降解纸类垃圾产高木聚糖酶和低纤维素酶细菌的制备方法
技术领域：
本专利属于生物技术，涉及一种降解纸类垃圾产高木聚糖酶和低纤维素酶细菌的制备方法。
背景技术：
酶法制浆研究是传统化学制浆工艺的主要研究方向之一，木聚糖酶在制浆造纸工业中的应用已日益受到人们的重视。国外在这方面已进行了大量研究，例如，用木聚糖酶预处理纸浆可改变纸张特性，木聚糖酶产生菌如果产生大量的纤维素酶，这对于提高纸浆纤维得率是不利的，所以产高木聚糖酶和低纤维素酶的细菌具有很高的应用价值。
发明内容
本发明提供一种从土壤中分离得到降解纸类垃圾产高木聚糖酶和低纤维素酶细菌的制备方法。为实现以上目的，本发明提出以下技术方案
采用选择性培养基筛选并纯化能够降解滤纸的细菌。进行降解滤纸和毛巾纸试验，肉眼观察到上述纸质大量降解并进行纸质降解液纤维素酶和木聚糖酶等的检测。其步骤如下 (1)野外取搀杂有大量腐烂至棕黄色或黑色木屑的土壤，置干净塑料袋中，在自然条件下风干7天。(2)利用铺有滤纸的ST21CX培养基筛选降解滤纸的细菌配制放线菌酮液。在 IOOmL经高压灭菌的ST21CX基础液中加放线菌酮液lmL，倒在平板上。取无菌滤纸铺于培养基上。将风干的土样无菌研磨至研钵内，研磨成细粉状，取适量使之均勻薄薄覆盖在铺有滤纸的ST21CX培养基上，28°C -30°C培养2 3周。放线菌酮液称取放线菌酮1. 25g，用乙醇溶解后用水定容于IOOmL容量瓶中，加入95%乙醇50mL，振摇使溶解，加入蒸馏水至200mL，过滤除菌。ST21CX 基础液g/1: KN03 1.0; K2HP04. 2H20 1.0; MgS04. 7H20 1.0; CaC12. 2H20 1.0; FeC13. 6H20 0.2;琼脂粉 15 ; pH 7· 2_7· 4。(3)挑取能够明显降解滤纸的菌落分别在VY/2培养基上-30°C培养，然后再次挑取单菌落进行纯化后，VY/2培养基上扩大培养。既得多种初步降解纸类垃圾细菌。VY/2 培养基CaCl2 ‘ 2H20 0.1% 活性酵母粉 0. 5% VB12 50μ g/100ml 琼脂 1.5% pH 7.2。VB12灭菌后加入。筛选方法
(4)将所得细菌分别接种在5 ml Dubos盐培养液内，在Dubos盐培养液内中添加0. 0 5g滤纸，摇床培养一周。滤纸为盐培养液的唯一碳原。筛选一周内能完全降解滤纸的细菌，既得降解纸类垃圾产高木聚糖酶和低纤维素酶目标菌。Dubos 盐培养液:g/l: K2HP04. 2H20 1.0; KCl 0.5; MgS04. 7H20 0.5; NaN03 0.5; FeS04. 7H20 0. 01; pH 7. 2-7. 4，两滴 IOmM 葡萄糖。
(5)接种筛选得到的降解纸类垃圾产高木聚糖酶和低纤维素酶目标菌IOOul于 CMC培养液，28°C -30°C摇床培养M小时，保存菌液。CMC 培养液每 100 ml 培养液含 0. 5g glucose, 0. Ig NaN03, 0. Ig K2HP04, 0. Ig KCl, 0. 05g MgS04。检验实例
(1)以本专利所得到的菌液IOOul接种在纸质添加量1% (打印纸和毛巾纸)的Dubos 盐培养液内，30°C摇床培养7天，肉眼观察每天纸质降解的情况，第2天能够看到纸质的降解，第7天后看到纸质降解成肉松状浆液；测定两种细菌降解毛巾的效果高于滤纸降解率， 最高达50%。(2)利用DNS方法，检测纸质的降解液离心后滤液木聚糖酶活性最高达20U/ml，而纤维素酶活性几乎检测不到。本发明的有益效果该方法操作简单，能够高效的找到降解纸类垃圾产高木聚糖酶和低纤维素酶细菌，利用此类菌能够增加生物漂白后纸浆强度，提高生物漂白经济效^ ο
