基于应激蛋白寡聚化的方法和产品的制作方法
1.引言本发明涉及免疫学、疾病的免疫治疗、应激蛋白介导的免疫调节和疫苗开发领域。更特别地，本发明涉及测定热休克蛋白-肽复合物的生物活性的方法和筛选调节热休克蛋白-肽复合物生物活性的试剂的方法。本发明也涉及通过促进其寡聚化而增强免疫治疗部分，例如热休克蛋白-肽复合物的免疫原性的方法。
2.发明背景在现代医学中，免疫治疗或疫苗接种已经实际上消除了例如脊髓灰质炎、破伤风、肺结核、水痘、麻疹、肝炎等疾病。使用接种疫苗的方法利用了免疫系统预防传染性疾病的能力。用非活的物质，例如蛋白质接种疫苗一般导致抗体应答或CD4+辅助T细胞应答。Raychaudhuri和Morrow(1993)Immunology Today 14344-348。另一方面，接种疫苗或用活的物质，例如活细胞或传染性病毒感染一般导致CD8+细胞毒性的T-淋巴细胞(CTL)应答。CTL应答对于预防癌症、传染性病毒和某些细菌是决定性的。这提出了实际的问题，获得CTL应答的唯一方式是使用本身为病原体的活因子。该问题一般通过使用减弱的病毒株和菌株或通过杀死可用作疫苗接种的完整细胞而避免。这些策略已经很好地进行，但是使用减弱毒株总是携带了该减弱的因子可能与宿主DNA基因重组而变成强毒株的风险。因此，需要可以通过用非活的物质，例如蛋白质以特异的方式接种疫苗来诱导CD8+CTL应答的方法。已经发现热休克蛋白-肽复合物具有作为抗癌和抗传染性疾病疫苗的特别用途。(Srivastava等人，(1994)Curr.Op.Imbu.6728；Srivastava(1993)Adv.Cancer Res.62153)。
热休克蛋白(hsps)，也称为应激蛋白，最初被鉴定为是细胞针对热休克反应合成的蛋白质。已经根据它们的分子量将Hsps分类为几个家族，例如，hsp90、hsp70、hsp60、sm hsp等，并且每个家族由大约1-5个紧密相关的蛋白质组成。Srivastava，2002，Annu.Rev，Immunol.20395-425。尽管家族内的成员是紧密相关的，但在个别的hsp家族间只有一点或几乎没有明显的同源性。热休克蛋白在所有形式生命的所有细胞中和在多种胞内位置表达。它们在正常情况下大量表达并且它们的表达可作为热休克或其他形式应激，包括暴露于毒素、氧化性应激、缺乏葡萄糖等的结果而被有力地诱导到很高的水平，(参见Srivastava，2002，Annu.Rev.Immunol. 20395-425)。
对热休克和其他生理应激反应的细胞应答的研究显示hsps不仅参与在细胞对这些不利条件的防护中，而且参与在无应力细胞中实质的生物化学和免疫方法中。Hsps实现各种伴护功能。例如，定位于细胞胞质、细胞核、线粒体或内质网(Lindquist等人，1988，Ann.Rev.Genetics 22631-677)的hsp70家族的成员，参与对细胞免疫系统的抗原呈递，并且也参与正常细胞中蛋白质的传递、折叠和装配。Hsps也能够结合蛋白质或肽，并在存在腺苷三磷酸(ATP)或低pH时释放结合的蛋白质或肽。
Srivastava等人已经证明了近交小鼠对甲基胆蒽-诱导的肉瘤的免疫应答(Srivastava等人，1988，Immunol.Today 978-83)。在这些研究中，发现负责这些肿瘤的个别独特的免疫原性的分子是96kDa的糖蛋白(gp96)和84-86kDa的胞内蛋白质(Srivastava等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 833407-3411；Ullrich等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 833121-3125)。用分离自特定肿瘤的gp96或hsp84/86免疫小鼠使得该小鼠对该特定的肿瘤免疫，但不对抗原性独特的肿瘤免疫。对编码gp96和hsp84/86的基因的分离和表征显示它们之间有显著的同源性，并且显示gp96和p84/86分别是相同的热休克蛋白在内质网网状和胞质中的对应物(Srivastava等人，1988，Immunogenetics 28205-207；Srivastava等人，1991，Curr.Top.Microbiol.Immunol. 167109-123)。进一步地，显示hsp70引发对从中分离出它的肿瘤的免疫性，但不是对抗原性独特的肿瘤的免疫性。然而，发现缺乏hsp70的肽丧失了它的免疫原活性(Udono和Srivastava，1993，J.Exp.Med.1781391-1396)。这些观察表明，热休克蛋白本身不是免疫原性的，但是与抗原性肽形成非共价的复合物，并且该复合物可引发对该抗原性肽的特异性免疫(Srivastava，1993，Adv.Cancer Res.62153-177；Udono等人，1994，J.Immunol.，1525398-5403；Suto等人，1995，科学Science 2691585-1588)。
这些现象已经在含有已知和未知抗原的肿瘤和病毒模型中观察到(Srivastava等人(1998)Immunity 8657；Ciupitu等人(1998)J.Exp.Med.5685；Arnold等人(1995)J Exp.Med.182885)。与gp96、hsc70和hsp84/hsp86结合的抗原性肽的存在已经在该抗原性肽是已知的细胞中从结构上得到证明(Nieland等人(1996)Proc. Nat′L.Acad.Sci.USA 936135；Breloer等人(1998)Eur.J.Immunol.281016；Ishii等人(1999)Immunol.J.1621303)。用热休克蛋白-肽复合物接种疫苗适用于预防(Srivastava等人(1986)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 833407；Ullrich等人(1986)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 833121；Peng等人(1997)J.I.Meth.20413；Basu和Srivastava(1999)J.Exp.Med.189797)和治疗癌症(Tamura等人(1997)Science 278117；Yedavelli等人(1999)Int.J.Mol.Med.3243)并用于预防传染性疾病(Ciupitu等人(1998)J.Exp.Med.5685)。对人癌症免疫治疗的途径的转换目前正在研究中，该研究使用gp96复合物(Janetzki等人(1998)J.Immunother.4269；Amato等人(1999)ASCO会议，摘要1278；Lewis等人(1999)ASCO会议摘要1687)或hsp70复合物作为自体同源的疫苗并且使用个别患者的癌症作为热休克蛋白源(Ménoret和Chandawarkar(1998)Semin.in Oncology 25654)。
几个hsps，包括hsp104、hsp90、hsp70和hsp60已经显示具有ATP酶活性(Scheibel等人(1997)J.Biol.Chem.27218608-18613；Richter等人(2001)J.Biol.Chem.27633689；Lopez-Buesa等人(1998)Proc.Nat′l.Acad.Sci.9515253；Schirmer等人(1998)J.Biol.Chem.27315546)。对于hsp90，也已经观察到ATP的结合和水解与其分子伴侣功能相关(Obermann等人(1998)J.Cell Biol.143901；Panaretou等人(1998)EMBO J.174829)。然而，ATP酶活性和构象变化在体内促进hsp90的生物活性的作用仍然是进一步研究的主题。
Gp96，是热休克蛋白hsp90家族的成员，也已经有报道其具有ATP酶活性(Li等人(1993)EMBO J.123143)。然而，该观测已经受到Wearsch和Nicchitta的挑战，他们认为gp96的肽结合活性是独立于腺嘌呤核苷酸的，并且ATP的结合和水解不是gp96的固有特性((1997)J.Biol.Chem.2725152)。这些研究者也表明在gp96制剂中极轻微的ATP酶活性是由极少量的污染的酪蛋白激酶II引起的。Wearsch，Voglino和Nicchitta进一步报道，结合gp96的肽在存在或缺少ATP或ADP时是相同的，并且该结合随着化学变性/复性或瞬时的热休克之后而分别被激发2倍或4倍((1998)Biochem.375709)。
已经显示Gp96作为非共价缔合的亚基的二聚体而存在(Wearsch和Nicchitta(1996)Prot.Exp.Pur.7114)。已经提出肽被装配为更高级有序的gp96复合物(Sastry和Linderoth，J.Biol. Chem.27412023)。已经进一步显示热休克产生三级构象的变化，从而增加溶剂和肽对疏水结构域的易接近性(Wassenberg等人(2000)J.Biol.Chem.27522806)。然而，Wassenberg等人(上述)表示支持内在的ATP结合和ATP酶活性的证据是有争议的，然而关于腺苷核苷酸的分子碱基介导对gp96底物相互作用的调节将要达成一致。尽管对gp96的生物物理学和生物化学进行了研究，gp96和肽底物之间相互作用的调节仍然没有被完全了解。而在主要的组织相容性复合物类别I的抗原加工和呈递途径中关于核苷酸结合和构象变化对gp96-肽复合物功能的影响更是知之甚少。
因为正在开发免疫治疗剂，了解这些相互作用的机制和它们如何影响这些复合物的生物活性变得至关重要。在一个方面，本发明提供检测和测量hsp和hsp-抗原复合物的生物活性的方法，其中可应用该方法根据hsp-抗原复合物来确定免疫治疗剂的效价。
Hsps，例如gp96、hsp90、hsp70、钙网蛋白、hsp 10和grpl70，也是已知作为许多肽的伴侣(关于综述，参见Srivastava等人，1998，Immunity 8657-665；Srivastava，2002，Annu.Rev.Immunol.20395-425)。例如，肿瘤衍生的gp96携带肿瘤的抗原性肽，来自病毒感染的细胞的gp96制品携带病毒表位(Suto和Srivastava，1995，Science2691585-1588)，而来自用模型抗原，例如卵清蛋白或β-半乳糖苷酶转染的细胞的gp96制品与相应的表位相关(Arnold等人，1995，J.Exp.Med.182885-889；Breloer等人，1998，Eur.J.Immunol.281016-1021)。Hsp-肽复合物，无论分离自细胞(Tamura等人，1997，科学Science 278117-120)，或在体外重新组成(Blachere等人，1997，J.Exp.Med.1861183-1406)都是优良的免疫原并且已经被广泛使用以引发特异于hsp-伴侣的抗原性肽的CD8+T细胞特异应答(关于综述，参见Srivastava，2002，Annu.Rev.Immunol. 20395-425)。
可以使用纯化自癌细胞的hsps和肽的非共价复合物来治疗和预防癌症，并且已在1996年4月11日的PCT公开物WO 96/10411和1997年3月20日的公开物WO 97/10001中有描述(分别为1998年4月12日发行的美国专利号5,750,119，和1998年11月17日发行的美国专利号5,837,251，每个专利在此全部引入作为参考)。应激蛋白-抗原复合物的分离和纯化已有描述，例如来自病原体-感染的细胞，并且被用于治疗和预防由该病原体，例如病毒、和其他胞内病原体，包括细菌、原生动物、真菌和寄生虫所引起的感染(参见，例如1995年9月21日PCT公开的WO 95/24923)。免疫原性的应激蛋白-抗原复合物也可以通过应激蛋白和抗原性肽的体外结合而制备，并且这种复合物用于治疗和预防癌症和传染性疾病的用途已经在1997年3月20日的PCT公开物WO 97/10000中有描述(2000年2月29日发行的美国专利号6,030,618)。使用应激蛋白-抗原复合物来在体外将呈现抗原的细胞敏化用于过继性免疫疗法的用途在1997年3月20日PCT公开的WO97/10002中有描述(也参见1999年11月16日发行的美国专利号5,985,270)。
引发更大免疫应答的hsps和肽的复合物可用于增强免疫治疗传染性疾病和癌症。另一方面，本发明提供了用于增强热休克蛋白或包括热休克蛋白和抗原性分子的复合物的免疫原性的复合物、组合物和方法。
在此对参考文献的引证或评论不应被看作承认其是相对于本发明的现有技术。
3.发明概述在一个方面，本发明提供检测热休克蛋白-肽复合物的生物活性的方法。本发明也包括该方法在测定包括热休克蛋白-肽复合物的免疫治疗剂的活性；在评估受试个体对疫苗或免疫治疗的应答；以及在筛选调节热休克蛋白-肽复合物的活性的因子中的用途。
本发明中使用的hsp可选自任何hsp家族，包括例如但不限于，hsp70家族、hsp90家族和hsp60家族。此外，本发明使用的hsp可选自任何hsp，包括但不限于hsp90、gp96(grp94)、hsp 104、hsp 70和hsp 60。在优选的实施方案中，本发明使用的hsp是gp96。
可以通过本发明评估的生物活性包括但不限于，免疫活性，例如肽抗原对抗原呈递细胞的呈递(抗原再呈递)和T细胞的活化。在一个实施方案中，术语生物活性限于免疫活性。hsp-肽复合物的免疫活性是直接与其在预防和治疗应用中的用途相关的。许多其他的生物学活性是本领域已知的，并且包括例如但不限于，诱导产生生物反应的调节物，例如但不限于细胞因子，例如人巨噬细胞化学诱引蛋白质-1(MCP-1)和一氧化氮(NO)；结合受体，例如CD91(α-2-巨球蛋白受体，α2MR)和/或CD36；抗原性分子的结合和释放；以及引起动物中肿瘤的退化，延长患肿瘤动物的存活期并消除感染的能力。该生物活性可能在体内和/或体外发生或被观察到。
