应激评价方法
技术领域：
本发明涉及用于应激评估的方法，该方法目的是检测外周组织中Perl 基因表达水平、Perl基因、由Perl基因编码的蛋白质PERI的任何增加， 以及Perl基因的转录物或PERI作为应激检测的标记物的用途。
背景技术：
包括从单细胞生物体到人的所有有生命的生物体普遍地具有昼夜节 律，该昼夜节律是基于24小时周期的活体现象或生物学节律。它们还具有 控制该昼夜节律的基因。
在哺乳动物中，昼夜节律控制基因主要在下丘脑的视交叉上核(SCN)中 表达并在个体昼夜节律的控制中起着重要作用。在有生命的生物体中它也 在其它组织中表达，从而以与中枢相同的方式控制细胞和组织的昼夜节律。
已知昼夜节律控制基因包含Per基因(Perl、 Per2和Per3)、时钟基因 (Clock gene)、Bmal基因(Bmal 1 、 Bmal 2和Bmal 3)、 Cry基因、Dec基因(Decl 和Dec2)、 Dbp基因、E4Bp4基因、和Rev-erb基因(Rev-erb "和Rev-erb
日本专利公开第2000-275248号先于本发明，其披露了通过测量唾液中 的皮质醇用于确定慢性应激的方法。顺便提及，本发明采用SokoloveP.G.和 Bushell W.N.( 1978)J Theor Biol. 72， 131 -160作为后面提到的其非专利文献举 例的参考。
发明内容
发明概述
由于将时钟基因和应激相联系的分子反应机制还不明确，所述机制不
同于确信存在于哺乳动物中的涉及应激反应性的昼夜节律控制机制，因此 有必要阐明该机制。
本发明人基于他们的以下发现完成这项发明应激伴随外周组织内 Perl基因表达水平的增加，应激反应不改变外周组织中的昼夜节律，以及
达水^。、，、— ,、'、、；
前述发现提示了下述应激反应机制的存在。施加到个体生物体的任何 应激导致肾上腺皮质分泌糖皮质激素以循环进入身体的每一部分。并且
而增加。也就是说，应激通过与例如时钟基因表达和昼夜节律不同的机制 来增加Perl基因的表达水平。
上述发现对于应激评价是有用的。也就是说，将有可能通过检测 mRNA和PER1的增加或确定其量来检测应激的存在或缺乏，或评价应激的 程度，mRNA是外周组织中Perl基因的转录物，PER1是由Perl基因编码 的蛋白质。
检测Perl基因的转录物可通过合成总RNA或从外周组织中提取总 RNA，以及将具有Perl碱基序歹'J(或其部分)的多核苷酸(作为检测探针)与提 取或合成的核酸杂交来完成。并且，PER1(蛋白质)的检测也可通过涉及特 异性结合PER1的抗-PERl抗体的抗原-抗体反应来完成。
可从NCBI(国家生物技术信息中心)的基因数据库得到Perl基因的碱 基序列和归因于Perl基因的氨基酸序列的信息。例如，序列No.l显示人 Perl基因同源物的碱基序列，而序列No.2显示小鼠Perl基因的碱基序列。 依据本发明实施方案的Perl基因不仅包含各种动物中Perl基因的同源物的 序列，还包含那些部分具有替代、缺陷、插入和添加的序列。
本发明的实施方案提供了对应激的客观和精确评价。
图1A是显示实施例1中小鼠在应激下在一天内如何改变其活动的活 动变化记录图1B是图表，用图表表示实施例1中图IA的活动变化记录图中观察 到的小鼠的昼夜节律的平均值；图1C是显示实施例1中施加应激前后》见察到的活动性比率的变化的