具体实施例方式本发明提供一种从土壤中分离得到降解纸类垃圾产高木聚糖酶和低纤维素酶细菌的制备方法。为实现以上目的，本发明提出以下技术方案
采用选择性培养基筛选并纯化能够降解滤纸的细菌。进行降解滤纸和毛巾纸试验，肉眼观察到上述纸质大量降解并进行纸质降解液纤维素酶和木聚糖酶等的检测。其步骤如下
(1)野外取搀杂有大量腐烂至棕黄色或黑色木屑的土壤，置干净塑料袋中，在自然条件下风干7天。(2)利用铺有滤纸的ST21CX培养基筛选降解滤纸的细菌配制放线菌酮液。在 IOOmL经高压灭菌的ST21CX基础液中加放线菌酮液lmL，倒在平板上。取无菌滤纸铺于培养基上。将风干的土样无菌研磨至研钵内，研磨成细粉状，取适量使之均勻薄薄覆盖在铺有滤纸的ST21CX培养基上，28°C -30°C培养2 3周。放线菌酮液称取放线菌酮1. 25g，用乙醇溶解后用水定容于IOOmL容量瓶中，加入95%乙醇50mL，振摇使溶解，加入蒸馏水至200mL，过滤除菌。ST21CX 基础液g/1: KN03 1.0; K2HP04. 2H20 1.0; MgS04. 7H20 1.0; CaC12. 2H20 1.0; FeC13. 6H20 0.2;琼脂粉 15; pH 7· 2_7· 4。(3)挑取能够明显降解滤纸的菌落分别在VY/2培养基上-30°C培养，然后再次挑取单菌落进行纯化后，VY/2培养基上扩大培养，既得多种初步降解纸类垃圾细菌。VY/2 培养基CaCl2 ‘ 2H20 0.1% 活性酵母粉 0. 5% VB12 50μ g/100ml 琼脂 1.5% pH 7.2。VB12灭菌后加入。筛选方法
(4)将所得细菌分别接种在5 ml Dubos盐培养液内，在Dubos盐培养液内中添加0. 0 5g滤纸，摇床培养一周。滤纸为盐培养液的唯一碳原。筛选一周内能完全降解滤纸的细菌，既得降解纸类垃圾产高木聚糖酶和低纤维素酶目标菌。Dubos 盐培养液g/l: K2HP04. 2H20 1.0; KCl 0.5; MgS04. 7H20 0.5; NaN03 0.5; FeS04. 7H20 0. 01; pH 7. 2-7. 4，两滴 IOmM 葡萄糖。(5)接种筛选得到的降解纸类垃圾产高木聚糖酶和低纤维素酶目标菌IOOul于 CMC培养液，28°C -30°C摇床培养M小时，保存菌液。CMC 培养液每 100 ml 培养液含 0. 5g glucose, 0. Ig NaN03, 0. Ig K2HP04, 0. Ig KCl, 0. 05g MgS04。检验实例
(1)以本专利所得到的菌液IOOul接种在纸质添加量1% (打印纸和毛巾纸)的Dubos 盐培养液内，30°C摇床培养7天，肉眼观察每天纸质降解的情况，第2天能够看到纸质的降解，第7天后看到纸质降解成肉松状浆液；测定两种细菌降解毛巾的效果高于滤纸降解率， 最高达50%。(2)利用DNS方法，检测纸质的降解液离心后滤液木聚糖酶活性最高达20U/ml，而纤维素酶活性几乎检测不到。本发明的有益效果该方法操作简单，能够高效的找到降解纸类垃圾产高木聚糖酶和低纤维素酶细菌，利用此类菌能够增加生物漂白后纸浆强度，提高生物漂白经济效^ ο
权利要求
1.一种降解纸类垃圾产高木聚糖酶和低纤维素酶细菌的制备方法，其特征是采用选择性培养基筛选并纯化能够降解滤纸的细菌，其步骤如下(1)野外取搀杂有大量腐烂至棕黄色或黑色木屑的土壤，置干净塑料袋中，在自然条件下风干7天；(2)利用铺有滤纸的ST21CX培养基筛选降解滤纸的细菌，配制放线菌酮液；在 IOOmL经高压灭菌的ST21CX基础液中加放线菌酮液lmL，倒在平板上；取无菌滤纸铺于培养基上，将风干的土样无菌研磨至研钵内，研磨成细粉状，取适量使之均勻撒在铺有滤纸的 ST21CX培养基上，28°C -30°C培养2 3周；(3)挑取能够明显降解滤纸的菌落在VY/2培养基上-30°C培养，然后再次挑取单菌落进行纯化后，VY/2培养基上扩大培养；既得多种初步降解纸类垃圾细菌；(4)将所得细菌分别接种在5ml Dubos盐培养液内，在Dubos盐培养液内中添加O .0 5g滤纸，摇床培养一周，筛选一周内能完全降解滤纸的细菌，既得降解纸类垃圾产高木聚糖酶和低纤维素酶目标菌；(5)接种筛选得到的降解纸类垃圾产高木聚糖酶和低纤维素酶目标菌IOOul于CMC 培养液，28°C -30°C摇床培养M小时，保存菌液。
