一种原生质体转化选育高产亮氨酸氨肽酶菌株的方法
技术领域：
原生质体转化选育高产亮氨酸氨肽酶菌株的方法，具体地说是利用原生质体转化育种技术将重组质粒PMA-BSAP转入枯草芽孢杆菌Zj016原生质体，适宜的条件下再生细胞壁，成功获得一株重组转化菌ZH-ZjOie ;传代多次实验证明该重组转化菌的遗传性能稳定。初步优化该转化菌的摇瓶培养基成分及发酵条件后，重组转化菌ZH-ZjOie发酵产亮氨酸氨肽酶酶活为161U/mL，达原始菌株Zj016的23倍。属于酶制剂、食品添加剂技术领域。
背景技术：
原生质体转化技术是20世纪60年代发展起来的一项重要的分子生物学技术，应用原生质体转化技术进行微生物选育，因为酶解去除了细胞壁，去除了细胞与外源DNA相互接触和交流的天然屏障，可以打破微生物的种属界限，实现远源菌株间的基因重组；且遗 传信息量大，遗传物质的传递更为完整，有利于提高育种速度，从而使得人们能够在短时间内选育到理想菌株。微生物菌种是发酵工业的核心，由其代谢产生的酶类已经应用于人们生活的方方面面，蛋白酶就在食品、皮革、洗涤剂等工业生产领域都有重要的应用，酶制剂是发酵产业的核心产品，酶制剂行业推动了发酵工业和相关行业的发展，并产生了巨大的经济和社会效益。氨肽酶是一类从蛋白质或肽链的氮端酶切氨基酸残基的外肽酶的总称，其在食品行业、医学、化工等方面都具有广泛的应用。国内在氨肽酶生产方面的研究处于快速发展的阶段，对于实现产业化，填补国内产品的空白，替代进口产品，增强我国酶制剂行业竞争力，打破该产品被国外的垄断有着重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用原生质体转化技术筛选高产亮氨酸氨肽酶菌株的方法，筛选到的高产菌株产酶能力相对出发菌株有显著提高。本发明的技术方案一种原生质体转化选育高产亮氨酸氨肽酶菌株的方法，对可产亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌Zjoie的原生质体制备及再生条件进行优化，在此基础上，将重组质粒PMA-BSAP与所制备的枯草芽孢杆菌Zj016的原生质体混合于高渗缓冲液中，在PEG介导下，使原生质体与PMA-BSAP发生相互凝聚，进行遗传转化，适宜的条件下再生细胞壁，成功获得一株重组转化菌ZH-Zj016，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号=CGMCC No. 6559，初步优化该重组转化菌的摇瓶培养基成分及发酵条件，获得高产亮氨酸氨肽酶菌株，工艺为
A.高产亮氨酸氨肽酶菌株筛选
(1)出发菌株枯草芽孢杆菌(feci77心subtilisnm^(食品与发酵工业2006年32卷第3期已公开，本校实验室保藏，申请日起20年内向公众提供)；
(2)质粒重组质粒PMA-BSAP，详见中国专利CN102492645A；
(3)高渗缓冲液(SMM液)(mol/L):蔗糖O.5，顺丁烯二酸O. 02，MgCl2 O. 02，用去离子水配制，调pH为7.0 ;
(4)融合剂用SMM液配制质量浓度40%PEG6000，调pH为7. O ;
(5)溶菌酶溶液用SMM高渗液配制成20mg/mL，过滤除菌，_20°C保存；
(6)液体培养基(g/L):蛋白胨10，氯化钠5，牛肉膏5，用去离子水配制，pH7.2，121°C 灭菌 20 min ；
⑵固体培养基(g/L):蛋白胨10，氯化钠5，牛肉膏5，琼脂20，用去离子水配制，pH7. 2，121°C 灭菌 20 min ；
(8)再生培养基(g/L):蛋白胨10，牛肉膏5，NaCl5，琼脂粉40，用SMM液配制，pH
7. 2 ；
(9)转化子再生培养基(g/L):蛋白胨10，牛肉膏5，酪蛋白氨基酸水解物5，葡萄糖6，氯化钠I. 2，琼脂20，卡那霉素O. 05，用SMM溶液配制，pH 7.2;
(10)高产菌株筛选培养基(g/L):可溶性淀粉6，豆柏18，酵母膏24，甘油2.5，K2HPO4 ·3H20 6，CoCl2O. 015，L-亮氨酸-4-硝基苯胺O. 5，卡那霉素O. 05，琼脂20，用去离子水配制，pH 8. O ； (11)种子培养基(g/L):蛋白胨10，氯化钠5，牛肉膏5，用去离子水配制，pH7.2;
(12)发酵培养基(g/L):可溶性淀粉6，豆柏18，酵母膏24，甘油2.5，K2HPO4 · 3H20 6，CoCl2 O. 015，卡那霉素O. 05，用去离子水配制，pH 8. 0，121°C灭菌20 min ；