图1D是显示实施例1中施加应激后直到再同步的天数的图； 图2A是显示实施例2的昼夜节律周期中肝脏内时钟基因表达量如何改 变的图2B是显示实施例2的昼夜节律周期中心脏内时钟基因表达量如何改 变的图2C是显示实施例2的昼夜节律周期中肾脏内时钟基因表达量如何改 变的图3A是显示实施例3中肝脏内时钟基因表达量的图3B是显示实施例3中心脏内时钟基因表达量的图3C是显示实施例3中肺内时钟基因表达量的图3D是显示实施例3中肾脏内时钟基因表达量的图4A是显示实施例4中GRE类似序列及其邻近的序列的图4B是显示实施例4中的序列上每个启动子的位置的示意图4C是显示实施例4中荧光素酶分析的结果的图4D是显示当GRE类似序列改变时荧光素酶分析的结果的图5A是描述实施例5中Perl基因的序列的示意图5B是显示用于通过半定量RT-PCR检测所需序列的电泳的照片，所
述半定量RT-PCR在通过实施例5中的ChIP方法得到的免疫沉淀物上进行； 图5C是显示在通过实施例5中ChIP方法进行免疫沉淀之后通过定量
实时RT-PCR来检测所需序列的实验结果的图6A是显示用于通过半定量RT-PCR检测所需序列的电泳的照片，所
述半定量RT-PCR在通过实施例6中的ChIP方法得到的免疫沉淀物上进行； 图6B是显示在通过实施例6中ChIP方法进行免疫沉淀之后通过定量
实时RT-PCR来检测所需序列的实验结果的图7A是显示实施例7中皮质酮剂量和Perl基因表达量之间的相关性
的图7B是显示实施例7中通过施用皮质酮(IO mg/kg)谦导的每个时钟基 因表达量的图；和
图8是显示与本发明的实施方式相关的应激反应的机制的示意图。
具体实施方式
实施例1
这个实施例的目的是通过分析由红外线活动记录装置(Biotex制造)记 录的小鼠活动的数据，来研究小鼠在应激下一天内如何改变其活动。
通过使BALB/c系小鼠在配备有红外线活动记录装置的笼内在黑暗中 自由活动24小时，将小鼠的活动记录在活动变化记录图上，此前该小鼠已 对12小时间隔的明亮和黑暗环境(前者从8点持续到20点)的昼夜节律适应 2周。在连续的两天内，在它的自由奔跑过程中，小鼠在指定时间被给予l 小时的应激。顺便提及，活动变化记录图是显示小鼠的连续活动的记录。 所得到的活动变化记录图通过"卡方周期图(periodgram)"方法进行分析(见 非专利文献)。
图1A是显示小鼠在应激下在一天内如何改变其活动的活动变化记录 图。图1顶部的数字显示测量时间。顶部下方的黑色和灰色线分别显示小 鼠在开始自由奔跑之前经历的明亮和黑暗环境的时间。图1中第二行和随 后的行显示两天的活动变化记录，每一点代表检测到的活动的数量。
图1中，"CT2"、 "CT5"、和"CT15，'分别表示昼夜节律时间的2点、 5点、和15点。昼夜节律时间意味着小鼠的主观时间。由于小鼠是夜间活 动的，如果它交替经历以12小时为间隔的明亮和黑暗环境，明亮环境开始 于昼夜节律时间的0点。可替换地，如果明亮和黑暗环境以24小时的间隔 转换，小鼠由于昼夜节律而开始减少其活动(或开始睡觉)的时间被看作O点。
每一活动变化记录有两个黑色遮盖的部分。它们代表^4加应激的时间 区。即，"CT2"、 "CT5"、和"CT15"的活动变化记录分别显示，在小鼠被 置于每天24小时的黑暗中后，在第20天和第21天的1-2点、4-5点、和 14-15点(昼夜节律时间)施加应激。
由图1A表明，应激下的小鼠不改变它的昼夜节律。
图1B是图表，其用图表表示从图1A的活动变化记录图中观察到的小 鼠的昼夜节律周期的平均值。纵轴上的"时间(小时)"表示小鼠的昼夜节律 周期(或小鼠主观的一天的长度)"。横轴上的"PrS"和"Pos，，分別表示施加 应激前的昼夜节律周期和施加应激后的昼夜节律周期。"应激"表示施加或 没有施加应激。"CT2"、 "CT5"、和"CT15"的定义如上。
图1B表明，施加应激前后昼夜节律周期改变非常少。
图1C是显示施加应激前后观察到的活动性比率的变化的图。纵轴上