在一个实施方案中，本发明提供检测热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的生物活性的方法，包括测定热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的ATP酶活性并且使用该热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的ATP酶活性作为生物活性的指标。可使用本领域已知的用于确定ATP酶活性的任何方法，例如但不限于涉及ATP的酶反应，例如但不限于基于发光酶的分析，和检测ATP、ADP、AMP和/或无机磷酸的浓度和/或数量的方法，例如但不限于离子交换色谱法、生物发光分析、HPLC、放射性同位素分析或免疫亲和分析。
在另一个实施方案中，本发明提供检测热休克蛋白或热休克蛋白-肽的生物活性的方法，包括确定热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物寡聚体的数量并且使用热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的寡聚体的存在作为热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的生物活性的指标。可使用本领域已知用于测定热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的大小和/或构象的任何方法，例如但不限于大小排阻色谱法、凝胶电泳、免疫测定、梯度离心、过滤器、光散射分析或分析超离心。在多种实施方案中，热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的二聚体是优选的。
可结合使用本发明的方法以确定包括热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的组合物的生物活性。
在另一个实施方案中，本发明提供筛选调节热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的生物活性的潜在的治疗化合物的方法。该方法包括在不存在化合物时测量热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的ATP酶活性的步骤；让热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物与化合物接触；将没有接触化合物的热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的ATP酶活性与接触了该化合物的热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的ATP酶活性比较；并且使用接触了化合物的热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物与没有接触化合物的热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的ATP酶活性之间的任何差异作为该化合物调节生物活性的指标。该方法可进一步包括在存在格尔德霉素或任何其他特异性的核苷酸结合hsps的抑制剂，例如NECA时确定ATP酶活性，其中受到存在的格尔德霉素或任何其他特异性的核苷酸结合抑制剂抑制的该ATP酶活性被用作该生物活性的指标。当可能存在其他种类的ATP酶时，这个步骤是特别有效的。
在另一实施方案中，提供筛选潜在的治疗化合物的方法，包括在不存在化合物时测量热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的寡聚体的数量；使热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物与化合物接触；比较没有接触化合物的热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的寡聚体的数量与接触了化合物的热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的寡聚体的数量；以及使用接触了化合物的热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的寡聚体与没有接触化合物的热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的寡聚体的数量之间的任何差异作为该化合物调节生物活性的指标。在多种实施方案中，该热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的二聚体是优选的。
在另一实施方案中，本发明提供针对其生物活性筛选热休克蛋白和复合物的变体的方法，包括确定变体的ATP酶活性或由该变体或变体和其正常的对应物形成的寡聚结构的存在。
在另一实施方案中，本发明提供调节热休克蛋白和其复合物的生物活性的方法，包括使热休克蛋白和复合物与调节ATP酶活性或该热休克蛋白和复合物的寡聚化的化合物接触。可使用这种化合物调节受试个体的免疫功能。
在另一实施方案中，本发明提供用于诊断部分归因于受试个体免疫系统异常或亚正常功能的受试个体状况的方法，所述方法包括利用热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的ATP酶活性或从受试个体获得的热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的寡聚体的存在作为该热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的生物活性的指标，其中该生物活性与受试个体中一种或多种免疫功能相关，由此ATP酶活性或寡聚体的数量的变化表明状况的变化。在多种实施方案中，热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的二聚体是优选的。
在进一步的实施方案中，本发明提供用于确定受试个体中癌症或传染性疾病的预后的方法，包括使用热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的ATP酶活性或从受试个体获得的热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的寡聚体的存在作为热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的生物活性的指标，其中该生物活性与应答或靶向癌症细胞或引起传染性疾病的因子的一种或多种免疫功能相关，由此ATP酶活性或寡聚体的数量的变化指示预后的变化。在多种实施方案中，热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的二聚体是优选的。
在一个实施方案中，hsp或hsp-肽复合物可从来自受试个体的样品，例如组织样品或血样获得；hsp或hsp-肽复合物可随后被进一步分离和/或纯化。
可使用本发明的方法提供热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的基于质量的比活性。可以使用该信息调控用于诊断或治疗应用的热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的质量或效价。可使用该信息设计更经济的和更有效的制剂和剂量。
本发明进一步提供包括包含热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的组合物的试剂盒，其中使用该热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的ATP酶活性或寡聚体的数量作为热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的生物活性的指标，以及用于测定热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的ATP酶活性或寡聚体的数量的指导说明。在多种实施方案中，热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的二聚体是优选的。
另一方面，本发明提供用于增强热休克蛋白或包括热休克蛋白和抗原性分子的复合物的免疫原性的复合物、组合物和方法。本发明也涉及改进抗原递送到细胞的方式从而提供更有效的和因此更强效的疫苗制剂。
在一个实施方案中，本发明提供包含寡聚的、免疫活化的热休克蛋白和抗原性分子的纯化的复合物；其中该热休克蛋白已经通过与寡聚剂接触而寡聚化，附带条件是该寡聚剂不是凝集素、4，4′-双苯胺基-1，1′-联萘-5，5′-二磺酸(″bis-ANS″)、戊二醛或磺基琥珀酰亚胺基(4-叠氮水杨酰胺基)己酸(″SASD″)。在另一个实施方案中，本发明提供包含寡聚的、免疫活化的热休克蛋白和抗原性分子的纯化的复合物；其中热休克蛋白已经通过与寡聚剂共价结合而被寡聚化，附带条件是寡聚剂不是bis-ANS、戊二醛或SASD。在某些实施方案中，该热休克蛋白非与寡聚剂共价结合。在一些实施方案中，寡聚剂选自可结合热休克蛋白、生物素/抗生物素蛋白、生物素/链霉抗生物素蛋白和衍生的聚乙二醇(″PEG″)的双特异性的或多价的抗体。在某些实施方案中，该热休克蛋白是gp96或hsp90。在优选的实施方案中，热休克蛋白和抗原性分子是作为复合物从细胞裂解物中分离的，优选来自癌性细胞或用呈现传染性疾病因子的抗原性的因子感染的细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供纯化的寡聚的复合物的群体，所述群体中的每种复合物包括免疫活化的热休克蛋白和抗原性分子，其中该复合物已经通过与寡聚剂接触而被寡聚化，条件是该寡聚剂不是凝集素、bis-ANS、戊二醛或SASD，并且其中所述群体中的至少一种复合物包括不同于所述群体中另一种复合物的抗原性分子的抗原性分子。在另一个实施方案中，本发明提供纯化的寡聚复合物的群体，所述群体中的每种复合物包括免疫活化的热休克蛋白和抗原性分子，其中该复合物已经通过与寡聚剂共价结合而被寡聚化，条件是该寡聚剂不是凝集素、bis-ANS、戊二醛或SASD，并且其中所述群体中的至少一种复合物包括不同于所述群体中另一种复合物的抗原性分子的抗原性分子。在一些实施方案中，该热休克蛋白与寡聚剂非共价结合。在某些实施方案中，该热休克蛋白是gp96或hsp90。在优选的实施方案中，热休克蛋白和抗原性分子是从细胞裂解物中作为复合物而被分离的，优选来自癌性细胞或用呈现传染性疾病因子的抗原性的媒介感染的细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供包含寡聚的、免疫活化的热休克蛋白和抗原性分子的纯化的复合物；其中热休克蛋白已经通过与寡聚剂接触而被寡聚化，条件是该寡聚剂不是bis-ANS、戊二醛或SASD。在特定的实施方案中，本发明提供包含寡聚的、免疫活化的热休克蛋白和抗原性分子的纯化的复合物；其中热休克蛋白已经通过与寡聚剂共价结合而被寡聚化，条件是该寡聚剂不是bis-ANS、戊二醛或SASD。优选地，该复合物进一步包括抗原性分子，并且更优选地，该热休克蛋白在与寡聚剂接触之前是以与抗原性分子的复合物形式存在的。备选地，该热休克蛋白最初没有接触抗原性分子，但在其寡聚化后接触抗原性分子。
在另一个实施方案中，本发明提供包括药物学上可接受的载体和纯化的复合物的药物组合物，所述的复合物包括寡聚的、免疫活化的热休克蛋白和抗原性分子，其中热休克蛋白已经通过与寡聚剂接触而被寡聚化，条件是寡聚剂不是bis-ANS、戊二醛或SASD。在一些实施方案中，该药物组合物包括药物学上可接受的载体和纯化的复合物，所述的复合物包括寡聚的、免疫活化的热休克蛋白和抗原性分子，其中该热休克蛋白已经通过共价结合寡聚剂而寡聚化，条件是该寡聚剂不是bis-ANS、戊二醛或SASD。在一些实施方案中，该药物组合物包括药物学上可接受的载体和治疗有效剂量的纯化的复合物，所述的复合物包括寡聚的、免疫活化的热休克蛋白和抗原性分子，其中该热休克蛋白已经通过共价结合寡聚剂而寡聚化。在其他的实施方案中，该药物组合物包括药物学上可接受的载体和纯化的复合物，所述的复合物包括寡聚的、免疫活化的热休克蛋白，抗原性分子和药物学上可接受的载体，其中该热休克蛋白已经通过共价结合寡聚剂而寡聚化，并且其中该药物组合物存在于注射器中。在特定的实施方案中，该热休克蛋白非共价结合寡聚剂。在某些实施方案中，该热休克蛋白是gp96或hsp90。在优选的实施方案中，热休克蛋白和抗原性分子是从细胞裂解物中作为复合物分离的，优选来自癌性细胞或受呈现传染性疾病因子的抗原性的媒介感染的细胞。在另一个优选的实施方案中，药物组合物中的复合物以用于治疗或预防癌症或传染性疾病的有效量存在。