2.根据权利要求1所说的降解纸类垃圾产高木聚糖酶和低纤维素酶细菌的制备方法， 其特征是所说的放线菌酮液称取放线菌酮1. 25g，用乙醇溶解后用水定容于IOOmL容量瓶中，加入95%乙醇50mL，振摇使溶解，加入蒸馏水至200mL，过滤除菌。
3.根据权利要求1所说的降解纸类垃圾产高木聚糖酶和低纤维素酶细菌的制备方法,其特征是所说的 ST21CX 基础液g/l KN03 1. O ； K2HP04. 2H20 1. O ； MgS04. 7H20 1.0; CaC12. 2H20 1.0; FeC13. 6H20 0.2;琼脂粉 15; pH 7· 2_7· 4。
4.根据权利要求1所说的降解纸类垃圾产高木聚糖酶和低纤维素酶细菌的制备方法， 其特征是所说的Tm培养基CaC12 -2H20 0. 1%活性酵母粉0. 5% VB12 50 μ g/100ml 琼脂1. 5% pH 7. 2 ；VB12灭菌后加入。
5.根据权利要求1所说的降解纸类垃圾产高木聚糖酶和低纤维素酶细菌的制备方法， 其特征是所说的 Dubos 盐培养液:g/l: K2HP04. 2H20 1.0; KCl 0.5; MgS04. 7H20 0.5; NaN03 0.5; FeS04. 7H20 0. 01; pH 7. 2-7. 4，两滴 IOmM 葡萄糖。
6.根据权利要求1所说的降解纸类垃圾产高木聚糖酶和低纤维素酶细菌的制备方法， 其特征是所说的CMC培养液每100 ml培养液含0. 5g glucose, 0. Ig NaN03, 0. Ig K2HP04, 0. Ig KCl, 0. 05g MgS04。
全文摘要
一种降解纸类垃圾产高木聚糖酶和低纤维素酶细菌的制备方法。采用选择性培养基筛选并纯化能够降解滤纸的细菌。野外取搀杂有大量腐烂至棕黄色或黑色木屑的土壤风干后；均匀撒在铺有滤纸的ST21CX培养基上培养2～3周；挑取能够明显降解滤纸的菌落在VY/2培养基上28℃-30℃培养和纯化,Dubos盐培养液进行细菌滤纸降解试验，筛选能够在一周内完全降解滤纸的细菌于CMC培养液中保存菌种。既得降解纸类垃圾产高木聚糖酶和低纤维素酶细菌。该方法操作简单，能够高效的找到降解纸类垃圾产高木聚糖酶和低纤维素酶细菌，利用此类菌能够增加生物漂白后纸浆强度,提高生物漂白经济效果。
文档编号C12N1/22GK102492647SQ20111039845
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月5日 优先权日2011年12月5日
发明者万文菊, 于爱莲, 张忠, 杨春贵, 王纪亭, 高红莉 申请人:泰山医学院
文档序号 :
【 532835 】
技术研发人员：万文菊,王纪亭,于爱莲,张忠,高红莉,杨春贵
技术所有人：泰山医学院
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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技术研发人员：万文菊,王纪亭,于爱莲,张忠,高红莉,杨春贵
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