的"活动性比率(％)"表示施加应激后3天的活动性值被施加应激前10天 的活动性值除所获得的值(％)。"应激"表示施加或没有施加应激。"CT2"、 "CT5"、和"CT15，'定义如上。
图1C表明，未施加应激组(对照)和施加应激组之间活动性比率差异很小。
图1D是显示施加应激后直到再同步的天数的图。该图是基于这样的 实验，该实验的目的为研究当把小鼠交替置于以12小时为间隔(从8到20 点为明亮环境)的明亮环境和黑暗环境中、然后给予应激并最终提前6小时 置于明亮环境中(从2到14点为明亮环境)时，需多少天使其昼夜节律再次 同步(resynchronize)。
纵轴上"直到再同步的天数，，表示当小鼠置于明亮环境中的时间改变 后为了再同步所需的天数。"ZT2"表示在1-2点(授时因子时间)(Zeitgeber time)给予应激的组。同样地，"ZT15"表示在14-15点给予应激的组。"ctrl" 表示未给予应激的组(对照)。此处，"授时因子时间"表示定时系统的时间， 其中当明亮环境和黑暗环境以12小时为间隔重复时，明亮环境开始于0点。
由图1D表明，ZT15和对照之间直到再同步的天数差异非常小，尽管 ZT2缺乏一致性。
实施例1的结果提示，施加应激对受试个体小鼠的昼夜节律改变很少。 实施例2
这个实施例是为了研究在昼夜节律周期中当施加应激时，时钟基因的 表达量如何变化。
每个小鼠在指定时间给予一小时的应激，然后从施予应激后12小时 开始以4小时的间隔采集其器官(肝脏、心脏和肾脏)。所采集的器官被均质 化以使用Promega总SV RNA分离试剂盒(来自Promega)提取总RNA。提取 的总RNA用于通过定量实时RT-PCR来确定mPerl 、 mPer2、和Bmall基因
的表达量。
将这样获得的显示表达量随时间的改变的数据绘图，用于通过基于以 下公式的"余弦拟合曲线，，方法而拟合。<formula>formula see original document page 8</formula>该结果在图2A到2C中显示。
图2A是显示肝脏内时钟基因表达量在昼夜节律周期中如何改变的 图。图2B是显示心脏内时钟基因表达量在昼夜节律周期中如何改变的图。 图2C是显示肾脏内时钟基因表达量在昼夜节律周期中如何改变的图。
在图2A到2C中，"mPerl"、 "mPer2，，、和"mBmall"分别表示在昼 夜节律周期中，mPerl、 mPer2、和mBmall的表达量如何改变。顺便提及， 附加于每一基因名称的前缀"m"代表小鼠(Mus musculus)。并且，在图2A 至2C中，"ctrl"表示未给予应激的组(对照)，"ZT2"表示以授时因子时间 在l-2点给予应激的组，和"ZT15"表示以授时因子时间在14-15点给予应 激的组。横轴上的数字代表器官被采集的时间。
图2A到2C表明，每个时钟基因表达量有变化，但给予应激的组("ZT2" 和"ZT15")和未给予应激的组("ctrl")之间在昼夜节律相移上差异很小。
因此，实施例2的结果表明，就时钟基因表达水平而言，施加应激导 致昼夜节律相位的极小改变。
这个实施例是为了研究当施加应激时每一器官内时钟基因表达量如 何改变。
每个小鼠在指定时间给予一小时的应激，然后从施予应激后12小时 开始以4小时的间隔采集其器官(肝脏、心脏、肺和肾脏)。所采集的器官被 均质化以使用Promega总SVRNA分离试剂盒(来自Promega)提取总RNA。 提取的总RNA用于通过定量实时RT-PCR来确定每一时钟基因的表达量。
该结果在图3A到3D中显示。
图3A是显示肝脏内时钟基因表达量的图。图3B是显示心脏内时钟基 因表达量的图。图3C是显示肺内时钟基因表达量的图。图3D是显示肾脏 内时钟基因表达量的图。