在另一实施方案中，本发明提供包括包含寡聚的、免疫活化的热休克蛋白的纯化复合物的试剂盒；其中热休克蛋白已经通过接触寡聚剂而寡聚化，条件是寡聚剂不是bis-ANS、戊二醛或SASD。在某些实施方案中，该试剂盒包括包含寡聚的、免疫活化的热休克蛋白的纯化复合物；其中该热休克蛋白已经通过共价结合寡聚剂而寡聚化，条件是寡聚剂不是bis-ANS、戊二醛或SASD。在一些实施方案中，该热休克蛋白非共价结合寡聚剂。在一些实施方案中，该热休克蛋白是gp96或hsp90。优选地，该试剂盒包括进一步包含抗原性分子的复合物。在优选的实施方案中，热休克蛋白和抗原性分子是从细胞裂解物中作为复合物分离的，优选来自癌性细胞或受呈现传染性疾病因子的抗原性的媒介感染的细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供通过使复合物与足够引起该复合物的寡聚化的适量寡聚剂接触而增强包含免疫活化的热休克蛋白和抗原性分子的复合物的抗原性或免疫原性的方法，条件是该寡聚剂不是bis-ANS、戊二醛或SASD。在另一个实施方案中，增强复合物的抗原性或免疫原性的方法包括使包含免疫活化的热休克蛋白和抗原性分子的复合物与足够引起该复合物寡聚化的适量寡聚剂接触，其中该热休克蛋白共价结合该寡聚剂。在特定的实施方案中，本方法使用的复合物包括与抗原性分子通过非共价键复合的免疫活化的热休克蛋白。在优选的实施方案中，抗原性分子是肽。在另一个优选的实施方案中，包括免疫活化的热休克蛋白和抗原性分子的复合物分离自细胞裂解物，优选来自癌性细胞或受呈现传染性疾病因子的抗原性的媒介感染的细胞。在特定的实施方案中，该热休克蛋白是gp96或hsp90。
在另一个实施方案中，本发明提供通过首先使hsp与足够引起该hsp寡聚化的寡聚剂接触而增强免疫活化的hsp肽复合物的抗原性或免疫原性的方法，条件是该寡聚剂不是bis-ANS、戊二醛或SASD；随后将该寡聚的hsp接触抗原性分子。在某些实施方案中，该方法包括使hsp与足够引起该hsp寡聚化的适量寡聚剂接触，其中热休克蛋白共价结合该寡聚剂，条件是该寡聚剂不是bis-ANS、戊二醛或SASD；并随后将该寡聚的hsp接触抗原性分子。
在另一个实施方案中，本发明提供治疗或预防癌症或传染性疾病的方法，包括对需要这种治疗或预防的受试个体施用治疗有效量的纯化复合物，其中该复合物包括寡聚的、免疫活化的热休克蛋白和抗原性分子；其中该热休克蛋白已经通过接触寡聚剂而寡聚化，条件是该寡聚剂不是bis-ANS、戊二醛或SASD，并且其中该抗原性分子分别显示所述癌症的肿瘤特异性或与肿瘤相关的所述的抗原或所述的传染性疾病因子的抗原性。在某些实施方案中，本方法使用的复合物包括已经通过共价结合寡聚剂而寡聚化的热休克蛋白。在一些实施方案中，本方法中使用的复合物包括已经通过共价结合寡聚剂而寡聚化的热休克蛋白，条件是该寡聚剂不是戊二醛。在其他的实施方案中，该寡聚剂不是bis-ANS或SASD。在某些实施方案中，该热休克蛋白是gp96或hsp90。在优选的实施方案中，热休克蛋白和抗原性分子是从细胞裂解物中作为复合物分离的，优选来自癌性细胞或受呈现传染性疾病因子的抗原性的因子感染的细胞。在另一个优选的实施方案中，该细胞从受试个体获得。
在另一个实施方案中，本发明提供治疗或预防癌症或传染性疾病的方法，包括对需要这种治疗或预防的受试个体施用治疗有效量的包括药物学上可接受的载体和纯化的复合物的药物组合物，所述的复合物包括寡聚的、免疫活化的热休克蛋白和抗原性分子，其中该热休克蛋白已经通过接触寡聚剂而寡聚化，条件是该寡聚剂不是bis-ANS、戊二醛或SASD，并且其中该抗原性分子分别呈现所述癌症的肿瘤特异性或与肿瘤相关的抗原或所述传染性疾病因子的抗原性。在一些实施方案中，该方法包括施用治疗有效量的包括药物学上可接受的载体和纯化的复合物的药物组合物，所述的复合物包括寡聚的、免疫活化的热休克蛋白和抗原性分子，其中该热休克蛋白已经通过共价结合寡聚剂而寡聚化。在一些实施方案中，本方法使用的复合物包括已经通过共价结合寡聚剂而寡聚化的热休克蛋白，条件是该寡聚剂不是戊二醛。在其他的实施方案中，该寡聚剂不是bis-ANS或SASD。在特定的实施方案中，本方法包括施用治疗有效量的包括药物学上可接受的载体和纯化的复合物的药物组合物，所述的复合物包括寡聚的、免疫活化的热休克蛋白和抗原性分子，其中(a)该热休克蛋白已经通过共价结合寡聚剂而寡聚化，(b)该药物组合物存在于注射器中，以及(c)该抗原性分子显示癌症的肿瘤特异性或与肿瘤相关的抗原或传染性疾病因子的抗原性。在某些实施方案中，该热休克蛋白是gp96或hsp90。在优选的实施方案中，包括免疫活化的热休克蛋白和抗原性分子的复合物分离自细胞裂解物，优选来自癌性细胞或用呈现传染性疾病因子的抗原性的因子感染的细胞。在另一个优选的实施方案中，该细胞从受试个体获得。
在另一个实施方案中，本发明提供制备药物组合物的方法，包括(a)使复合物与足够引起该复合物寡聚化的适量寡聚剂接触，其中该复合物包括免疫活化的热休克蛋白和抗原性分子，条件是该寡聚剂不是bis-ANS、戊二醛或SASD；以及(b)将寡聚的复合物与药物学上可接受的载体组合。在一些实施方案中，该方法包括(a)使复合物与足够引起该复合物寡聚化的适量寡聚剂接触，其中该复合物包括免疫活化的热休克蛋白和抗原性分子，并且其中该寡聚剂共价结合寡聚剂，条件是该寡聚剂不是bis-ANS、戊二醛或SASD；以及(b)将寡聚的复合物与药物学上可接受的载体混合。在某些实施方案中，该热休克蛋白是gp96或hsp90。在优选的实施方案中，热休克蛋白和抗原性分子是从细胞裂解物中作为复合物分离的，优选来自癌性细胞或受呈现传染性疾病因子的抗原性的媒介感染的细胞。
4.附图简述
图1. SEC迹线表明当加热hsp-肽复合物时，该蛋白质快速地形成较高分子量的聚集物。
图2.图表A表明在50℃和60℃加热gp9630分钟后有二聚体水平的下降，当在60℃加热时下降的速率更快。在30分钟时两个样品都不包含二聚体。图表B显示在50℃和60℃加热30分钟后，gp96的NECA结合能力下降，当在60℃加热时下降的速率更快。在30分钟时两个样品的gp96都不结合NECA。图表C和D表明，当加热gp96复合物到50℃和60℃30分钟时，gp96复合物刺激小鼠的APC分泌MCP-1和NO的能力快速下降。图表E和F表明，酸性pH分别对二聚体水平和gp96结合NECA的能力的影响。二聚体水平和NECA结合能力在pH3.0时都显著地减少。图表G和H表明，酸性pH对gp96复合物刺激小鼠的APCs分别分泌MCP-1和NO的能力的影响。MCP-1和NO的分泌在pH 3.0下都显著地减少了。
图3.从人卵巢肿瘤细胞制备的gp96复合物的SEC迹线，其中级分8-10相应于hsp-肽复合物的二聚体。
图4.从人卵巢肿瘤细胞制备的gp96复合物的单个级分的SEC迹线，其中级分8-10相应于hsp-肽复合物的二聚体。
图5.单个级分的银染SDS-PAGE凝胶表示在图3和4中。级分2-5包含gp96的大部分较高分子量的聚集物，同时级分8-10表示二聚体。
图6.级分的ATP酶活性表示在图3-5中。表示二聚体的级分8-10，具有最高的ATP酶活性，而表示聚集物的级分(级分2-5)和其他类型的级分(级分11-15)具有显著减少的ATP酶活性。
图7.杂合抗原再呈递分析表明，与小鼠抗原AH1十九聚体结合的来源于人的gp96导致与单独的gp96或AH1十九聚体相比，抗原再呈递活性的剂量依赖性增加，其以IFN-γ的分泌表示。顶部的条带显示应用于APCs和CTLs的样品的IFN-γ水平。第二和第三条带是单独的CTLs和APCs的对照。每个数据组单独包含未加载gp96和AH1十九聚体的培养基作为阴性对照并且将可直接交换到MHC 1分子表面上的AH1九聚体肽作为阳性对照。gp96/AH1十九聚体复合物以10μg/mL施加或用未加载的gp96以1∶3，1∶10或1∶30稀释。结果显示剂量依赖性的IFN-γ应答并且没有经未加载的gp96的刺激。对照表明该活性是特异于加载了AH1十九聚体的gp96。当在60℃加热蛋白质-肽复合物样品10分钟，已知在该情况下引起蛋白质的完全聚集，消除了刺激T细胞的能力。
图8.实验结果，其中将重组的gp96在指定的温度孵育10分钟并随后分析二聚体的％和ATP酶活性。该图显示温度诱导的聚集和ATP酶活性损失之间直接相关。
5.发明详述在一个方面，在此描述的本发明提供用于检测和测量热休克蛋白和热休克蛋白-抗原性分子的复合物或热休克蛋白-肽复合物(″hsp-肽复合物″或″hsp复合物″)的生物活性的方法。可以使用本发明的方法来测定患有疾病的受试个体的预后和受试个体对治疗的反应。还可以使用本方法筛选调节hsp-肽复合物生物活性的治疗剂和筛选与具有增加或减少的生物活性的变体hsp形成的复合物。
本发明部分地以为了理解gp96-肽复合物的结构和其功能特性之间的关系而进行的研究为基础。本发明者已经证明二聚的gp96具有ATP酶活性，能够为特异的T淋巴细胞再呈递抗原，并且能诱导MCP-1和氧化氮(NO)的产生。高分子量的聚集物可如在此所例证的，通过热处理而产生，并且这种形式聚集的gp96在所有的4个生物测定中是非活性的。第6节提供的数据也证明抗原再呈递的丢失、MCP-1的产生和NO的产生与二聚的gp96的丢失相伴随。
本发明者研究的结果证明，ATP酶活性是gp96的固有功能；ATP酶活性与二聚体的gp96相关；二聚的gp96是为ATP酶活性所必需的；ATP酶活性不与gp96的形式，例如gp96的高分子量聚集物相关，认为该聚集物是非活性的是由于变性或其他的构象变化。根据这些结果，本发明者根据二聚的gp96与ATP酶活性以及二聚的gp96与抗原再呈递和T细胞活化的相互关系确定ATP酶活性是生物活性稳定性的相关的和可靠的量度。
随着对hsps和hsp-肽复合物在治疗和诊断多种疾病中的功效而进行的研究的增加，有必要迅速并便宜地确定hsp-肽复合物的生物活性。本发明提供根据ATP酶活性和/或hsp-肽复合寡聚物的存在来检测生物活性的方法，该方法是定量的和敏感的。
在一个实施方案中，本发明提供根据确定hsp或hsp-肽复合物的ATP酶活性而评估hsp或hsp-肽复合物的生物活性的方法。ATP酶活性的存在将表明hsp或hsp-肽复合物是生物活化的，而缺乏ATP酶活性将表明hsp或hsp-肽复合物是非生物活化的。
如在此所使用的，术语″生物活性″包括但不限于免疫活性，例如，肽抗原对抗原递呈细胞的呈递(抗原再呈递)以及T细胞的活化。在一个实施方案中，术语生物活性限于免疫活性。hsp-肽复合物的免疫活性是直接与其在预防和治疗应用中的用途相关的。许多其他的生物活性是本领域已知的，并且被包括例如但不限于，诱导产生生物反应调节物，例如但不限于细胞因子，例如人巨噬细胞化学诱引蛋白-1(MCP-1)，和氧化氮(NO)；结合受体，例如CD91(α-2-巨球蛋白受体，α2MR)和/或CD36；抗原性分子的结合和释放；以及引起动物中肿瘤退化，延长患肿瘤动物的存活期和消除感染的能力。生物活性可在体内和/或体外发生或被观察到。
术语″hsp″表示非共价结合抗原性分子的热休克蛋白。术语″hsp-肽复合物″表示包括非共价结合热休克蛋白的抗原性分子的复合物。优选地，抗原性分子是抗原性的蛋白质或肽。热休克蛋白，也可互换地被称为应激蛋白，在本发明的实施中是有用的，它可选自符合下列标准的任何细胞蛋白质(1)它是当细胞遭受紧张刺激时其胞内浓度增加的蛋白质；(2)它能够结合其他的蛋白质或肽；以及(3)它能够在存在腺苷三磷酸(ATP)或低pH，例如1、2、3、4、5或6时，释放结合的蛋白质或肽；或者它是显示与任何具有上述所有特性的细胞蛋白质具有至少35％同源性的蛋白质。优选地，该hsps和hsp-肽复合物是人hsps和hsp-肽复合物。
Hsps已经分类成为hsp家族，包括但不限于hsp90、hsp70和hsp60。在一个实施方案中，hsp和hsp-肽复合物包括单个hsp家族的成员，例如hsp70、hsp90和hsp60。已经证明具有ATP酶活性的种属包括但不限于，hsp90、gp96(grp94)、hsp104、hsp70和hsp60。在某些实施方案中，gp96，也称为grp94，是优选的hsp，并且gp96-抗原性分子复合物是本发明优选的hsp-肽复合物。
许多方法适用于检测和/或测量hsp或hsp-肽复合物的ATP酶活性。一般地，这种方法通过确定ATP的降低、ADP的增加、AMP的增加和/或无机磷酸的增加而确定水解了的ATP的数量从而测量ATP酶活性。非限制性的实例包括生物发光、HPLC和涉及[γ-32P]-标记的ATP的免疫亲和剥离技术以及薄层色谱法。这种方法的细节在第5.2节描述。
在另一个实施方案中，本发明提供根据测定寡聚hsp或hsp-肽复合物的存在和/或浓度而评估hsp或hsp-肽复合物的生物活性的方法。在优选的实施方案中，该寡聚体结构是如在gp96的情况中观察到的二聚体结构。因此，不是限于并且只是为了示例的目的，在下文使用术语二聚的或二聚化。样品中二聚的hsp或hsp-肽复合物的存在将表明样品中的hsp或hsp-肽复合物是生物活化的，而不存在二聚hsp或二聚hsp-肽复合物将表明hsp或hsp-肽复合物的生物活性是减少的。辨别来自高级聚集物、单体和降解产物的二聚体可以通过确定hsp或hsp-肽复合物的大小和/或形状而进行。本发明提供通过大小检测hsp二聚体的方法，包括但不限于常规的色谱技术，包括但不限于大小排阻色谱法和离子交换色谱法；常规的电泳技术，包括但不限于单向和双向电泳以及毛细管电泳；质谱法；光散射分析；分析超离心(AUC)；以及使用过滤器，包括但不限于分子量截止过滤器。这些方法的细节在第5.3节有描述。
本发明也提供通过构象检测hsp二聚体的方法，包括但不限于使用多克隆或单克隆抗体针对特定构象的蛋白质进行特异性靶向。一个实施方案包括使用抗体针对单体和寡聚构象的hsp进行靶向。在优选的实施方案中，这种抗体不结合除了hsp和/或hsp-肽的二聚体外的hsp或hsp-肽复合物的形式。这些方法的细节在第5.10节有描述。
在具体的实施方案中，评估hsp或hsp-肽复合物的生物活性的方法包括检测和/或测量ATP酶活性并且确定二聚hsp或二聚hsp-肽复合物的存在和/或浓度。
本发明的方法具有许多应用的领域。在一个实例中，本方法可被用于商业性生产hsp-肽复合物。本发明提供迅速而廉价的方式，根据其生物活性调控和监测hsp肽复合物的质量，从而可以替代进行昂贵且费时的基于细胞的生物鉴定。这个方法的细节在第5.5节有描述。
在另一实施方案中，本发明提供用于诊断伴随免疫成分的疾病或预后受试个体中癌症或传染性疾病的方法。这种方法的细节在第5.6节有描述。