(13)枯草芽孢杆菌Zj016原生质体制备将培养至对数期的Zj016菌液5000r/min离心10 min,去上清，用无菌生理盐水洗涤菌体2次，SMM液洗涤2次后重悬，然后加入溶菌酶液至酶终浓度为2. O mg/mL, 37°C下振荡酶解30 min, 2000r/min离心收集原生质体,用SMM液洗涤后重悬，重悬液中Zj016原生质体量为8 X IO9个/mL ；
(14)原生质体转化取8X IO9个/mL的枯草芽孢杆菌Zj016原生质体悬液500 μ L，依次加入20 μ L O. I μ g/ μ L的质粒PMA-BSAP及20 μ L的高渗缓冲液SMM，用枪头轻轻吹吸混勻；再加入I. 5mL融合剂,轻轻颠倒混勻后，37°C、80 r/min处理5 min, 2000 r/min离心10 min ;用SMM洗涤2次后重悬；
(15)再生将所得重悬液稀释涂布于转化子再生培养基中，37°C培养24h，得转化子；重组质粒PMA-BSAP自身带有卡那霉素抗性，在转化子再生培养基上长出的菌落即为转化子;
(16)高产菌株筛选初筛将获得的转化子点接于高产菌株筛选培养基上，37°C培养24h，，记录菌落周围颜色的变化产生的时间及其颜色深浅，菌落特征及其变色圈直径大小，根据平板上单菌落周围颜色的变化显著及其变色圈直径的较大者，初步筛选产亮氨酸氨肽酶菌株；
复筛将初筛后的菌株进行摇瓶发酵试验，回转式摇床转速225 r/min，37°C培养30 h，测定酶活。得到一株优良的转化菌株，产酶酶活力达126 U/mL,产酶水平是出发菌Zj016的18倍。B.转化菌摇瓶培养基及发酵条件优化
通过单因素实验考察了碳源、氮源、初始pH、培养温度、装液量，接种量对发酵产酶的影响。得出的最佳条件为可溶性淀粉6 g/L，豆柏18 g/L，酵母膏24 g/L，甘油2 mL/L,K2HPO4 ·3Η20 6g/L，CoCl2 O. 6mmol/L，卡那霉素 O. 05g/L，用去离子水配制；初始 pH 8.0，发酵温度37°C，接种量4%，装液量50mL/250mL。往复式摇床225 r/min，发酵30 h条件下，CGMCC No. 6559发酵产亮氨酸氨肽酶酶活为161 U/mL，达出发菌株Zj016的23倍。本发明的有益效果本发明成功获得一株重组转化菌ZH-Zj016，传代多次实验证明该重组转化菌的遗传性能稳定。初步优化该重组转化菌的摇瓶培养基成分及发酵条件后，重组转化菌ZH-Zj016发酵产亮氨酸氨肽酶酶活为161 U/mL,达原始菌株的23倍。生物材料样品保藏一株高产亮氨酸氨肽酶的重组转化菌，该重组转化菌命名为枯草芽孢杆菌(Macillus subtil is) ZH_Zj016,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号=CGMCC No. 6559，保藏日期:2012年9月7号。
图I原生质体转化选育高产亮氨酸氨肽酶菌株过程示意图 图2原生质体显微观察
图3高产亮氨酸氨肽酶菌株初筛平板 图4不同碳源对产酶的影响 图5不同氮源对产酶的影响 图6初始pH对产酶的影响 图7发酵产酶曲线。
具体实施例方式实施例I
将500 μ L原生质体悬液，分别加入20 μ L O. I μ g/μ L的质粒PMA-BSAP及等体积的SMM缓冲液，用枪头轻轻吹吸混匀；再加入I. 5 mL融合剂，轻轻颠倒混匀后，37°C，80 r/min处理5 min, 2000 r/min离心10 min ;用SMM洗漆2次后重悬,稀释涂布转化子再生培养基，37°C培养24 h，重组质粒PMA-BSAP自身带有卡那霉素抗性，在上述培养基上长出即为转化子。将获得的转化子点接于高产菌株筛选培养基上，经初筛37°C培养24h，记录菌落周围颜色的变化产生的时间及其颜色深浅，菌落特征及其变色圈直径大小，根据平板上单菌落周围颜色的变化显著及其变色圈直径的较大者，筛选产亮氨酸氨肽酶菌株。将初筛后的菌株进行摇瓶发酵试验，回转式摇床转速225 r/min，37°C培养30 h，测定酶活。得到一株优良的转化菌株，产酶酶活力达126 U/mL,产酶水平是出发菌Zj016的18倍。摇瓶培养基及发酵条件优化在可溶性淀粉6 g/L，豆柏18 g/L，酵母膏24 g/L，甘油 2mL/L，K2HPO4 · 3H20 6 g/L, CoCl2 O. 6 mmol/L，卡那霉素 O. 05g/L，用去离子水配制；发酵条件为初始PH 8.0，发酵温度371，接种量4%，装液量50111172501^，往复式摇床225 r/min，发酵30 h条件下，重组转化菌ZH-Zj016发酵产亮氨酸氨肽酶酶活为161 U/mL，达原始菌株的23倍。