在图3A到3D中，"Perl"、 "Per2" 、 "Per3"、 "Bmall" "Npas2"、 "Cryl"、
实施例3
"Cry2"、 "Decl"、 "Dec2"、 "Dbp"和"E4bp4"分别表示每个时4中基因的 表达量。并且，黑条表示未给予应激的对照组中时钟基因的表达量，以及 白条表示给予应激的组中时钟基因的表达量。橫轴上的数字代表采集器官 的对间，纵轴上的数字表示表达量(相对值)。
由图3A到3D表明，施加应激引起每个器官内Perl基因表达量的增 加，但不引起每个器官内其它时钟基因表达量的增加。
从上述实施例1到实施例3总结出，就个体的活动性节律或时钟基因 表达水平而言，不管是否施加应激，昼夜节律保持稳定，而Perl基因在外 周组织内的表达水平在施加应激后立即增加。
前述结论提示了通过使用作为指标的Perl基因在外周组织中的表达 水平来客观评估应激的可能性。
并且，前述实施例中实验的结果提示， 一旦施加应激，Perl的表达水 平通过新的转录控制4几制增加，该4几制与通过已知启动子(例如E-box和 CRE)的途径、例如Bmal/时钟-E-box途径和CRE-CREB途径不同。
实施例4
这个实施例是为了研究与应激反应相关的Perl基因的启动子。
第 一步是基于基因组信息，对Per 1基因启动子区域进行计算机上的(in silico)序列分析。其结果表明，在所有人、大鼠和小鼠的启动子区域的序 列中都有四组E-box和两组DBPE (Dbp-结合元件)，并且有两个GRE(糖皮 质激素反应性元件)类似序列(以下将称作"GRE类似序列")。
顺便提及，E-box不仅存在于Perl基因的启动子区域，还存在于Per2 和Dbp基因的启动子区域。此外，DBPE还存在于Per3基因的启动子区域。
图4A是显示GRE类似序列和它的邻近序列的图。图4B是显示序列 上每个启动子的位置的示意图。
图4A和4B中，"远侧GRE"和"近侧GRE"分别表示两组GRE类 似序列的上游序列和下游序列。而且，"H"、 "R，，和"M，，分别表示人、大 鼠和小鼠的序列。加下划线的序列是类似GRE的序列。"Exl"和"Ex2" 分别表示外显子1和外显子2。
图4B中，"E-box"、 "GRE"、和"CRE，，分别表示E-box、 GRE类似 序列、和CRE在Perl基因的启动子区域中存在的位置。
第二步是萤光素酶分析，以研究Perl启动子区域的什么部分与应激反 应相关。
萤光素酶是一种催化生物发光的酶蛋白。它可用于通过以下方式估计 特定基因的表达被诱导的水平。首先，制备重组基因，该重组基因中特定 基因的启动子区域与编码荧光素酶的基因连接。第二，将重组的基因掺入 培养的细胞。第三，允许该基因进行表达，这样使荧光素酶能够表达。第 四，测定由焚光素酶引起的生物发光的强度以获得荧光素酶表达的水平。
以前述原理为基础进行了实验。它包括制备数种DNA，所述DNA在 Perl启动子区域长度上有所不同，以及当存在地塞米松时测定Perl的表达 水平。这样获得的结果揭示了 Perl基因启动子区域的什么部分与应激反应 相关。顺便提及，地塞米松是合成的糖皮质激素。已知当有生命的生物体 经历应激时，血液中糖皮质激素的量增加。
实验的步骤概述如下。(l)第一步是制备DNA (P1F、 P1K、和P1S)， 第一个具有Perl基因启动子区域的全长，第二个和第三个具有Perl基因启 动子区域的部分长度，上游侧被切掉。如图4B所示，P1F的截断位置在距 离Perl基因转录起始区域上游6301个碱基处，P1K的截断位置在上游3806 个碱基处，以及P1S的截断位置在上游2369个碱基处。
(2) 第二步是通过将前述DNA导入焚光素酶发光载体pGL3 basic (来自 Promega)而制备重组载体。所得到的重组载体具有特定长度的启动子区域和 编码荧光素酶基因的区域。
