油菜花粉提取物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于天然产物深加工和生物工程技术领域，涉及生物制药技术或功能性食品加工领域，特别是涉及一种油菜花粉提取物及其制备方法与应用。
背景技术：
蜂花粉是蜜蜂从显花植物(蜜源植物和花粉源植物)花蕊内采集的花粉粒，并加入了特殊的腺体分泌物、花蜜和唾液混合而成了一种不规则扁圆形状物。蜂花粉是种高蛋白低脂肪营养保健食品，具有的独特的天然保健作用与医疗及美容价值，是人类天然食品中的瑰宝。蜂花粉中含有种类繁多的活性物质，其中包括活性蛋白、活性多肽、维生素、黄酮类化合物等。蜂花粉含有丰富的蛋白质、肽和氨基酸，这些物质既是重要的营养因子，又是重要的保健因子，有提高免疫力、增强体质、促进智力及抗衰老和抗氧化等作用。其中，活性多肽由氨基酸构成，对人体具有非常重要的调节作用，这种作用几乎涉及到人体的所有生理活动，在极微量使用下也能发挥作用，而且在人体内可被迅速代谢，最终变为氨基酸或水。油菜花粉因油菜是我国大面积种植的农业经济作物而成为我国最富产的蜂花粉，其生物类黄酮等活性物质含量相当高，具有增强免疫力、防衰老、美容、防治脑心血管疾病和防治前列腺疾病等功效作用。目前国内对蜂花粉中功能性活性蛋白研究甚广，多数是通过将花粉破壁、脱脂后， 用蛋白酶进行酶解反应，获得活性小肽，进而对这些酶解产物进行功能性研究。直接提取花粉中活性多肽并对其活性进行鉴定的研究则相对较少。
发明内容
本发明的目的是提供一种油菜花粉提取物及其制备方法与应用。本发明提供的制备油菜花粉提取物的方法，包括如下步骤1)将油菜花粉与Coca' s试剂混合搅拌静置后，离心取上清液，向所述上清液中加入硫酸铵至溶液中硫酸铵的饱和度大于60%小于等于80%后，离心，将所得沉淀溶于 PBS缓冲液中，得到粗提液；2)将步骤1)所得粗提液过葡聚糖凝胶层析柱，用PBS缓冲液洗脱，收集所有紫外吸收值不为零的洗脱物，得到油菜花粉粗提物；3)将步骤2、所得油菜花粉粗提物用高效液相色谱纯化，收集保留时间分别为 3. 953,6. 109,6. 833和7. 017分钟的提取物，得到所述油菜花粉提取物；所述高效液相色谱纯化步骤中，所用高效液相色谱柱为Waters Simfire C18半制备柱，柱的内径为19毫米，长度为150毫米，填料粒径为5 μ m,柱温为25°C，流速为5mL/min，流动相为体积比为 90 10的由乙腈和体积百分浓度为0.4%的甲酸水溶液组成的混合液；进样体积为10mL， 检测波长为254nm。上述方法的步骤1)中，所述Coca' S试剂是由氯化钠、碳酸氢钠、苯酚和水组成，所述氯化钠的浓度为5g/L，所述碳酸氢钠的浓度为2. 8g/L，所述苯酚的浓度为4g/L ；所述油菜花粉与所述Coca' 8试剂的用量比为lg: IOmL;所述PBS缓冲液中，pH值为7.0，浓度为20mmol/L ；混合搅拌静置步骤中，温度为4°C ；所述搅拌步骤中，时间为小时，优选M小时；所述静置步骤中，时间为M-72小时，优选M小时；所述离心步骤中，转速为 10000-15000r/min，优选 15000r/min,时间为 10-15 分钟，优选 10 分钟。所述步骤2)中，所述PBS缓冲液中，PH值为7. 0，浓度为20mmol/L ；所述葡聚糖凝胶层析柱的型号为kphadexG-25葡聚糖凝胶层析柱。该步骤是根据葡聚糖凝胶的层析原理，得到不同分子量段的化合物，根据所得不同分子量段化合物具有不同的紫外吸收值，分管收集不同的化合物，直至紫外吸收值为零。所述步骤幻高效液相色谱纯化步骤时，可根据色谱峰时间收集相同成分，然后冷冻干燥，制得所需的油菜花粉提取物。按照上述方法制备而得的油菜花粉提取物(尤其是数均分子量为1000-2000g/ mol的油菜花粉提取物)，以及以该油菜花粉提取物为活性成分的食品、保健品、药物或化妆品，也属于本发明的保护范围。本发明提供的油菜花粉提取物的制备方法，是采用盐溶液粗提油菜花粉，用 60% -80%饱和硫酸铵沉淀其中的活性蛋白，最后通过葡聚糖凝胶层析柱及半制备高效液相色谱分离纯化得到油菜花粉提取物。该方法中，所用原料为天然物质，来源广泛，实用性强，所得提取物为油菜花粉本身所含，不需要添加任何的外来功能性多肽，所得提取物的数均分子量为1000 2000g/mol。本发明用联苯三酚反应体系测定所收集提取物对联苯三酚形成超氧阴离子的清除率，体外实验表明该提取物具有抗氧化能力，能很好的清除超氧阴离子自由基，可以延缓衰老，因此可以作为食品、保健品和功能性药物，还可以加入食用、药用或化妆品中发挥其抗氧化功效作用，具有重要的应用价值。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。实施例11)分别取油菜花粉10g、COCa' s试剂(含浓度为5g/L的氯化钠、2. 8g/L的碳酸氢钠以及4g/L苯酚的水溶液)IOOmL,将其混合，在4°C条件下，磁力搅拌M小时后于4°C静置Mh，然后于4°C以15000r/min的转速高速离心IOmin除去固体杂质，同时提取液中的脂肪和糖类物质基本除去。取离心步骤所得上清液，搅拌加入硫酸铵，使其饱和度达60%以除去提取液中的酯类物质，然后离心收集硫酸铵饱和度大于60%且小于等于80%之间的沉淀，该沉淀主要为蛋白，将所得沉淀溶于PH值为7.0、浓度为20mmol/L的PBS缓冲液，得到粗提液。