本发明还可用于筛选调节hsp或hsp-肽复合物的生物活性的治疗剂。这种方法的细节在第5.8节有描述。在另一实施方案中，可使用本发明的方法筛选hsps和其复合物的变体、片段和衍生物，它们具有未改变的hsp或hsp-肽复合物的类似的生物活性。优选地，hsps和其复合物的变体、片段和衍生物的生物活性相对于未改变的hsp或hsp-肽复合物是更高的。
在另一实施方案中，如第5.7节所描述的，本发明提供通过使hsp或hsp-肽复合物与抑制或促进hsp或hsp-肽复合物的ATP酶活性，和/或破环/去稳定或稳定hsp或hsp-肽复合物的二聚结构的化合物接触而调节hsp或hsp肽复合物的生物活性的方法。
另一方面，本发明涉及利用寡聚剂促进热休克蛋白或包含热休克蛋白的免疫活性复合物的寡聚化。在优选的实施方案中，该寡聚剂将促进生成gp96的二聚体或其多重类型。特别地，本发明提供包含免疫活性部分，例如用寡聚剂寡聚化的热休克蛋白的复合物制剂。也提供了使用该制剂用于预防和治疗癌症和传染性疾病，并且在受试个体中引发免疫应答的方法。本发明在多种情况下是有用的，例如当需要增强免疫治疗部分的生物效价时；通过特异的和/或备选的受体或非受体介导的事件促进疫苗递送到抗原递呈细胞中；改进免疫治疗部分的递送；改善免疫治疗部分的辅助能力；或捕获次级免疫治疗/免疫活化部分并且经特异受体介导的摄取将其递送到抗原递呈细胞中。
本发明提供包含免疫活性部分，例如用寡聚剂寡聚化的热休克蛋白的复合物的组合物。该复合物可进一步包含一种或多种抗原性分子，优选显示癌症或传染性疾病因子的抗原的抗原性的肽。在优选的实施方案中，本发明的寡聚的热休克蛋白和hsp-抗原性分子复合物具有ATP酶活性。在特定的实施方案中，本发明的寡聚的热休克蛋白是没有变性的，例如加热变性的hsps。如在此所使用的，″寡聚物″包括″二聚体″，″三聚体″和更高数量的单元，包括聚合物。在特定的实施方案中，gp96的″寡聚物″是二聚体或多重的二聚物。
如在此所使用的，关于复合物，术语″纯化的″是指复合物的制剂至少是总蛋白重量的60％的复合物。在一个实施方案中，它是指总蛋白重量的至少70％。在另一个实施方案中，它是指总蛋白重量的至少80％。在另一个实施方案中，它是指总蛋白重量的至少90％。在另一个实施方案中，它是指总蛋白重量的至少95％，而在另一个实施方案中，它是指总蛋白重量的至少99％。如在此所使用的，关于热休克蛋白，术语″纯化的″是指hsp的制剂至少是总蛋白重量的60％的hsp。在一个实施方案中，它是指总蛋白重量的至少70％。在另一个实施方案中，它是指总蛋白重量的至少80％。在另一个实施方案中，它是指总蛋白重量的至少90％。在另一个实施方案中，它是指总蛋白重量的至少95％而在另一个实施方案中，它是指总蛋白重量的至少99％。在一些实施方案中，纯度是指通过SDS-PAGE凝胶上的表观而测得的均质性。在优选的实施方案中，hsp非共价结合例如肽的抗原性分子。
本发明也提供包括用于有效治疗或预防传染性疾病或癌症的适量复合物和药物学上可接受的载体的药物组合物，其中所述复合物包含与寡聚剂寡聚的热休克蛋白。该复合物可进一步包括一种或多种显示癌症类型的抗原或传染性疾病因子的抗原的抗原性的抗原性分子，优选为肽。
如在此所使用的，除非另有说明，术语″免疫活化的hsp″是指hsp调节、优选刺激或增强免疫应答，优选靶向与hsp结合的抗原性分子的免疫应答的能力。
许多寡聚剂是本领域已知的。术语″寡聚剂″是指促进其他分子寡聚化，例如热休克蛋白寡聚化的化合物。寡聚剂可共价或非共价地结合例如热休克蛋白的分子。在一个实施方案中，寡聚剂可共价结合两个或多个热休克蛋白并从而引起热休克蛋白的寡聚化。在另一个实施方案中，寡聚剂可非共价地结合两个或多个热休克蛋白并从而引起热休克蛋白的寡聚化。在另一个实施方案中，寡聚剂可共价结合一个热休克蛋白分子并且通过非共价结合另一个热休克蛋白分子上的相似或不同的寡聚剂而促进寡聚化。在某些实施方案中，2个结合的热休克蛋白是相同的。在优选的实施方案中，寡聚的热休克蛋白非共价结合抗原性分子例如肽。
如在此所使用的，除非另有指明，当单独使用时，术语″分子″，″复合物″，″热休克蛋白″，″应激蛋白″，″抗原性分子″和″寡聚剂″也包括该分子的复数，并且可以指相关分子的群体。
在本发明的一些实施方案中，热休克蛋白显示癌症抗原或传染性疾病因子的抗原性。如在此所使用的，术语″抗原性″和″免疫原性″是指分子分别结合抗体或主要的组织相容性复合物(″MHC″)分子和产生免疫应答的能力。如在此所使用的，″癌症类型″是指例如乳房、肺、卵巢的起源组织的细胞类型。在一个实施方案中，抗原性分子显示传染性因子的抗原的抗原性。在另一个实施方案中，抗原性分子显示相对于在所述细胞类型的非癌性细胞中的其表达，在癌细胞中过表达的抗原的抗原性。例如该抗原性分子可以是肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原，在一个实施方案中，与肿瘤相关的抗原是相对于正常细胞，在肿瘤细胞中以较高水平表达的抗原；肿瘤特异抗原是只在肿瘤细胞而不在正常细胞中表达的抗原。
本发明进一步提供纯化的复合物群体，其中每个复合物包括与寡聚剂寡聚的热休克蛋白。该复合物可以进一步包括一种或多种显示癌症类型的抗原或传染性疾病因子的抗原的抗原性的抗原性分子，例如为肽。在一个实施方案中，热休克蛋白包括但不限于，hsp70、hsp90、gp96、钙网蛋白、hspl10、grpl70或其组合。
本发明提供制备对癌症或传染性疾病因子是免疫原性的复合物的方法，该方法使热休克蛋白或hsp-抗原性分子的复合物与足够促进该热休克蛋白寡聚化的适量寡聚剂接触。在一个实施方案中，寡聚的复合物包括共价结合寡聚剂的热休克蛋白。在另一个实施方案中，抗原性分子显示癌症抗原或传染性疾病因子的抗原性。在另一个个实施方案中，寡聚的复合物包括免疫活化的的热休克蛋白。本发明进一步提供通过在此所描述的方法制备的组合物。在特定的实施方案中，寡聚剂不是凝集素。
在一个实施方案中，抗原性分子是在体内与hsps结合的肽，并且该复合物可以从细胞分离。备选地，该复合物可从hsp和抗原性分子的纯化制品体外生产。在另一个实施方案中，癌症或传染性因子的抗原可以通过纯化自天然源、通过化学合成或重组以及通过例如在此所描述的体外方法获得。
在一个实施方案中，本发明提供制备寡聚复合物的方法，其中该复合物包括免疫活化的hsp和抗原性分子，通过使该复合物与足够促进该复合物寡聚化的适量寡聚剂接触而寡聚化。在另一个实施方案中，寡聚的复合物通过使hsp与足够促进该hsp寡聚化的适量寡聚剂接触而首先寡聚化该免疫活化的hsp；并且将该寡聚的hsp接触令人感兴趣的抗原性分子而制备。
在另一个实施方案中，本发明提供制备寡聚复合物的方法，包括从细胞分离免疫活化的hsp-抗原性分子的复合物；从hsp-抗原性分子的复合物中除去内源的抗原性分子，例如肽；将hsp与外源的令人感兴趣的抗原性分子，例如不同的肽接触，其中该hsp现在与外源的抗原性分子形成复合物；以及将新形成的复合物与足够促进该新形成的复合物寡聚化的适量寡聚剂接触。在另一个实施方案中，本发明提供制备寡聚复合物的方法，包括从细胞分离免疫活化的hsp-抗原性分子的复合物；从hsp-抗原性分子的复合物中除去内源的抗原性分子，例如肽；将hsp与足够促进该hsp寡聚化的适量寡聚剂接触；以及将寡聚的hsp接触外源的令人感兴趣的抗原性分子，例如不同的肽，其中该寡聚的hsp现在与外源的抗原性分子形成复合物。
本发明进一步提供增强包括热休克蛋白的复合物免疫原性的方法，包括使该复合物共价或非共价结合寡聚剂。在一个实施方案中，该复合物包括与抗原性分子相关的热休克蛋白。
本发明的组合物和方法可被用于多种状况。例如，可以使用本发明的组合物在需要治疗或预防癌症或传染性疾病的个体或对象中引发免疫应答。需要治疗或预防癌症或传染性疾病的个体或对象是动物，优选为哺乳动物、非人类的灵长类，并且最优选为人类。如在此所使用的术语″动物″包括但不限于，陪伴动物(例如，猫或狗)、动物园动物、野生动物，包括鹿、狐狸和浣熊、耕畜、家畜和家禽，包括马、牛、羊、猪、火鸡、鸭、鸡和啮齿类。
根据本发明，对受试个体施用寡聚的免疫活化的复合物导致在受试个体中调节对特异于令人感兴趣的抗原来源的抗原性的肽免疫应答，例如，引发、刺激、增强和/或持续免疫应答。寡聚的复合物可作为单剂或复剂给药。免疫原性的剂量可根据不同的受试个体和不同的治疗或预防应用而不同。
在一个实施方案中，本发明提供通过亚免疫原性数量的疫苗组合物诱导免疫应答的方法，其中寡聚化促进由一定量的疫苗组合物诱导免疫应答，而当没有寡聚化时该疫苗组合物不足以诱导免疫应答。
本发明还可以通过将免疫治疗部分接触寡聚剂促进该部分的寡聚化而增加免疫治疗部分的生物活性。如在此所使用的，术语″免疫治疗部分″是指作为免疫治疗复合物的部分的分子。如在此所使用的，术语″寡聚化″是指形成聚合体或聚合体中间物的过程。在一个实施方案中，免疫治疗部分形成二聚体或多重的二聚体。在另一个实施方案中，免疫治疗部分形成更高级的物质，即具有多于2个亚基的寡聚物。
本发明也可用于通过受体介导的事件增加疫苗到抗原递呈细胞(APCs)中的摄取。本发明还可用于通过非受体介导的事件来增加疫苗摄取到抗原递呈细胞中。例如，热休克蛋白缔合的抗原性肽可经抗原递呈细胞通过非受体介导的事件而摄取，包括但不限于胞饮作用、噬菌作用以及hsp-肽复合物与细胞表面成分非特异的相互作用并随后插入和/或转移越过细胞膜。热休克蛋白的寡聚化可增加这种摄取。
本发明可以进一步用于改善免疫治疗部分的辅助能力。如在此所使用的，术语″辅助能力″是指非抗原性物质与抗原联合增强免疫应答的能力，例如通过诱导炎症性反应导致免疫活化细胞，例如抗体形成细胞或T淋巴细胞的局部汇流。具有辅助能力的免疫治疗部分可在疫苗制备中治疗性地使用，因为它们增加产生针对小量抗原的抗体或T淋巴细胞并且延长抗体产生或T细胞活化的时间。免疫治疗部分的寡聚化可以增加其辅助能力。如在此所使用的，免疫治疗部分是指应激蛋白，例如热休克蛋白。在一个实施方案中，热休克蛋白是hsp70、hsp90、gp96、钙网蛋白、hsp110、grp170或其组合。
本发明可以进一步用于增强例如热休克蛋白的免疫治疗部分的抗原性或免疫原性，例如通过将其接触足够量的寡聚剂以促进其寡聚化。抗原性或免疫原性的增强可用如第5.15节中所论述的几种方式证明。在优选的实施方案中，用于证明增强抗原性或免疫原性的分析包括但不限于，抗原再呈递分析，例如如第8节所描述的。
如在此所使用的，″调节″是指免疫治疗部分的特性例如抗原性或免疫原性的改变。在一个实施方案中，它指抗原性免疫原性的增加、增强或强化。在另一个实施方案中，它是指抗原性或免疫原性的降低或抑制。如在此所使用的″调节剂″，乃指″调节″另一个化合物的特性。
本发明还可用于改善免疫治疗部分的递送。
本发明进一步提供捕获次级免疫治疗部分并在受试个体中经受体介导的摄取递送所述部分至抗原递呈细胞的方法，包括对受试个体在存在寡聚剂时施用包括第一蛋白和第二蛋白的复合物的组合物。该复合物可以进一步包含一种或多种抗原性分子，优选显示癌症或传染性疾病因子的抗原的抗原性的肽。在一个实施方案中，第二蛋白质不同于第一蛋白质。在另一个实施方案中，与第一蛋白质相关的抗原性分子可被抗原递呈细胞吸收，而与第二蛋白质相关的抗原性分子不能被抗原递呈细胞正常吸收。第一蛋白质与第二蛋白质的寡聚化能够使与第二蛋白质相关的抗原性分子被抗原递呈细胞吸收。
在一个实施方案中，第一和第二蛋白质都是热休克蛋白。在另一个实施方案中，第一蛋白质是热休克蛋白，包括但不限于hsp70、hsp90、gp96、钙网蛋白、hspl10、grpl70或其组合，但第二蛋白质不是热休克蛋白。在另一个实施方案中，第一蛋白质不是热休克蛋白，但第二蛋白质是热休克蛋白。在一个实施方案中，第一蛋白质进一步与显示癌症抗原或传染性疾病因子的抗原的抗原性的抗原性分子相关。在另一个实施方案中，第二蛋白质进一步与显示癌症抗原或传染性疾病因子的抗原的抗原性的抗原性分子相关。
本发明进一步提供治疗或预防癌症或传染性疾病的方法，包括对受试个体施用本发明的组合物。在一个实施方案中，该组合物包括包含热休克蛋白、抗原性分子和寡聚剂的复合物，其中该抗原性分子显示所述癌症抗原或所述传染性疾病因子的抗原的抗原性。
在另一个实施方案中，该组合物是包括上述复合物和药物学上可接受的载体的药物组合物。在另一个实施方案中，包括上述复合物和药物学上可接受的载体的药物组合物存在于例如小瓶或注射器的容器中。
在另一实施方案中，治疗或预防癌症类型或传染性疾病的方法，包括对受试个体施用(a)一种或多种热休克蛋白、寡聚剂和第一抗原性分子的复合物，其中第一抗原性分子显示癌症抗原或传染性疾病因子抗原的抗原性，以及(b)在该复合物的给药前、给药的同时或给药后，对受试个体施用包括用致敏化量的热休克蛋白与寡聚剂和第二抗原性分子的第二复合物体外致敏的抗原递呈细胞组合物，其中所述的第二抗原性分子显示所述癌症或所述传染性疾病因子的第二抗原的抗原性。APC可选自本领域已知的抗原递呈细胞，包括但不限于巨噬细胞、树突状细胞、B淋巴细胞及其组合，并优选为巨噬细胞。在一个实施方案中，第一复合物与用于致敏APCs的第二复合物相同。在另一个实施方案中，第一复合物不同于用于致敏APCs的第二复合物。在APCs和本发明的组合物同时施用的特定实施方案中，APCs和本发明的组合物可存在于相同的组合物(包括APCs和复合物)或不同的组合物中。根据本发明的过继性免疫疗法(利用致敏的APCs)容许通过与寡聚的分子复合物孵育而活化免疫的抗原递呈细胞。对肿瘤或传染物的体外反应性可使用在活体内的细胞前测量。这种体外加强继之以克隆选择和/或扩展和患者给药组成了有效的治疗和/或预防策略。
在一个实施方案中，复合物的免疫活化部分，例如与显示癌症抗原或传染性疾病因子的抗原性的肽结合的热休克蛋白是受试个体自体固有的；即它分离自受试个体本身的细胞(例如，当需要治疗癌症时从患者的肿瘤活组织检查中制备)。备选地，该复合物可以是与被施用本发明分子复合物的组合物的受试个体异源的。在一个实施方案中，该复合物是体外制备的，例如来自重组的表达热休克蛋白的培养细胞。