(3) 第三步是将重组载体(第二步(2)中制备)转染到培养的NIH3T3细胞 中并加入地塞米松(O.l jaM)。已经转染的培养细胞被分离和次代培养以表达 荧光素酶。次代培养的细胞在转染后36小时被采集和溶解。
(4) 第四步是从溶解的细胞来制备溶液和通过二重荧光素酶分析系统 (来自Promega)测量发光强度。从而能够得知地塞米松诱导Perl基因表达的 程度。
该结果如图4C所示。
图4C是显示荧光素酶分析结果的图。横坐标(相对荧光素酶活性)用与 指定为100的、掺入Perl基因启动子全长的培养细胞的发光强度相比的相 对值(％)来代表发光强度。
"P1F"表示源自掺入Perl基因启动子区域全长的培养细胞的发光强
度。"P1K"表示源自掺入Perl基因转录起始区域上游3806个碱基的部分 长度的培养细胞的发光强度。"PIS"表示掺入Perl基因转录起始区域上游 2369个碱基的部分长度的培养细胞的发光强度。"载体"表示掺入空白载体 的培养细胞(对照)的发光强度。图4C的右侧部分为描述已掺入的DNA的 示意图。"Dex"和"EtOH"分别表示包含地塞米松的样本和包含乙醇的样 本(对照)的发光强度。
图4C表明，地塞米松导致"P1K"样本的高发光强度和"PIS"样本 一定的发光强度。
考虑到"P1K"样本中使用的启动子序列具有两个GRE类似序列，以 及"PIS"样本中使用的启动子序列具有一个GRE类似序列的事实，该实 验的结果提示，计算机分析中发现的GRE类似序列可能与Perl基因的应激 反应有关。
进行后续的实验来研究当在计算机分析中发现的两个GRE类似序列 中的两个或任一个上实施突变时，是否以与图4C所示相同的方式诱导表达。 首先，如下制备四个DNA样本
Perl基因启动子区域在其全长上保持完好的DNA(P1F); P1F的GRE 类似序列在其上游发生突变的DNA(PlFdM); P1F的GRE类似序列在其下 游发生突变的DNA (PIFpM);和两个GRE类似序列都发生突变的DNA (PlFd/pM)。每个DNA样本以与如上所述相同的方式掺入荧光素酶发光载 体。将该载体转染至培养的NIH3T3细胞内，随后给予该培养细胞0.1 的地塞米松。转染后36小时，将传代培养的细胞采集和溶解。用二重荧光 素酶分析系统(来自Promega)检测所得溶液的发光强度。该实验揭示了地塞 米松诱导Perl基因表达的程度。 该结果如图4D所示。 "P1F"表示掺入Perl基因启动子区域全长的培养细胞的发光强度。 "PIFdM"表示掺入P1F的培养细胞的发光强度，所述PIF具有在其上游 发生突变的GRE类似序列。"PIFpM"表示掺入P1F的培养细胞的发光强 度，所述P1F具有在其下游发生突变的GRE类似序列。"PlFd/pM"表示掺 入P1F的培养细胞的发光强度，所迷P1F具有其上游和其下游都发生突变 的GRE类似序列。
图4D表明，包含地塞米松的PlFpM样本产生高发光强度，而PIFdM
样本产生较低的发光强度。这个结果提示，存在于Perl基因启动子区域内
的GRE类似序列，特别是存在于其下游的GRE类似序列，与应激反应密切 相关。
实施例5
这个实施例的目的是使用ChIP(染色质免疫沉淀)方法研究Perl基因的 GRE类似序列在NIH3T3细胞内是否结合至糖皮质激素受体(以下简称GR)。
首先，用地塞米松处理NIH3T3细胞以诱导mPerl基因的表达。细胞 被给予甲醛以固定蛋白质和染色质DNA的结合。使用超声波处理使染色质 DNA成为碎片，将得到的碎片与抗GR抗体进行免疫沉淀。回收得到的沉 淀(作为抗GR抗体、GR、和与GR结合的染色质DNA的复合物)。加热回 收的沉淀以去除DNA-蛋白的交联。通过PCR扩增所需序列，并用电泳鉴 别PCR产物。