2)将步骤1)所得粗提液过kphadexG-25葡聚糖凝胶层析柱，用pH值为7. 0、浓度为20mmol/L的PBS缓冲液洗脱，收集所有紫外吸收值不为零的洗脱物，得到油菜花粉粗提物；3)将步骤幻所得油菜花粉粗提物用柱的内径为19毫米、长度为150毫米、填料粒径为5μπι的Waters Simfire C18半制备柱进行高效液相色谱纯化，得到油菜花粉提取物。该高效液相色谱纯化条件具体为流速为5mL/min，流动相为体积比为90 10为由乙腈和体积百分浓度为0. 4%的甲酸水溶液组成的混合液；进样体积为10mL，检测波长为 254nm ；在以上条件下按40s/管的速度分管收集，然后根据色谱峰的保留时间，依次将成分相同的组分合并，油菜花粉提取物的保留时间具体如表1所示，然后在-50°C冷冻干燥48小时，收集组分均为粉末，为本发明提供的油菜花粉提取物。
表1、油菜花粉提取物不同组分的保留时间
权利要求
1.一种制备油菜花粉提取物的方法，包括如下步骤1)将油菜花粉与Coca's试剂混合搅拌静置后，离心取上清液，向所述上清液中加入硫酸铵至溶液中硫酸铵的饱和度大于60%小于等于80%后，离心，收集沉淀，将所得沉淀溶于PBS缓冲液中，得到粗提液；2)将步骤1)所得粗提液过葡聚糖凝胶层析柱，用PBS缓冲液洗脱，收集所有紫外吸收值不为零的洗脱物，得到油菜花粉粗提物；3)将步骤幻所得油菜花粉粗提物用高效液相色谱纯化，收集保留时间分别为3.953、 6. 109,6. 833和7. 017分钟的提取物，得到所述油菜花粉提取物；所述高效液相色谱纯化步骤中，所用高效液相色谱柱为Waters Sunfire C18半制备柱，柱的内径为19毫米，长度为 150毫米，填料粒径为5 μ m，柱温为25°C，流速为5mL/min，流动相为体积比为90 10的由乙腈和体积百分浓度为0. 4%的甲酸水溶液组成的混合液；检测波长为254nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1)中，所述Coca's试剂是由氯化钠、碳酸氢钠、苯酚和水组成，所述氯化钠的浓度为5g/L，所述碳酸氢钠的浓度为2. Sg/ L，所述苯酚的浓度为4g/L;所述油菜花粉与所述Coca' s试剂的用量比为lg: IOmL ；所述PBS缓冲液中，pH值为7.0，浓度为20mmol/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤1)混合搅拌静置步骤中， 温度为4°C ；所述搅拌步骤中，时间为M-72小时，优选M小时；所述静置步骤中，时间为 24-72小时，优选M小时；所述离心步骤中，转速为10000-15000r/min，优选15000r/min， 时间为10-15分钟，优选10分钟。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述搅拌步骤中，时间为M小时；所述静置步骤中，时间为M小时；所述离心步骤中，转速为15000r/min，时间为10分钟。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述步骤幻中，所述PBS缓冲液中，PH值为7. 0，浓度为20mmol/L ；所述葡聚糖凝胶层析柱的型号为kphadexG-25葡聚糖凝胶层析柱。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于所述步骤3)中，进样体积为10mL。
7.权利要求1-6任一所述方法制备而得的油菜花粉提取物。
8.根据权利要求7所述的油菜花粉提取物，其特征在于所述油菜花粉提取物的数均分子量为 1000-2000g/mol。
9.以权利要求7或8任一所述油菜花粉提取物为活性成分的食品、保健品、药物或化妆
全文摘要
本发明公开了一种油菜花粉提取物及其制备方法与应用。该方法，包括如下步骤1)将油菜花粉与Coca′s试剂混合搅拌静置后，离心取上清液，向上清液中加入硫酸铵至溶液中硫酸铵的饱和度大于60％小于等于80％后，离心，将沉淀溶于PBS缓冲液中，得到粗提液；2)将粗提液过葡聚糖凝胶层析柱，用PBS缓冲液洗脱，收集所有紫外吸收值不为零的洗脱物，得到粗提物；3)将粗提物用高效液相色谱纯化，收集保留时间分别为3.953、6.109、6.833和7.017分钟的提取物，得到所述油菜花粉提取物。所得提取物的数均分子量为1000～2000g/mol，能很好的清除超氧阴离子自由基。
文档编号A23L1/29GK102166248SQ201110095120
公开日2011年8月31日 申请日期2011年4月15日 优先权日2011年4月15日
发明者吴黎明, 杨曙明, 柴婷婷, 王雪青, 赵静, 邱静 申请人:中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
文档序号 :
【 515912 】
技术研发人员：邱静,柴婷婷,赵静,吴黎明,杨曙明,王雪青
技术所有人：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：邱静,柴婷婷,赵静,吴黎明,杨曙明,王雪青
技术所有人：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除