用于与热休克蛋白结合以产生特定复合物的外源性抗原及其片段和衍生物可选自本领域已知的物质，并且通过本领域已知的免疫测定较容易地鉴定，是能够结合抗体或MHC分子或产生免疫应答的物质。热休克蛋白和抗原性分子的特异复合物可分离自患者的癌症或癌症前期的组织，或来自癌细胞系，或可体外产生(在外源性抗原被用作抗原性分子的实施方案中是必需的)。
本发明进一步提供包括药物制剂或包含本发明复合物的组合物的试剂盒。本发明也提供包括包含免疫活化的热休克蛋白或其复合物和寡聚剂的容器的试剂盒。任选地，根据本发明的方法制备寡聚复合物的指导说明可以包括在试剂盒内。
在特定的实施方案中，本发明涉及用于预防和治疗初级和转移性肿瘤疾病的方法和组合物。
本发明的治疗方式和药物组合物可与附加的免疫应答热休克蛋白、治疗剂或生物反应调节物使用，包括但不限于细胞因子、化疗剂、免疫治疗剂、抗血管生成剂、激素、抗体、多核苷酸、放射和光动力治疗剂、抗生素、抗病毒的、抗原生动物的化合物和抗真菌的化合物。在另一个实施方案中，本发明的组合物与用于治疗癌症的放射疗法或一种或多种化疗剂一起施用。在另一个实施方案中，本发明的组合物与用于治疗传染性疾病的抗菌的、抗病毒的或抗真菌的试剂一起施用。
除癌症治疗外，本发明的组合物可用于预防多种癌症，例如用于作为家族史的结果而易患病的受试个体或由于环境因素而增加患癌症风险的受试个体。
本发明也提供具体的治疗方式、药物组合物和试剂盒。
5.1热休克蛋白制剂用于实现本发明的热休克蛋白，也可互换地称为应激蛋白，可选自符合下列标准的任何细胞蛋白质(1)它是当细胞遭受紧张刺激时其胞内浓度增加的蛋白质；(2)它能够结合其他的蛋白质或肽；以及(3)它能够在存在腺苷三磷酸(ATP)或例如1、2、3、4、5或6的低pH时，释放结合的蛋白质或肽；或者它是显示与任何具有上述所有特性的细胞蛋白质具有至少35％同源性的蛋白质。
其中hsp-肽复合物用于非疫苗治疗方式联合给药，优选地，该肽是抗原性的或与病症相关的。在特别优选的实施方案中，预期对患有特殊类型癌症的受试个体给药的治疗方式的治疗性结果通过施用hsp-肽复合物而改善，其中该肽显示该类型癌症抗原的抗原性。
在本发明中，hsp的制备可包括但不限于未结合的hsp70、hsp90、gp96、钙网蛋白、hsp 110或grp 170或其与肽结合的非共价的或共价复合物。
在一个实施方案中，hsp70、hsp90、gp96、钙网蛋白、hsp 10或grp170与肽的共价或非共价复合物可在手术后从癌症患者获得的肿瘤细胞制备和纯化，用作本发明组合物中的特异复合物。
根据在此所描述的方法，内源性结合hsps或MHC抗原的免疫原性或抗原性的肽可用作特异性的抗原性分子。例如，可制备这种肽来刺激不同肿瘤抗原(例如，酪氨酸酶、gp100、黑素-A、gp75、粘蛋白等)和病毒蛋白质，包括但不限于，免疫缺陷病毒类型I(HIV-I)、人类免疫缺陷性病毒类型II(HIV-II)、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流行性感冒、水痘、腺病毒、单纯性疱疹类型I(HSV-I)、单纯性疱疹类型II(HSV-II)、牛瘟、鼻病毒、艾可病毒、轮状病毒、呼吸道合胞体病毒、乳头状瘤病毒、乳多空病毒、巨细胞病毒、棘病毒、虫媒病毒、huntavirus、柯萨奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒和脊髓灰质炎病毒的蛋白质的细胞毒素T细胞应答。在该实施方案中，其中抗原性分子是在体内结合Hsps的肽，该复合物可分离自细胞，或备选地，在体外产生自每种hsps和抗原性分子的纯化制剂。在一些实施方案中，该抗原性分子是外源性抗原及其片段和衍生物。
在另一个实施方案中，癌症(例如肿瘤)或传染性因子(例如病毒抗原、细菌抗原等)的抗原可以通过从天然源纯化、通过化学合成或重组方式，以及通过例如如下所述的结合hsps的体外方法获得。
在一个实施方案中，其中所使用的特异的hsp-抗原性分子的复合物是在活体内细胞中产生的复合物，可使用例如如下所述的示范性的纯化方法。备选地，在希望通过体外结合Hsps而使用抗原性分子的实施方案中，为了这种用途Hsps可在存在ATP或例如1、2、3、4、5或6的低pH时，从内源的hsp-肽复合物纯化。Hsps还可以化学合成或重组产生。在此所描述的方法可用来从任何真核细胞，例如组织、分离的细胞，或感染了预选的胞内病原体的无限增殖的真核细胞系、肿瘤细胞或肿瘤细胞系分离特异的Hsp-肽复合物或单独的Hsps。
5.1.1 Hsp-肽复合物的来源回收hsp-肽复合物的来源可根据所得到的hsp-肽复合物的预期用途来选择。既然hsp-肽复合物在所有的细胞中都有发现，则任何组织或细胞样品都可用作来源。Hsp-肽复合物也可经坏死性的细胞死亡从细胞释放到细胞环境中；因此体液、分泌物、培养物上清液、发酵培养基等都可以是回收hsp-肽复合物的来源。
Hsp-肽复合物可从癌性的或受感染的细胞中回收。受感染的和癌性的细胞可适当地通过本领域已知的方法从非癌性的或未感染的细胞(例如，正常细胞)体外制备。(参见例如美国专利号6,017,540，其在此全部引入作为参考。)对于与传染性疾病的治疗和预防相关的应用，抗原性的hsp-肽复合物可从任何受感染的细胞获得，包括完整的组织、分离的细胞，和用胞内病原体感染或转化的无限增殖的细胞系。该抗原性的hsp-肽复合物可回收自受传染性因子，以及特别是受胞内病原体感染的细胞。已经证明包含分离自受胞内病原体感染的细胞的抗原性的hsp肽复合物，并随后施用于哺乳动物的疫苗可有效地刺激针对受相同病原体感染的细胞的细胞免疫应答。具体地，该免疫应答通过靶向并破坏包含胞内病原体的细胞的细胞毒素T细胞级联而介导。尽管不限于胞内病原体，但是在此所使用的胞内病原体包括任何能存活的生物体，包括但不限于，能够在哺乳动物细胞内存在并导致哺乳动物中疾病的病毒、细菌、真菌、原生动物和胞内寄生物。
Hsp-肽复合物可回收自受病毒感染的细胞，该病毒包括但不限于，甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流行性感冒、水痘、腺病毒、HSV-1、HSV-II、牛瘟鼻病毒、艾可病毒、轮状病毒、呼吸道合胞体病毒、乳头状瘤病毒、乳多空病毒、巨细胞病毒、棘病毒、虫媒病毒、huntavirus、柯萨其病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、HIV-I和HIV-II。此外，抗原性的hsp-肽复合物还可收集自用病毒基因转染的细胞。
Hsp-肽复合物可回收自细菌感染的细胞，包括但不限于，用导致肺结核、淋病、伤寒、脑膜炎、骨髓炎、脑膜炎球菌败血症、子宫内膜炎、结膜炎、腹膜炎、肾盂肾炎、咽炎、败血症septic arghritis、蜂窝组织炎、会厌炎、输卵管炎、中耳炎、志贺菌痢疾、肠胃炎等细菌感染的细胞。在优选的实施方案中，该hsps或hsp-肽复合物也可回收自用胞内细菌感染的细胞，该细菌包括但不限于，分枝杆菌、立克次氏体、支原体、奈瑟氏菌和军团菌。
Hsp-肽复合物还可回收自用包括但不限于利什曼虫、Kokzidioa和锥虫属的胞内原生动物感染的细胞。此外，hsps或hsp-肽复合物可回收自用包括但不限于衣原体和立克次氏体的胞内寄生物感染的细胞。Hsp-肽复合物也可以回收自用细菌感染的细胞系。
可使用分离自癌症，包括分离自转移到多重位点的癌症的组织或细胞作为本方法中hsps或hsp-肽复合物的来源。例如，也可使用在血液、淋巴或其他体液中循环的白血病细胞，还可使用实体瘤组织(例如，来自活体检查的初生组织)。
Hsp-肽复合物可回收自肿瘤细胞，包括但不限于，例如在原发点为间充质的肿瘤(肉瘤)即，纤维肉瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；软骨肉瘤；骨肉瘤；血管肉瘤；内皮肉瘤；淋巴管肉瘤；滑膜肉瘤；间皮肉瘤；尤文氏肉瘤；粒细胞性白血病；单核细胞性白血病；恶性淋巴瘤；淋巴细胞白血症；浆细胞瘤；平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤。此外，预期该方法可用于从在原发点为上皮细胞的肿瘤(癌)的肿瘤细胞回收hsps或hsp-肽复合物，即鳞状上皮细胞或表皮癌；基底细胞癌；汗腺癌；皮脂腺癌；腺癌；乳头状癌；乳头状腺癌；囊腺癌；髓样癌；未分化癌(单一的癌)；支气管癌；支气管肺癌；黑素癌；肾细胞癌；肝细胞癌；胆管癌；乳头状癌；转移细胞癌；鳞状上皮细胞癌；绒毛膜癌；精原细胞瘤；胚胎癌恶性畸胎瘤和畸胎癌。Hsps或hsp-肽复合物还可回收自白血病细胞，例如，急性淋巴细胞性白血病和急性髓细胞性白血病(原粒细胞的、早幼粒细胞的、骨髓单核细胞的、单核细胞的和红白血病)；慢性白血病(慢性髓细胞的(有粒白细胞的)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)；和真性红细胞增多症、淋巴瘤(Hodgkin’s病和非Hodgkin’s病)、多发性骨髓瘤、Waldenstrom′s巨球蛋白血症和重链病。hsp-肽复合物可以通过从化学致癌物或辐射诱导的肿瘤的肿瘤细胞回收。化学致癌物包括与香烟烟雾相关的致癌物，例如烃类和致癌的气体、食物、化妆品或其他的污染物。hsp-肽复合物可回收自肿瘤细胞系。
对于涉及疾病的诊断、预后或计量对治疗的应答，特别是对免疫治疗或疫苗应答的相关应用，hsp-肽复合物可回收自体液、血液、淋巴等。
5.1.2 Hsp70-肽复合物的制备和纯化hsp70-肽复合物的纯化先前已有描述，参见例如，Udono等人，1993，J.Exp.Med.1781391-1396。可使用的方法提供如下，例如但不限于最初，肿瘤细胞悬浮在由30mM碳酸氢钠pH 7.5，和1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)组成的3体积的1×裂解缓冲液中。然后，超声处理沉淀颗粒，置于冰上，直到通过显微镜检确定为＞99％的细胞裂解。作为超声处理的替代，细胞可以通过机械剪切裂解并且在该处理中一般将细胞重悬于30mM碳酸氢钠pH 7.5，1mM PMSF中，在冰上孵育20分钟并随后在Dounce匀浆器中均质化直到＞95％的细胞裂解。
然后在1,000g离心该裂解物10分钟以除去未破损的细胞、细胞核和其他细胞碎屑。所得到的上清液在100,000g再离心90分钟，收获该上清液并随后与用包含2mM Ca2+和2mM Mg2+的磷酸盐缓冲盐水(PBS)平衡的Con A Sepharose混合。当通过机械剪切裂解该细胞时，该上清液在与Con A Sepharose混合之前用等体积的2×裂解缓冲液稀释。然后容许该上清液与Con A Sepharose在4℃结合2-3小时。收获未结合的物质并相对于10mM Tris-乙酸pH 7.5，0.1mM EDTA，10mMNaCl，1mM PMSF透析36小时(3次，每次100体积)。然后将该渗析液在17,000rpm(Sorvall SS34转子)离心20分钟。然后收获所得到的上清液并且施加到用20mM Tris-乙酸pH 7.5，20mM NaCl，0.1mMEDTA和15mM 2-巯基乙醇平衡的Mono Q FPLC柱上。然后将该柱用20mM-500mM的NaCl梯度洗脱并随后通过十二烷磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分级洗脱级分，并且使用适当的抗hsp70抗体(例如来自StressGen的克隆N27F3-4)通过免疫印迹表征。
汇集对抗hsp70抗体有强免疫活性的级分并且用硫酸铵沉淀hsp70-肽复合物；特异地用50％-70％的硫酸铵切开。然后所得到的沉淀物通过在17,000rpm(SS34Sorvall转子)离心并且用70％的硫酸铵洗涤收获。然后溶解洗涤过的沉淀并且通过在SephadexR G25柱(Pharmacia)上凝胶过滤除去任何残余的硫酸铵。如有必要，如此获得的hsp70制品可如上所述通过Mono Q FPLC柱重提纯。
可使用本方法将该hsp70-肽复合物纯化至明显的均一性。一般可从1g细胞/组织纯化1mg的hsp70-肽复合物。
纯化hsp70-肽复合物的改进方法包括将细胞蛋白质接触ADP或附着于固体基质的ATP的非水解类似物，以使得裂解物中的hsp70可结合ADP或非水解的ATP类似物，并且洗脱结合的hsp70。优选的方法使用附着于固体基质的ADP的柱色谱法(例如，ADP-琼脂糖)。参见，例如，Peng，1997，免疫方法杂志J.Immuno.Meth.20413-21。所得到的hsp70制品是较高纯度的。hsp70的产率也显著增加大约超过10倍。备选地，使用ATP的非水解类似物代替ADP的色谱法可被用于纯化hsp70-肽复合物。例如但不限于，hsp70-肽复合物的纯化可以通过ADP-琼脂糖色谱法如下进行Meth A肉瘤细胞(5亿个细胞)在低渗缓冲液中均质化并且该裂解物于4℃在100,000g离心90分钟。将上清液施加到ADP-琼脂糖柱上。该柱在缓冲液中洗涤并且用5柱体积的3mM ADP洗脱。将该hsp70-肽复合物在洗脱的总的15个级分中通过10个级分洗脱在级分2中。该洗脱级分经SDS-PAGE分析。可使用这些方法将该hsp70-肽复合物纯化至明显的均一性。
5.1.3 Hsp90-肽复合物的制备和纯化可使用的方法例如但不限于如下所提供的最初，将肿瘤细胞悬浮在由30mM碳酸氢钠pH 7.5，和1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)组成的3体积的1×裂解缓冲液中。然后，超声处理沉淀颗粒，置于冰上，直到通过显微镜检确定＞99％的细胞被裂解。作为超声处理的替代，可以通过机械剪切裂解细胞并且在该处理中细胞一般被重悬于30mM碳酸氢钠pH 7.5，1mM PMSF中，在冰上孵育20分钟并随后在Dounce匀浆器中均质化直到＞95％的细胞被裂解。