图5A是描述Perl基因序列的示意图。
图5A中置于"dGRE"和"pGRE"上方的三角标记代表对应于用于 PCR的引物的序列区域。换言之，引物被如此设计以特异性扩增两个GRE 类似序列附近的区域。
图5B是显示通过半定量RT-PCR检测所需序列的电泳的照片，该半定 量RT-PCR在由ChIP方法得到的免疫沉淀物上进行。
图5B中，"IP: cc-GR"表示用抗-GR抗体免疫沉淀后通过半定量 RT-PCR检测到的所需序列。"IP: ct-正常兔IgG"表示用兔IgG从免疫沉淀 反应中检测到的序列(对照)。此外，"输入"表示不经免疫沉淀反应通过半 定量RT-PCR检测到的所需序列(对照)。最下行中的"ChIP引物"表示用于 半定量RT-PCR的引物序列或已被扩增的所需序列。"dGRE"和"pGRE" 分别表示扩增的来自存在于Perl基因启动子区域内两个GRE类似序列的上 游序列和下游序列。"mPer2"表示作为对照的扩增的mPer2基因。"Ohr" 表示当未用地塞米松处理时立即加入曱醛获得的结果。"lhr(Dex)"表示当 用地塞米松处理1小时后加入甲醛获得的结果。"lhr(EtOH)"表示当用乙醇 (用作对照)处理1小时后加入甲醛获得的结杲。
图5C是显示在通过ChIP方法进行免疫沉淀之后通过定量实时 RT-PCR检测所需序列的实验结果的图。
纵座标上的"％ l命入"代表PCR产物中扩增的所需DNA的量。其它 符号与图5B中的那些相同。
由图5B显示，在地塞米松处理和随后借助抗a-GR抗体进行免疫沉 淀反应后，当表示为"dGRE"和"pGRE"的序列通过PCR扩增时，检测 到所需区带(见图5B上部的电泳照片)。
由图5C显示如果在地塞米松处理和随后借助抗cc-GR抗体进行免疫 沉淀反应后进行PCR， PCR极大地扩增了包含表示为"dGRE"和"pGRE" 的序列的DNA。
这个结果提示，糖皮质激素受体(GR)结合至来自Perl基因的启动子区 域的两个GRE类似序列。
实施例6
除了用从经历过应激的小鼠采集的肝脏代替NIH3T3细胞外，重复与 实施例5相同的步骤。
从已经历1小时应激然后休息1小时的小鼠采集肝脏。采集的肝脏通 过与实施例5中相同的方式处理以产生具有所需基因序列的PCR产物。
图6A是显示通过半定量RT-PCR检测所需序列的电泳的照片，该半 定量RT-PCR在通过ChIP方法得到的免疫沉淀物上进行。图6A中的符号 与图5B中的那些相同。
图6B是显示在通过ChIP方法进行免疫沉淀之后通过定量实时 RT-PCR检测所需序列的实验结果的图。图6B中的符号与图5C中的那些相 同。
由图6A和6B显示即使在小鼠实际上经历应激的情况下，糖皮质激素 受体(GR)也与来自Perl基因的启动子区域的两个GRE类似序列结合。
从图6A和6B所示的结果发现，GR更多地与存在于Perl启动子区域 内的两个GRE类似序列的上游部分结合。
实施例7
这个实施例目的是研究给予了皮质酮的小鼠中Perl的表达量。 给予小鼠指定量的皮质酮，1小时后其肝脏被取出。所采集的肝脏被 均质化以通过与实施例2相同的方法进行定量实时RT-PCR,并测定时钟基
因的表达量。
图7A是显示皮质酮剂量和Perl基因表达量之间的相关性的图。 横坐标代表每lkg小鼠重量的皮质酮剂量(mg/kg)。 "PBS"表示对照，
其被给予磷酸盐緩沖溶液以代替皮质酮。纵座标上的"谦导倍数"代表Perl
基因的表达量(用相对值表示，以PBS的值为1)。
由图7A显示，Perl基因的表达量随皮质酮剂量的增加而增加。
