/OD280)。
再一方面，本发明还提供了含有有效量的本发明DNA序列作为佐剂的动物疫苗组合物，特别是猪重要疫病疫苗组合物。具体地，当疫苗组合物为猪囊尾蚴虫体抗原疫苗组合物时，本发明CpG DNA在所述疫苗组合物中的含量(以疫苗组合物总体积为基础计算)可以为25-2500μg/ml，特别优选的是25-500μg/ml。当疫苗组合物为猪口蹄疫灭活病毒颗粒抗原疫苗组合物时，本发明CpG DNA在所述疫苗组合物中的含量(以疫苗组合物总体积为基础计算)可以为200μg/3ml。所述疫苗组合物中的免疫原选自猪囊尾蚴虫体抗原和猪口蹄疫灭活病毒颗粒抗原。在该疫苗组合物中，本发明CpG DNA序列还可与其他商品化佐剂如206、铝胶佐剂配伍使用，其中与206佐剂配伍效果最好。
附图简述
图1重组CpG-DNA质粒与不同佐剂配伍时对猪囊尾蚴抗原的免疫增强效果。Ag代表猪囊尾蚴抗原；CpG代表重组CpG-DNA质粒；Al代表铝胶佐剂；206代表206佐剂；control代表接种不含抗原的疫苗稀释液。横轴代表接种后天数，纵轴代表ELISA法检测抗体的OD值。
图2不同剂量的重组CpG-DNA质粒对猪囊尾蚴抗原的免疫增强效果。Ag代表猪囊尾蚴抗原；CpG代表重组CpG-DNA质粒；Al代表铝胶佐剂；206代表206佐剂；control代表接种不含抗原的疫苗稀释液；纵轴代表ELISA法检测抗体的OD值。
图3不同剂量的重组CpG-DNA质粒对猪囊尾蚴抗原免疫增强IgG2a含量(即Th1反应)的作用。Ag代表猪囊尾蚴抗原；CpG代表重组CpG-DNA质粒；Al代表铝胶佐剂；206代表206佐剂；control代表接种不含抗原的疫苗稀释液；纵轴表示IgG2a含量。
图4重组CpG-DNA质粒对猪囊尾蚴抗原诱导免疫脾细胞产生γ-IFN的能力(即Th1反应)的作用。Ag代表猪囊尾蚴抗原；CpG代表重组CpG-DNA质粒；206代表206佐剂；control代表接种不含抗原的疫苗稀释液；纵轴代表脾细胞诱导产生的γ-IFN的含量。
图5重组CpG-DNA质粒对猪口蹄疫灭活疫苗的免疫抗体滴度增强作用。F-V代表猪口蹄疫灭活疫苗；puc18代表不具有SEQ ID NO1的空载体；F-V+CpG DNA代表含有本发明CpG DNA质粒的猪口蹄疫灭活疫苗；control代表接种不含抗原的疫苗稀释液。横轴代表接种后天数，纵轴代表抗体滴度。
通过下面的实施例，本发明将得到更充分的理解。这些实施例只是用来说明本发明，而不应解释为对本发明的限制。
实施例实施例1制备含有SEQ ID NO1的本发明DNA序列1、CpG基序序列的合成与筛选依据CpG基序的空间效应和动物宿主特异性，设计、合成多种CpG基序，为防止很快降解将其进行全链硫代修饰，在小鼠、家兔和猪体上进行重要疫病疫苗(口蹄疫、猪瘟和猪囊虫病)的配伍试验，从中筛选出猪用最佳佐剂核心序列SEQ ID NO1。
2、CpG基序序列的重组克隆人工再合成含CpG基序的非硫代的、非甲基化的上述SEQ ID NO1最佳佐剂核心序列，同时在其末端分别设计EcoRI和SalI酶切位点的部分碱基，生成AAT TCT CGT CGT TTG TCG TTT TGT CGT TG及其互补序列，采用控温变性、复性技术使其成为双链DNA，通过基因工程重组技术，定向将其克隆入puc18载体，转化大肠杆菌，用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆，提取质粒测序鉴定，确认已将含有CpG基序序列的SEQ ID NO1克隆到质粒载体中。将正确插入了SEQ ID NO1的puc18重组质粒命名为重组CpG-DNA质粒。
3、重组CpG-DNA质粒的大量扩增、提取和纯化选择高拷贝的阳性菌株，接种到1000ml含氨苄的LB培养基中，在220rpm摇床中37℃培养12～14小时后，用SDS碱裂解法大量提取重组CpG-DNA质粒。粗提取的质粒经5M冰冷的LiCl分离后，其上清液用等体积异丙醇沉淀，再用70％乙醇洗涤沉淀，离心除去上清；将沉淀用含RNase的TE缓冲液溶解，室温处理30分钟后，再用酚氯仿抽提2次，2倍无水乙醇沉淀离心；用1ml灭菌水溶解沉淀后，加入0.5ml PEG-MgCl2溶液(30mM MgCl2中加入40％PEG 8000)，充分混匀后放置15分钟，13000rpm离心20分钟，沉淀用70％的乙醇洗涤2次，再用TE缓冲液或无菌水溶解沉淀，用核酸蛋白检测仪测定其含量和纯度，4℃保存备用。
实施例2含CpG-DNA质粒的猪囊尾蚴疫苗将实施例1中提取纯化的重组CpG-DNA质粒单独(100μg/只)或与其他佐剂配伍(铝胶135μg/只；206佐剂100μl/只)，作为猪囊尾蚴抗原(200μg/只)的佐剂，制备疫苗免疫小鼠(200μl/只)，在免疫后不同时间剪尾采血分离血清，测定血清中的抗体、抗体亚型和免疫脾细胞分泌γ-IFN和IL-4的含量。试验证明能增强小鼠抗猪囊尾蚴的体液免疫和细胞免疫。重组CpG-DNA质粒诱导的抗体水平，比铝胶、206佐剂均较高，可持续120天以上，与铝胶、206佐剂配伍均有协同作用，其中与206佐剂配伍效果最好(见图1)。