然后在1,000g离心该裂解物10分钟以除去未破损的细胞、细胞核和其他细胞碎屑。将所得到的上清液在100,000g再离心90分钟，收获该上清液并随后与用包含2mM Ca2+和2mM Mg2+的PBS平衡的ConA Sepharose混合。当通过机械剪切裂解细胞，上清液在与Con ASepharose混合之前用等体积的2×裂解缓冲液稀释。然后容许该上清液与Con A Sepharose在4℃结合2-3小时。收获未结合的物质并相对于pH 7.4，0.1mM的EDTA，250mM的NaCl，1mM PMSF透析36小时(3次，每次100体积)。然后渗析液于17,000rpm(Sorvall SS34转子)离心20分钟。然后收获所得到的上清液并施加到用透析缓冲液平衡的Mono Q FPLC柱上。然后用200mM-600mM NaCl的盐梯度洗脱该蛋白质。
所洗脱的级分通过SDS-PAGE分级并且将包含hsp90-肽复合物的级分通过使用抗hsp90抗体，例如3G3(Affinity Bioreagents)的免疫印迹鉴定。可使用这些方法将Hsp90-肽复合物纯化至明显的均一性。一般可从1g细胞/组织纯化150-200μg的hsp70-肽复合物。
5.1.4 Gp96-肽复合物的制备和纯化可使用的方法提供如下，例如但不限于将肿瘤的沉淀颗粒重悬在3体积的由30mM碳酸氢钠缓冲液(pH7.5)和1mM PMSF组成的缓冲液中，并且容许细胞在冰上膨胀20分钟。然后将该细胞沉淀颗粒在Dounce匀浆器(匀浆器的适当间隙可根据各种细胞类型变化)中在冰上均质化直到＞95％的细胞被裂解。
在1,000g离心该裂解物10分钟以除去未破损的细胞、细胞核和其他细胞碎片。然后将来自该离心步骤的上清液于100,000g再次离心90分钟。gp96-肽复合物可纯化自100,000个沉淀颗粒或上清液。
当从上清液纯化时，将上清液用等体积的2×裂解缓冲液稀释并且将上清液与用包含2mM Ca2+和2mM Mg2+的PBS平衡的Con ASepharose于4℃混合2-3小时。然后，将匀浆填柱并且用1×裂解缓冲液洗涤直到OD280降至基线。然后，将该柱用1/3柱床体积的溶于含有2mM Ca2+和2mM Mg2+的PBS的10％α-甲基甘露糖苷(α-MM)洗涤，用石蜡膜片密封该柱，并且于37℃孵育15分钟。然后将该柱冷却到室温并且除去柱底部的石蜡膜。将5柱体积的α-MM缓冲液施加到柱上并且通过SDS-PAGE分析洗脱液。一般所得到的物质大约为60-95％纯，然而这取决于细胞类型和所使用的组织相对于裂解缓冲液的比率。然后将样品施加到用含有5mM磷酸钠，pH 7的缓冲液平衡的Mono Q FPLC柱(Pharmacia)上。再用0-1M的NaCl梯度从柱上洗脱蛋白质并且gp96级分在400mM和550mM NaCl之间洗脱。
然而，可以通过2个单独或结合使用的附加步骤来改进该方法，以不断地产生明显均质化的gp96-肽复合物。一个任选的步骤包括在ConA纯化步骤前的硫酸铵沉淀而另一个任选的步骤包括在Con A纯化步骤后代替Mono Q FPLC步骤的DEAE-Sepharose纯化。
在第一个任选的步骤中，例如如下描述，将由100,000g离心步骤产生的硫酸铵上清液通过加入硫酸铵而产生50％硫酸铵的终浓度。缓慢加入硫酸铵，同时在置于一托盘冰水中的烧杯中温和搅拌溶液。该溶液于4℃搅拌大约1/2-12小时，并将所得到的溶液于6,000rpm(Sorvall SS34转子)离心。除去由该步骤产生的上清液，通过加入硫酸铵溶液而产生70％的硫酸铵饱和度，并于6,000rpm离心(SorvallSS34转子)。收获由此步骤所得到的沉淀颗粒并且悬浮在含有70％硫酸铵的PBS中以漂洗该沉淀颗粒。将该混合物于6,000rpm(SorvallSS34转子)离心并将沉淀颗粒溶于含有2mM Ca2+和Mg2+的PBS中。未溶解的物质通过于15,000rpm(Sorvall SS34转子)的短暂离心而除去。然后，该溶液与Con A Sepharose混合并且遵循如前所述的方法。
在第二个任选的步骤中，例如如下描述，收集包含洗脱自Con A柱的级分的gp96并通过透析将缓冲液交换为5mM磷酸钠缓冲液，pH7,300mm NaCl，或优选地通过在Sephadex G25柱上交换缓冲液。缓冲液交换后，将该溶液与预先用5mM磷酸钠缓冲液pH 7，300mM的NaCl平衡的DEAE-Sepharose混合。将该蛋白质溶液和珠温和地混合1小时并灌入柱。然后，将该柱用5mM磷酸钠缓冲液，pH7，300mMNaCl洗涤，直到280nm处的吸光率降低到基线。再从柱上用5体积的5mM磷酸钠缓冲液，pH 7，700mM NaCl洗脱结合的蛋白质。汇集含有蛋白质的级分并用5mM磷酸钠缓冲液，pH 7稀释以降低盐浓度到175mM。然后将所得到的物质施加到用5mM磷酸钠缓冲液，pH 7平衡的Mono Q FPLC柱(Pharmacia)上，并将结合Mono Q FPLC柱(Pharmacia)的蛋白质如前所述洗脱出来。
然而可以认识到，本领域的技术人员可以通过常规实验评估将第二个任选步骤合并入纯化方法的效益。此外，也可认识到增加每个任选步骤的效益可能取决于起始材料的来源。
当gp96级分分离自100,000g沉淀颗粒，将该沉淀颗粒悬浮于5体积的含有1％脱氧胆酸钠或1％氧酰果(oxtyl)吡喃葡糖苷的PBS(但无Mg2+和Ca2+)中并且在冰上孵育1小时。将该悬浮液于20,000g离心30分钟并将所得到的上清液相对于PBS的几种改变(也无Mg2+和Ca2+)透析以除去去污剂。将该透析液于100,000g离心90分钟，收获上清液，并且分别将钙和镁加入上清液至2mM的终浓度。然后参见上面，通过从100,000g上清液分离gp96-肽复合物的未改进的或改进的方法来纯化样品。
可以使用该方法将gp96-肽复合物纯化到明显的均一性。可从1g细胞/组织分离10-20μg的gp96。
从gp96-肽复合物分离hsp可在存在ATP或低pH时进行。可使用这两个方法从gp96-肽复合物洗脱肽。第一个途径包括在存在ATP时孵育gp96-肽复合物制品。另一个途径包括在低pH缓冲液中孵育gp96-肽复合物制品。可以应用这些方法和本领域已知的任何其它方法从hsp-肽复合物分离hsp和肽。
5.1.5 Hsp110-肽复合物的制备和纯化由Wang等人，2001，J.Immunol.166(1)490-7描述的可使用的方法提供如下，例如但不限于细胞或组织的沉淀颗粒(40-60ml)，例如肿瘤细胞组织的沉淀颗粒，在5体积的低渗缓冲液(30mN碳酸氢钠，pH7.2，和蛋白酶抑制剂)中经Dounce匀浆作用而均质化。该裂解物于4,500×g离心以及随后在100,000×g离心2小时。如果该细胞或组织源于肝，则首先将所得到的上清液施加到蓝色的Sepharose柱(Pharmacia)上以除去白蛋白。另外，将所得到的上清液施加到预先用结合缓冲液(20mMTris -HCl，pH 7.5；100mM NaCl；1mM MgCl2；1mM CaCl2；1mM MnCl2；和15mM 2-ME)平衡的Con A-Sepharose柱(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上。将结合的蛋白质用含有15％α-D-o-甲基甘露糖苷(Sigma，St.Louis，MO)的结合缓冲液洗脱。
将未与Con A-Sepharose结合的物质首先相对于20mMTris-HCl，pH 7.5；100mM NaCl和15mM 2-ME的溶液进行透析，并随后施加到DEAE-Sepharose柱上并经100-500mM NaCl的盐梯度洗脱。收集含有hsp110的级分，进行透析，并加载到用20mM Tris-HCl，pH7.5；200mM NaCl；和15mM2-ME平衡的Mono Q(Pharmacia)10/10柱上。将结合的蛋白质用200-500mM的NaCl梯度洗脱。级分如王等人，1999，J.Immunol.1623378所描述的经SDS-PAGE分析，然后用hsp 110的抗体进行免疫印迹。含有hsp110的所收集的级分经Centriplus(Amicon，Beverly，MA)浓缩并施加到Superose 12柱(Pharmacia)上。将蛋白质经流速为0.2ml/min的40mM Tris-HCl，pH 8.0；150mM NaCl；和15mM2-ME洗脱。
5.1.6 Grp-170-肽复合物的制备和纯化由王等人，2001，J.Immunol.166(1)490-7所描述的可使用的方法提供如下，例如但不限于将细胞或组织的沉淀颗粒(40-60ml)，例如肿瘤细胞组织的沉淀颗粒，在5体积的低渗缓冲液(30mN碳酸氢钠，pH7.2，和蛋白酶抑制剂)中经Dounce匀浆作用而均质化。将该裂解物于4,500×g离心以及随后在100,000×g离心2小时。如果该细胞或组织原于肝，则首先将所得到的上清液施加到蓝色的Sepharose柱(Pharmacia)上以除去白蛋白。另外，将所得到的上清液施加到预先用结合缓冲液(20mMTris-HCl，pH 7.5；100mM NaCl；1mM MgCl2；1mM CaCl2；1mMMnCl2；和15mM 2-ME)平衡的Con A-Sepharose柱(PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)上。将结合的蛋白质用含有15％α-D-o-甲基甘露糖苷(Sigma，St.Louis)的结合缓冲液洗脱。
Con A-Sepharose-结合的物质首先相对于20mM Tris-HCl，pH7.5，和150mM NaCl进行透析，并随后施加到Mono Q柱上以及经150-400mM的NaCl梯度洗脱。浓缩收集的级分并施加到Superose 12柱(Pharmacia)上。收集含有均质化的grpl70的级分。
5.1.7 HSPs的重组表达可以使用本领域已知的方法来重组生产hsps。可以将编码热休克蛋白的核酸序列插入在宿主细胞中用于增殖和表达的表达载体中。
如在此所使用的表达构建体，是指编码与一种或多种能够使hsp在合适的宿主细胞中表达的调控区域可操作地相关的hsp的核苷酸序列。″可操作地相关的″是指其中调控区域和待表达的hsp序列相连并且以容许转录和最终翻译的方式安置的联系。
为hsp的转录所必需的调控区域可由表达载体提供。如果要表达缺乏其同源的起始密码子的hsp基因序列，则可以提供翻译的起始密码子ATG。在适合的宿主-构建体系统中，细胞转录因子，例如RNA聚合酶可结合表达构建体上的调控区域以在宿主生物体中影响改进的hsp序列的转录。基因表达所需的调控区域的精确特性可以根据宿主细胞的不同而改变。一般地，需要能够结合RNA聚合酶并促进可操作地结合的核酸序列的转录的启动子。这种调控区域可以包括与转录和翻译起始相关的5′非编码序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。编码序列的3′非编码区域可以包含转录的终止调控序列，例如终止子和多聚腺苷酸酸化位点。
为了使具有调控功能的DNA序列，例如启动子附着于hsp基因序列上或将hsp基因序列插入载体的克隆位点，可以将提供适当相容的限制性酶切位点的接头或适配接头通过本领域公知的技术(Wu等人，1987，酶学方法Methods in Enzymol，152343-349)连接到cDNAs的末端。用限制性内切酶切割后可进行改变以通过向后消化产生平末端或填平单链DNA的末端，然后连接。备选地，可以通过使用含有所需限制性内切酶位点的引物的PCR扩增DNA而将所需的限制性内切酶位点引入DNA片段。
可将包括与调控区域可操作地相关的hsp序列的表达构建体直接引入适当的宿主细胞，以用于hsp-肽复合物的表达和生产而不需要进一步的克隆。参见，例如，美国专利号No.5,580,859。表达构建体也可包含易于将hsp序列，例如通过同源重组整合到宿主细胞基因组中的DNA序列。在这种情况下，不必使用包括适用于合适宿主细胞的复制原点的表达载体，以在该宿主细胞中增殖和表达hsp。
可使用的多种表达载体包括但不限于质粒、粘性质粒、噬菌体、噬菌粒或修饰的病毒。一般地，这种表达载体包括用于在适当的宿主细胞中增殖载体的复制的功能性原点，用于插入hsp基因序列的一种或多种限制性核酸内切酶位点和一种或多种筛选标记。该表达载体必须与可能来源于原核或真核生物体的相容的宿主细胞一起使用，该生物体包括但不限于细菌、酵母、昆虫、哺乳动物和人。
对于适当加工的hsp或hsp-肽复合物的长时间、高产率生产，在哺乳动物细胞中的稳定表达是优选的。可以通过使用包含可选择标记的载体而将稳定表达hsp或hsp-肽复合物的细胞系工程化。例如但不限于，根据表达构建体的导入，可容许工程化的细胞在富集培养基中生长1-2天，并随后转移到选择培养基中。表达构建体中的选择性标记赋予对筛选的抗性并最适地容许细胞稳定地将表达构建体整合到其染色体中，以及在培养基中生长并扩展为细胞系。这种细胞可长期培养，同时连续不断地表达hsp。
重组的细胞可在温度、孵育时间、光密度和培养基组合物的标准条件下培养。然而，重组细胞的生长条件可能与表达hsps和抗原性蛋白质的条件不同。也可使用改进的培养条件和培养基来增加hsp的生产。例如，可将包含hsps和其同源的启动子的重组细胞暴露于加热或其他环境应力或化学应力。可应用本领域已知的任何技术来建立用于生产hsp或hsp-肽复合物的最优条件。
5.1.8肽的合成可代替重组技术生产hsp的备选方法是肽的合成。例如，整个hsp或相当于hsp部分的肽可以通过使用肽合成仪合成。可使用常规的肽合成方法或本领域公知的其他合成方法。