图7B是显示通过施予皮质酮(10mg/kg)诱导的每个时钟基因表达量的图。
横坐标代表每个时钟基因。纵坐标上的"诱导倍数"代表用相对值表 示的每个时钟基因的表达量，以PBS的值为1。
由图7B显示，施予皮质酮在时钟基因中仅增加Perl基因的表达量。 换言之，这个实验的结果提示，施加应激所引起的Perl基因的表达受与昼 夜节律调节完全不同的机制诱导。
上述实施例1到实施例7中实验结果提示了如图8中所示的应激反应 性机制的存在。
由图8显示，在Perl基因的启动子区域中不仅存在E-box和CRE，还 存在GRE类似序列。
一旦施加应激，糖皮质激素就从肾上腺皮质分泌并输送至整个身体。 然后，糖皮质激素结合至存在于外周组织中的GR。所得到的产物结合至 Perl基因启动子区域中存在的GRE类似序列。这是诱导Perl基因表达的机 制。
顺便提及，E-box和CRE的序列与应激反应性机制无关。因此，它们 不诱导具有其它序列的其它时钟基因的表达。因此，即使施加应激，昼夜 节律(或内部身体钟(internal body clock))改变极小。
依据本发明实施方案用于评价应激的方法可通过使用与已知的应激 反应性机制完全不同的新机制来检测应激。关于本发明实施方案的基因转 录物和蛋白质可用作应激检测的标记物。此外，关于本发明实施方案的多 核苷酸和抗体可应用于DNA芯片、蛋白质芯片、以及应激评价试剂盒。
本领域技术人员应当理解，根据设计要求和其它因素，可以进行各种 改良、组合、再组合和改变，只要它们在所附权利要求或其等效物的范围 内。
权利要求
1.一种应激评价方法，其被设计为检测Per1基因表达水平的任何增加。
2. 如权利要求1中所限定的应激评价方法，其被设计为检测外周组织中 表达水平的任何增加。
3. 在施加应激时表达水平增加的Perl基因。
4. 如权利要求3中所限定的Perl基因，其在外周组织中表达水平增加。
5. 如权利要求3中所限定的Perl基因，其依赖于糖皮质激素反应性元件 而增力口。
6. 具有权利要求3中所限定的Perl基因的碱基序列或其部分的多核芬甘酸。
7. 权利要求3中所限定的Perl基因的转录产物作为应激检测标记物的 用途。
8. PER1，其为由权利要求3中所限定的Perl基因编码的蛋白质。
9. 特异性结合权利要求8中所限定的PER1的抗-PER1抗体。
10. 权利要求8中所限定的PER1作为应激检测标记物的用途。
全文摘要
基于以下发现阐明了联系时钟基因与应激的分子反应机制应激伴随外周组织中Per1基因表达水平的增加，应激反应不改变外周组织的昼夜节律，以及Per1基因依赖存在于其启动子区域内的糖皮质激素反应性元件而增加其表达水平。这个发现被用于应激评价。即，通过检测和确定外周组织中Per1基因转录物(mRNA)的增加(Per1基因编码的蛋白的增加)，可评价应激的存在或缺乏或程度。
文档编号C12Q1/68GK101165192SQ20061006414
公开日2008年4月23日 申请日期2006年10月18日 优先权日2005年10月18日
发明者中畑泰和, 内匠透, 山本拓郎, 相马温彦 申请人:索尼株式会社
文档序号 :
【 441957 】
技术研发人员：山本拓郎,相马温彦,内匠透,中畑泰和
技术所有人：索尼株式会社
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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技术研发人员：山本拓郎,相马温彦,内匠透,中畑泰和
技术所有人：索尼株式会社
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