权利要求
1.一种原生质体转化选育高产亮氨酸氨肽酶菌株的方法，其特征在于 (1)转化利用原生质体转化技术，将8X IO9个/mL的枯草芽孢杆菌ZjOie原生质体悬液500 μ L，依次加入20 μ L O. I μ g/ μ L的质粒PMA-BSAP及20 μ L的高渗缓冲液SMM，用枪头轻轻吹吸混勻；再加入I. 5 mL融合剂,轻轻颠倒混勻后,37°C、80r/min处理5min,2000 r/min离心10 min ;用SMM洗涤2次后重悬； 所述高渗缓冲液SMM以mol/L计为蔗糖O. 5，顺丁烯二酸O. 02，MgCl2 O. 02，用去离子水配制，调pH为7.0 ; 所述融合剂为40% PEG6000，用SMM液配制，调pH为7. O ; (2)再生将步骤(I)所得重悬液稀释涂布于转化子再生培养基中，37°C培养24h，得转化子； 所述转化子再生培养基以g/L计为蛋白胨10，牛肉膏5，酪蛋白氨基酸水解物5，葡萄糖6，氯化钠I. 2，琼脂20，卡那霉素O. 05，用SMM溶液配制，pH 7.2; (3)筛选挑选步骤(2)所得转化子划线涂布于高产菌株筛选培养基，成功选育获得高产亮氨酸氨肽酶菌株； 所述高产菌株筛选培养基以g/L计为可溶性淀粉6，豆柏18，酵母膏24，甘油2. 5，K2HPO4 · 3H20 6，CoCl2 O. 015，L-亮氨酸-4-硝基苯胺O. 5，卡那霉素O. 05，琼脂20，用去离子水配制，pH 8. O0
2.用权利要求I所述原生质体转化选育高产亮氨酸氨肽酶菌株的方法获得一株高产亮氨酸氨肽酶的重组转化菌，该重组转化菌分类命名为枯草芽孢杆菌OfeCiJAASsubtil is) ZH-Z j016,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号CGMCC No. 6559，其产酶酶活力达126 U/mL,产酶水平是出发菌Zj016的18倍，传代多次实验证明该重组转化菌的遗传性能稳定。
3.用权利要求2所述CGMCCNo. 6559菌株发酵产亮氨酸氨肽酶的方法，其特征在于通过单因素实验对该转化菌的摇瓶培养基成分及发酵条件初步优化后，在摇瓶培养基成分为:可溶性淀粉 6 g/L，豆柏 18 g/L，酵母膏 24 g/L，甘油 2 mL/L, K2HPO4·3Η20 6g/L，CoCl2O.6mmol/L,卡那霉素O. 05g/L,用去离子水配制；发酵条件为初始pH 8. O,发酵温度37°C,接种量4%，装液量50mL/250mL，往复式摇床225 r/min，发酵30 h条件下，CGMCC No. 6559发酵产亮氨酸氨肽酶酶活为161U/mL，达出发菌株Zj016的23倍。
全文摘要
一种原生质体转化选育高产亮氨酸氨肽酶菌株的方法，属于酶制剂、食品添加剂技术领域。本发明利用原生质体转化技术将重组质粒PMA-BSAP与从枯草芽孢杆菌Zj016所制备的原生质体混合于高渗缓冲液中，在PEG介导下，使原生质体与PMA-BSAP发生相互凝聚，进行遗传转化，适宜的条件下再生细胞壁，成功获得一株重组转化菌ZH-Zj016，该重组转化菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.6559；传代多次实验证明该重组转化菌的遗传性能稳定。初步优化该重组转化菌的摇瓶培养基成分及发酵条件后，重组转化菌ZH-Zj016发酵产亮氨酸氨肽酶酶活为161U/mL，达原始菌株的23倍。
文档编号C12N9/48GK102876705SQ20121041860
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月29日 优先权日2012年10月29日
发明者田亚平, 汪晓东, 高新星 申请人:江南大学
文档序号 :
【 414344 】
技术研发人员：田亚平,汪晓东,高新星
技术所有人：江南大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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技术研发人员：田亚平,汪晓东,高新星
技术所有人：江南大学
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