具有hsp或其部分氨基酸序列的肽可使用与由Merrifield，1963，J.Am.Chem.Soc.，852149所描述的相似方法通过固相肽合成法合成。在合成中，将具有经保护的侧链的N-α-保护的氨基酸逐步加入到由其C末端连接的增长的多肽链和不溶的聚合支持物，即聚苯乙烯珠上。通过将N-α-去保护氨基酸的氨基连接到已经通过将其与例如二环己基碳二亚胺的试剂反应而活化的N-α-去保护氨基酸的羧基上而合成肽。将自由氨基连接到活化的羧基上导致肽键的形成。最通常使用的N-α-保护基包括酸不稳定的Boc和碱不稳定的Fmoc。详细的合适的化学物质、树脂、保护基、保护的氨基酸和试剂是本领域公知的，因此在此不详细论述(参见，Atherton等人，1989，Solid Phase PeptideSynthesisA Practical Approach，IRL Press，和Bodanszky，1993，Peptide Chemistry，A Practical Textbook，第二版，Springer-Verlag)。
所得到的hsp的纯化可使用常规方法完成，例如使用凝胶渗透、分配的制备性的HPLC和/或离子交换色谱法。合适的基质和缓冲液的选择是本领域公知的，因此在此不详细描述。
5.2确定ATP酶活性的方法根据本发明，可使hsp或hsp-肽复合物的ATP酶活性相互关联，并因此确定hsp或hsp-肽复合物的生物活性。本发明的方法可用于检测样品中有生物学活性的hsp或hsp-肽复合物的存在或缺乏。该方法可以是定量的，以使得当样品中hsp或hsp-肽复合物的量是已知的时，可推导出比生物活性。样品中hsp或hsp-肽复合物的比生物活性可用于评估样品的治疗或预防数量。该比活性还可用于比较含有hsp或hsp-肽复合物的样品的生物学活性。该方法可进一步包括在存在格尔德霉素或任何其他结合hsps的核苷酸的特定抑制剂(例如，腺苷类似物5′-N-乙基酰胺基-腺苷(NECA))时确定ATP酶活性，其中受到存在的格尔德霉素或任何其他结合核苷酸的特定抑制剂抑制的ATP酶活性与生物学活性相关。当其他类型的ATP酶可能存在于样品中时，该步骤是特别有效的。
可以测量ATP酶活性的任何方法都能使用。非限制性的实例包括涉及ATP、ADP和/或AMP的形成或消耗的酶反应，例如但不限于基于发光酶的分析，以及检测ATP、ADP、AMP和/或无机磷酸盐的浓度和/或数量的方法，例如但不限于离子交换色谱法。
在一个特定的实施方案中，可以使用生物发光的ATP分析。例如但不限于，该分析可如下进行
使用Millipore BIOMAX spin柱(10Kda MWCO)将蛋白质样品浓缩到蛋白质浓度为500μg/ml。将Gp96(1μg)与含有20％DMSO或包含400μM特异抑制剂格尔德霉素的20％DMSO的ATP(10-30倍摩尔过量的)溶液混合。然后将该混合物于37℃孵育4小时。随后，用PBS将单个样品稀释到100μL。通过使用分子装置Lmax光度计和ROCHE CLII生物发光试剂盒将50μL各个样品中含有的ATP与ATP标准曲线相比较而定量。DMSO和DMSO/格尔德霉素测量值之间ATP浓度的差异表示特异于gp96水解的ATP的数量。作为备选的，在该分析中可以将格尔德霉素替换为NECA。
在另一个实施方案中，可以使用离子交换色谱法。例如但不限于，该分析可如下进行将-0.5mg/mL的Gp96样品与10×摩尔比的ATP于37℃，在存在5mM MgCl2和25mM KCl的PBS中孵育。在多个时间点采集等分样品并且使用离子交换HPLC系统确定剩余的ATP。对于格尔德霉素抑制实验，将格尔德霉素以相对于ATP为1∶1、2∶1、5∶1和10∶1的比率加入混合物。在多个时间点采集等分样品用于ATP分析。经酪蛋白激酶II的ATP水解在下列条件下进行测试将0.5U/mL酪蛋白激酶II与20μg/mL ATP、有或无格尔德霉素(格尔德霉素相对于ATP的比率为1∶1，1∶2，1∶5和1∶10)的2mg/ml酪蛋白混合，并于37℃，在含有10mM MgCl2、130mM KCL和5mM DTT的40mMHEPES中孵育。在多个时间点采集等分样品并分析ATP浓度。
通过使用Partisil SAX柱(2.1×250mm，10μm，Alltech)的离子交换HPLC测量ATP浓度，并且以0.25mL/min，使用0.3-1M磷酸铵的线性梯度在25分钟内进行洗脱。所有的色谱法在Waters AllianceHPLC系统上以215nm的吸光率进行检测。完全分离的ATP形成ADP和AMP，并且根据使用ATP标准曲线的峰面积而量化。对于gp96的特异性ATP酶活性可以表示为每毫克gp96蛋白质每小时的ATP水解数量(nmol/mg/hr)。对于酪蛋白激酶II的特异性ATP酶活性可表示为每单位蛋白质每小时的ATP水解数量(nmol/U/hr)。所有比率的值相对于单独含有ATP而没有加入gp96或酪蛋白激酶II的样品所确定的背景水解进行校正。
还可使用利用[γ-32P]标记的ATP和薄层色谱法的免疫亲和分离技术测量ATP酶活性，例如但不限于提供如下。(Li和Srivastava(1993)EMBO J.123143；Wearsch和Nicchitta(1997)J.Biol.Chem.2725152)一般地，1μg纯化的gp96或hsp70与20μM[γ-32P]ATP在含有20mM HEPES，pH7.2，20mM NaCL和2mM MgCl2的20μl反应体积中于37℃孵育1h。然后将1μl反应混合物点到聚亚乙基亚胺(PEI)纤维素板上。相对于1∶1比率的1M LiCl和1M HCOOH进行薄层色谱。然后干燥平板，暴露于感光胶片并且切除和计算相应的放射性斑点。从产生自[γ-32P]ATP的[α-32P]ADP和[α-32P]AMP的数量确定ATP酶活性，即以[ADP+AMP]/[ATP+AMP+ADP]×100％计算的ATP水解的百分比。减去缺乏纯化的gp96或hsp70的背景的ATP水解。
还可使用HPLC测量ATP酶活性。如下列提供，例如但不限于将Gp96(2μg；PBS中200μg/ml)加入等体积的含有ATP(160μM)、10mM MgCl2和20％DMSO的PBS。在对照实验中，将格尔德霉素(160μM)溶于DMSO而代替单独的DMSO。并于37℃孵育混合样品4小时。接着，加入80μL 100mM的KH2PO4(pH 4.0)以淬灭反应并将样品加载入HPLC自动采样器以用于注射。使用在含有1％乙腈的60mM KH2PO4(pH 6.0)中平衡的Aquasil C18柱(250mm×4.6mm)而分离自ATP的ADP。流速是0.5ml/min。根据自动化的峰值积分法将ADP的数量定量并且与ADP标准曲线比较。
还可使用本领域已知的放射性同位素分析来确定hsp或hsp-肽-复合物的ATP酶活性。
5.3通过大小确定寡聚结构的方法根据本发明，hsp或hsp-肽复合物的寡聚结构可用于确定hsp或hsp-肽复合物的生物活性。本发明的方法可用于检测样品中有生物学活性的hsp或hsp-肽复合物的存在或缺乏。该方法可以是定量的，以使得当样品中hsp或hsp-肽复合物的量是已知的时，可推导出特定的生物活性。样品中hsp或hsp-肽复合物特定的生物活性可用于估计治疗或预防的样品数量。该比活性还可用于比较含有hsp或hsp-肽复合物的样品的生物学活性。
本领域已知的用于检测或测量存在寡聚结构的任何方法都能被使用。优选地，该方法被设计成能用于hsp。还可以使用监测寡聚化进程的方法。
在一个特定的实施方案中，可使用大小排阻色谱法。由Chadli等人(1999)J.Biol.Chem.2744133-4139描述的方法，提供如下，例如但不限于使用FPLC系统(Amersham pharmacia Biotech)的大小排阻色谱，于4℃在用50mM Tris-HCL，pH 8.65平衡的Superose 6或Superose 1210/30柱上进行。洗脱使用相同的缓冲液以0.2ml/min的流速进行。通过在280nm的UV吸光率检测所洗脱的蛋白质。将该柱用AmershamPharmacia Biotech的高和低分子量标准化试剂盒校准。所使用的标准是甲状腺球蛋白(669kDa)、铁蛋白(440kDa)、过氧化氢酶(232kDa)、醛缩酶(158kDa)、牛血清白蛋白(67kDa)和胰凝乳蛋白酶原(25kDa)。分别使用蓝色萄聚糖和重铬酸钾确定空体积和总体积。
在另一个实施方案中，可以使用SDS和Native PAGE。由Chadli等人(1999)J.Biol.Chem.2744133-4139描述的方法，提供如下，例如但不限于SDS和Native PAGE和银染在Phast系统(Amersham PharmaciaBiotech)上进行。分子量校准试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)包括磷酸化酶b(94kDa)、牛血清白蛋白(67kDa)、卵白蛋白(43kDa)、碳酸酐酶(30kDa)、大豆胰蛋白酶抑制剂(20kDa)和α-乳白蛋白(14.4kDa)。
于4℃在Multipore II(Amersham Pharmacia Biotech)上使用10％的聚丙烯酰胺Clean凝胶，375mM Tris缓冲液，pH 8.9进行NativePAGE。使用包含甲状腺球蛋白(669kDa)、铁蛋白(440kDa)、过氧化氢酶(232kDa)、乳酸盐脱氢酶(140kDa)和牛血清白蛋白(67kDa)的校准试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)，根据制造商的推荐评估蛋白质的表现分子量。银染条带的扫描在使用生物图像软件(Millipore)的Omni介质扫描仪设备上进行。
将在native PAGE上分辨的Hsp样品电转移到硝化纤维素上。将空气干燥的过滤物在含有10％脱脂奶粉的PBS、0.05％ Tween 20(PBST)中孵育2h，用PBST洗涤，与抗hsp90抗体Ab119(37)(1∶4000)或d7α(28)(1∶4000)孵育2h，用PBST洗涤，与抗兔或抗鼠的抗体一起孵育1h，用PBST洗涤，并用ECL(Amersham PharmaciaBiotech)显色。
另一个实施方案中，可使用凝胶过滤色谱法。由Wearsch和Nicchitta(1996)Biochem.3516760-9描述的方法提供如下，例如但不限于TSK-GEL g3000 SW分析凝胶过滤柱(Tosohaus，Montgomeryville，PA)在PBS(磷酸盐缓冲盐水)或缓冲液A(110mMKOAc，25nM K-HEPES，pH 7.2，20mM NaCl，1mM Mg(OAc)2，0.1mM CaCl2)中平衡。将125μL体积的样品以0.6mL/min的流速注射到柱上。收集0.5mL的级分并经SDS-PAGE分析。每个样品的Stokes半径(Rs)通过与标准(甲状腺球蛋白，Rs＝8.5nm，660kDa；去铁铁蛋白，Rs＝3.5nm，66kDa；卵白蛋白，Rs＝3.1nm，43kDa)相比较而确定。其中指明，grp94在分析前于室温与4mM Zwittergent3-12在125μL的缓冲液A或1×PBS中孵育45分钟。
在另一实施方案中，可以使用双向电泳。由Wearsch和Nicchitta(1996)Prot.Exp.Pur.7114-121描述的方法提供如下，例如但不限于对于第一维(非还原的)，将样品置于0.5M Tris、5％SDS、0.01％溴酚蓝中并在55℃加热10分钟。制备2个1μg的纯化grp94样品，其中在样品缓冲液中包含50mM DTT。包含5微克的高分子量标准和IgG作为对照。将样品加载到注入毛细管的7.5％凝胶上并在Mini-ProteanII 2-D Cell(Bio-Rad)中以200V电泳。提取管状凝胶，在0.5M Tris，5％SDS，0.1M DTT中于55℃孵育15分钟，覆盖到预备的7.5％平板凝胶上，并且在第二维上电泳。将蛋白质用考马斯蓝染色剂显色。
还可使用速率沉积法确定hsp或hsp-肽复合物的多聚体结构。下列分析，如由Wearsch和Nicchitta(1996)Biochem.3516760-9所进行的，例如呈现如下，但不限于对于沉降系数(s)的确定，在平行于已知标准的蔗糖梯度上分析样品。对天然的grp94，弹性蛋白酶-消化的grp94和体外合成的grp94-ΔC(参见构建体的制备)在补充有缓冲液A的15-30％蔗糖的梯度上进行分析。对体外合成的grp94-Cexp翻译产物和grp94-MBP融合蛋白质在补充有PBS的10-25％蔗糖梯度上进行分析。制备11.5mL的梯度并用Auto Densi-Flow IIc(Buchler Instruments，Lenexa，KS)收获。将200μL体积的样品加载到梯度上并在Beckman SW41转子中以40,000rpm在室温下离心20h。使用过氧化氢酶(11.3S)、酵母乙醇脱氢酶(7.4S)、BSA(4.3S)、卵白蛋白(3.5S)和胰凝乳蛋白酶原A(2.6S)作为标准。从梯度中收集0.5mL的级分并通过SDS-PAGE(grp94样品)或通过280nm的吸光率(蛋白质标准)分析。
也可由本领域的任何人员使用质谱法以确定gp96和/或gp 96复合物的寡聚结构。
在另一个实施方案中，以实施例的方式提供但不限于，可以使用过滤器确定gp96二聚体和/或gp96复合物二聚体的存在和/或数量。在优选的实施方案中，这种过滤器是分子量截止的过滤器，它容许特定大小的分子通过同时截留较大的分子。
在本发明的另一个实施方案中，使用光散射分析确定寡聚体的gp96和/或gp96复合物的存在或浓度。
在另一实施方案中，可以使用分析超离心来确定gp96二聚体和/或gp96复合物二聚体的存在和/或数量。该技术对于有经验的技术人员是公知的。
在另一个实施方案中，可以使用梯度离心确定gp96二聚体和/或gp96复合物二聚体的存在和/或数量。该技术对于有经验的技术人员是公知的。