实施例3含CpG-DNA质粒的猪口蹄疫灭活疫苗将实施例1中提取纯化的重组CpG-DNA质粒200μg作为猪口蹄疫灭活疫苗(普通苗)免疫增强剂，共同免疫试验猪(3ml/头)，并用该单独疫苗(3ml/头)作为阳性标准疫苗，用间接血凝和液相阻断ELISA法检测其抗体滴度，免疫后45天的抗体滴度可达134，是标准疫苗的4倍以上(见图5)。
实施例4本发明CpG-DNA质粒的毒副作用及使用剂量将实施例1中提取纯化的重组CpG-DNA质粒按10、20、100、200和1000μg/400μl/只的剂量(即CpG-DNA质粒含量分别为25、50、250、500、2500μg/ml疫苗)作为小鼠的免疫佐剂，进行动物试验，发现该佐剂具有剂量小，毒性低等特性。20μg重组CpG-DNA质粒的小鼠免疫剂量可达到比铝胶、206佐剂标准剂量更好的免疫效果，随着剂量的增加Th1型反应更明显(见图3，4)，在200μg、1000μg剂量也未发现对小鼠的毒副作用(见图2)。
序列表<110>中国农业科学院兰州兽医研究院<120>一种CpG DNA新型佐剂及其制造方法和含有该佐剂的疫苗<160>1<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>1tcgtcgtttg tcgttttgtc gtt2权利要求
1.一种DNA序列，其特征在于该DNA序列中含有未甲基化的SEQID NO1，并且该DNA序列中除SEQ ID NO1之外的其它序列不干扰SEQ ID NO1的佐剂效应，前提是所述DNA序列不为SEQ ID NO1。
2.权利要求1的DNA序列，其为质粒和SEQ ID NO1的融合序列。
3.权利要求2的DNA序列，其中所述质粒为puc18质粒载体。
4.权利要求1-3中任一项的DNA序列的制造和扩增方法，包括以下步骤(1)人工合成两端添加酶切位点部分碱基的所述单链DNA序列及其互补序列，采用DNA变性、复性技术使其成双链形式；(2)采用基因工程重组技术，将其克隆入质粒载体；(3)用步骤(2)所得的质粒载体转化原核宿主菌，挑选阳性克隆，测序鉴定后，再进行扩增培养；和(4)大量提取和纯化含有所述DNA序列的重组质粒DNA。
5.权利要求4的DNA序列的制造和扩增方法，其中步骤(2)中的质粒载体为puc18质粒载体，步骤(3)中的原核宿主菌为大肠杆菌。
6.一种猪疫苗组合物，其特征在于该疫苗组合物含有有效量的权利要求1-3中任一项的DNA序列作为佐剂。
7.权利要求6的猪疫苗组合物，其为猪囊尾蚴虫体抗原疫苗组合物，其中以组合物总体积为基础计算，所述DNA序列的浓度为25-2500μg/ml。
8.权利要求7的猪疫苗组合物，其中以组合物总体积计算，所述DNA的浓度为25-500μg/ml。
9.权利要求6的猪疫苗组合物，其为猪口蹄疫灭活病毒颗粒抗原疫苗组合物，其中以组合物总体积为基础计算，所述DNA序列的含量为200μg/3ml。
10.权利要求6-9任一项的猪疫苗组合物，其还含有选自铝胶和206佐剂的佐剂作为配伍佐剂。
11.权利要求6-9任一项的猪疫苗组合物，其含有选自猪口蹄疫灭活病毒颗粒抗原和猪囊尾蚴虫体抗原的免疫原。
全文摘要
本发明涉及一种CpG DNA新型佐剂。具体地，本发明提供了一种包含SEQ ID NO1的CpG基序序列，其是安全、高效、廉价的DNA分子新型佐剂，特别可用于猪疫病疫苗。本发明也提供了生产所述CpG DNA新型佐剂的具体方法，以及含有该新型佐剂的疫苗。
文档编号C12N15/63GK1814757SQ20051000913
公开日2006年8月9日 申请日期2005年2月3日 优先权日2005年2月3日
发明者景志忠, 才学鹏, 蒙学莲, 王佩雅, 窦永喜, 骆学农, 李辉, 郑亚东 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所
文档序号 :
【 427157 】
技术研发人员：景志忠,才学鹏,蒙学莲,王佩雅,窦永喜,骆学农,李辉,郑亚东
技术所有人：中国农业科学院兰州兽医研究所
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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技术研发人员：景志忠,才学鹏,蒙学莲,王佩雅,窦永喜,骆学农,李辉,郑亚东
技术所有人：中国农业科学院兰州兽医研究所
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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