5.4确定生物活性的方法根据本发明，可以使用hsp和/或hsp-肽复合物的寡聚结构或ATP酶的活性作为检测或测量hsp或hsp-肽复合物的生物活性的替代。特别感兴趣的hsp和/或hsp-肽复合物的生物活性包括但不限于免疫活性，例如，肽抗原呈递到抗原递呈细胞(抗原再呈递)和T细胞的活化；诱导生产生物应答修饰物质，例如但不限于细胞因子，例如，人巨噬细胞化学诱引蛋白质-1(MCP-1)和一氧化氮(NO)；受体，例如CD91(α-2-巨球蛋白受体，α2MR)和/或CD36的结合；抗原性分子的结合和释放；以及能够引起动物中肿瘤的退化，延长患肿瘤动物的存活期并消除感染。该生物活性可能在体内和/或体外发生或被观察到。
hsps结合肽的能力是表观的，但对于该肽加载的机制还不清楚。Gp96是在内质网中发现的蛋白质并在体外结合大量的肽而在体内没有明显的氨基酸特异性。
实际上，对于gp96在免疫应答中的作用，首先肽必须结合hsp(Sastry和Linderoth(1999)J.Biol.Chem.27412023-12035)。Sastry和Linderoth(上述)已经描述了检测肽与gp96结合的测定方法。简而言之，肽-芘与1摩尔过量的gp96于室温下在低盐缓冲液中(20mMHEPES，pH 7.9，20mM NaCl，2mM MgCl2)孵育10分钟。使用70,000分子量截止值的薄膜透析该混合物2h以除去任何未结合的肽-芘。通过340nm的激发而监测滞留物的荧光。在这个波长下，蛋白质的生色团(Trp和Tyr)不吸收紫外线，而只有芘被激发。
经hsps的抗原性肽的再呈递是另一个显著的生物活性。本发明者已经证明gp96二聚体结构的丢失与其抗原再呈递活性的丢失相关。经RAW264.7APCs介导的免疫应答和特异于gp96复合物肽的CTLs受到由CTLs分泌的IFN-γ水平的调节。IFN-γ是本领域已知的一般免疫状况指标的细胞因子；它也在肿瘤识别和排斥中扮演重要的角色。二聚的gp96能刺激IFN-γ以剂量依赖的方式分泌，同时聚集的gp96不刺激IFN-γ的分泌。再呈递测定例如但不限于，在第8节中的描述。
在应答hsp或hsp-肽复合物的出现时，抗原递呈细胞分泌MCP-1并产生NO。MCP-1在血液单核细胞和组织巨噬细胞的炎症性应答中扮演重要角色。NO也已经被证明是免疫应答的显著调节剂(Wei等人，(1995)自然Nature 375408-411)。
CD91/α2M受体是热休克蛋白的细胞表面受体。CD91/α2M受体在多种配体的胞吞作用中起作用。除α2M外，其他的α2MR配体包括脂蛋白-肽复合物、乳铁传递蛋白、组织型纤溶酶原激活剂(tPA)、尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)和外毒素。因此，α2M受体在多种细胞代谢过程中发挥作用，包括胞吞作用、抗原呈递、胆固醇调节、含有脂蛋白的ApoE的清除，以及乳糜微粒残余物的脱除。因此，本发明的方法可容许检测或测量hsp或hsp-肽复合物结合或阻遏其他分子结合CD91/α2M受体的能力。
CD36也已经显示作为热休克蛋白的受体而起作用。CD36是B类清除剂受体家族的成员并且主要在毛细血管内皮细胞、乳腺分泌上皮细胞、分化的脂肪细胞、B细胞、巨噬细胞和几种类型的肿瘤细胞中表达。CD36被认为在血小板粘附和聚集、凋亡细胞的吞噬作用和长链脂肪酸的代谢中起作用。特别地，热休克蛋白gp96已经显示结合CD36并在这些细胞中刺激一氧化氮和化学因子的产生。(Panjwani等人，2000，Cell Stress & Chaperones 5(4)373-397；2000年10月6日提交的美国临时申请No.60/238865)。因此，本发明的方法可容许检测或测量hsp或hsp-肽复合物结合或阻遏其他分子结合CD36的能力。
5.5质量控制和标准化中的用途根据本发明，hsp或hsp-肽复合物的寡聚结构或ATP酶活性可用于确定hsp或hsp-肽复合物的生物活性。本发明的方法可用于检测样品中有生物学活性的hsp或hsp-肽复合物的存在或缺乏。该方法可以是定量的，以使得当样品中hsp或hsp-肽复合物的量是已知的时，可推导出比生物活性。样品中hsp或hsp-肽复合物的比生物活性可用于评估样品的治疗或预防的数量。该比活性还可用于比较含有hsp或hsp-肽复合物的样品的生物学活性。
本发明的方法可用于在hsp-肽复合物的工业生产和贮存期间hsp-肽复合物制品的质量控制。hsp-肽复合物制品的质量方面包括可与其比活性相关的制品效价；与贮存要求、贮存历史相关的制品稳定性及其对效价的影响。本发明的方法还可用于确定或预测可源自于hsp或hsp-肽复合物的给定制品的剂量数目，特别是在对患者特异性的hsp-肽复合物的制品的范围内。
Hsps及其复合物具有许多商业用途。hsp-肽复合物用于治疗和预防癌症和传染性疾病的用途已经在美国专利号6,030,618；5,935,576；5,750,119；5961,979；6,048,530；5,837,251和6,017,540中有描述。在体外用于敏化抗原呈现细胞供过继性免疫疗法之用的应激蛋白-抗原复合物的用途在1997年3月20日PCT公开物WO 97/10002中有描述(也参见1999年11月16日公开的美国专利号5,985,270)。本发明的方法也对用于改进包括hsp或hsp-肽复合物的治疗的剂型和功效有用，例如在美国临时申请No.60/232,779；以及美国专利申请No.09/693,643中所描述的，其在此全部引入作为参考。
本发明的方法可用于替代在第5.5节中所描述的相对昂贵和繁重的生物测定。本发明的方法可用于在制造过程中监测调控需求的适应性。
5.6在诊断和预后中的用途在一个实施方案中，本发明提供用于诊断部分归因于受试个体免疫系统功能的受试个体状况的方法，所述的方法包括使获得自受试个体的热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的ATP酶活性或热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的二聚体的存在与热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的生物活性相关。既然生物活性与受试个体的一种或多种免疫功能相关，ATP酶活性或二聚体数量的变化表明状况的变化。本发明的方法提供监测免疫系统健康的一般状况、免疫系统非抗原特异性的方面和/或监测受试个体免疫应答性的便利方式。
在另一个实施方案中，本发明提供用于确定受试个体中癌症或传染性疾病的预后的方法，包括使获得自受试个体的热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的ATP酶活性或热休克蛋白热休克蛋白-肽复合物寡聚体的存在与热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的生物活性相关，其中该生物活性与应答或靶向癌症细胞或引起传染性疾病的因子的一种或多种免疫功能相关。这种免疫功能与抗原呈递、对抗原应答的扩大以及在特异性和非特异性方面的效应细胞的功能相关。因此，ATP酶活性或二聚体数量的变化表明预后的变化。
在本发明的另一实施方案中，癌症或传染性疾病的预后可以通过测量分离自受试个体的癌细胞或受感染细胞的hsp和/或hsp-肽复合物的ATP酶活性和/或多聚体结构而建立。由这种细胞产生的hsp或hsp-肽复合物的生物活性反映了癌细胞或受感染细胞的体内免疫原性，并且可用于提供癌症或传染性疾病的预后。
在多种实施方案中，本发明的方法还可用于监测接受例如疫苗、化学疗法、辐射或免疫疗法的治疗后的受试个体的免疫状况。
5.7调节HSPs和Hsp-肽复合物的生物活性在另一实施方案中，本发明提供调节热休克蛋白和其复合物的生物活性的方法，包括使热休克蛋白和复合物与调节ATP酶活性或该热休克蛋白和复合物的寡聚化的化合物接触。这种化合物可用于调节受试个体的免疫功能并且可如下所述的本发明的方法鉴定。
hsp或hsp-肽复合物的生物活性的调节可用于治疗免疫缺乏病症(例如但不限于免疫抑制药物、化学疗法和放射性照射的用途)，或与过度活化的免疫系统相关的病症(例如但不限于过敏反应、移植排斥反应和自身免疫疾病)。
5.8药物筛选本发明还可用于筛选调节hsp或hsp-肽复合物的生物学活性的治疗剂。在一个实施方案中，可以通过将试剂接触包括hsp或hsp-肽复合物的组合物，并随后确定该组合物中hsp或hsp-肽复合物的ATP酶活性或其二聚化而筛选它。
相对于未接触的组合物，ATP酶活性或二聚体的增加可能鉴定能增加生物学活性的作为治疗剂的测试的化合物。
与未接触的组合物相比，ATP酶或二聚体的降低可能鉴定能降低生物学活性的作为治疗剂的测试的化合物。
治疗剂的实例包括但不限于肽、小分子、肽模拟物、抗体、脂类、碳水化合物、抗生素，包括格尔德霉素类似物(例如，17-联合-氨基格尔德霉素)；和核苷酸类似物(参见Rosser等人，J.Bio.Chem.2000，27522789)。
也可以测试治疗剂看看它们是否增加或减少hsp对于增减hsp生物活性的试剂或环境因素的抗性。这些实施方案包括首先，通过检测ATP酶活性或二聚体来测量组合物中hsp的生物活性，第二，将待筛选的试剂接触包括hsp的组合物并随后再次测量生物活性，以及最终将该组合物与试剂或改变本领域已知的抑制或促进生物活性的环境因素，例如pH或温度接触，以及然后第三次测量生物活性。如此可确定所筛选的试剂是否通过增加或减少已知的hsp生物活性的抑制剂或促进剂的效应而调节hsp的生物活性。
本发明的方法还可用于筛选调节hsp生物活性的方式。可将化合物加入和从含有hsp-肽复合物的组合物中除去，同时测量加入前后的hsp肽复合物或该化合物的生物活性。可从组合物中加入或减去的化合物包括但不限于，离子、酸、碱、盐、金属、气体、液体、固体、酶、蛋白质、脂类、碳水化合物、肽和核苷酸。也可测试化合物以确定它们是否增加或减少hsp对于本领域已知的增加或减少hsp-肽复合物生物活性的试剂或环境因素的抗性。
5.9用于确定生物活性的试剂盒本发明也提供用于实现本发明的方法和/或治疗方式的试剂盒。一个实施方案，例如但不限于，是包括具有已知比活性的hsp或hsp-肽复合物作为阳性对照的容器、ATP的容器和格尔德霉素容器的试剂盒。另一个实施方案，例如但不限于，是包括具有已知比活性的hsp或hsp-肽复合物作为阳性对照的容器和gp96构象特异性抗体的试剂盒。另一个实施方案，例如但不限于，是包括具有已知比活性的hsp或hsp-肽复合物作为阳性对照的容器和分子量截止过滤器的试剂盒。本发明的试剂盒也包括用于确定热休克蛋白或热休克蛋白-肽复合物的ATP酶活性或二聚体数量的指导说明。
5.10重组HSPs的合理设计本发明的方法也可用于筛选增减生物活性的变体hsps。变体可以通过本领域的技术人员使用包括诱变、易错PCR、基因改组的重组DNA技术产生。一旦获得重组的hsp，可使用本发明的方法测量重组的hsp和复合物的生物活性。
5.11针对HSP的构象特异性的抗体在另一实施方案中，本发明提供通过利用构象特异性的多克隆或单克隆抗体，包括但不限于重组抗体，其片段和衍生物检测hsp的寡聚体或hsp或hsp-肽复合物的特异构象的方法。在一个实施方案中，这种抗体只结合具有特定构象的hsp和/或hsp-肽复合物，例如二聚体，而不结合hsp和/或hsp-肽复合物的其他形式。该结合的抗体可以通过本领域已知的技术，例如ELISA定量。在特定的实施方案中，该抗体结合单体和寡聚的(非二聚体)hsp和/或hsp-肽复合物，但不结合二聚体。在另一实施方案中，该抗体结合存在于hsp或hsp-肽复合物单体形式上的表位，其中当hsp或hsp-肽复合物寡聚化或二聚化时所述的表位被掩盖。
构象特异的多克隆和/或单克隆抗体可以通过本领域公知的技术产生。在这些实例中，抗体特异于待测量的hsp或hsp-肽复合物的二聚体。
构象特异的抗体也可用于分离或浓缩显示生物活性的hsp或hsp-肽复合物。可以使用本领域已知的任何方法，例如亲合纯化。这容许组合物制品包括高度有效的hsp或hsp-肽复合物。
可以使用本领域已知的用于在hsps或hsp-肽复合物中检测构象变化的任何方法，包括例如但不限于内在的荧光、圆二色性、量热法或确定与蛋白质构象不一致的配体结合的测定方法。
5.12抗原性分子下列小节提供对作为本发明的hsp-肽复合物的抗原/免疫原性成分有用的肽的综述，以及如何鉴定这种肽，例如用于在体外复合hsps和抗原性分子的肽的重组表达。然而，在本发明的实施中，不必已知hsp/肽-复合物的抗原性分子的同一性，例如当该hsp/肽复合物可作为复合物群直接从癌性细胞或受病原体感染的组织纯化时。
在一个实施方案中，抗原性肽可源自癌细胞或受导致传染性疾病的病原体或传染物感染的细胞。病原体或传染物的实例包括但不限于，病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫等。优选地，病原体是感染人的病原体。抗原性的肽可以通过获得自癌细胞、受感染细胞或与癌细胞、受感染细胞或包括病毒颗粒的病原体共用抗原决定簇或显示相似抗原性的抗原性细胞的蛋白质(例如，胞质和/或膜-衍生蛋白)的蛋白水解消化产生。抗原性的肽也可以通过将蛋白质暴露于ATP、盐酸胍和/或酸而产生。抗原性的肽也可从显示导致传染性疾病因子(病原体)或这种因子变体的抗原性的抗原性细胞产生。
既然完整的癌细胞、受感染细胞或其他的抗原性细胞可用于本方法，就不必在使用本方法之前分离或表征或甚至了解抗原性肽的同一性。可以根据与抗原相关的疾病的特性来选择抗原性细胞的来源。在本发明的一个实施方案中，任何组织或分离自癌症的细胞，包括分离自已经转移到多重位点的癌症的细胞可用作本方法中的抗原性细胞。例如，也可使用在血液、淋巴或其他体液中循环的白血病细胞，还可使用实体瘤组织(例如，来自活体检查的初生组织)。癌症的非限制性的目录，其中在此可使用的细胞提供于下列的第5.18节。
在本发明的另一个实施方案中，受病原体或传染物感染的任何细胞，即受感染的细胞，可以用作制备抗原性肽的抗原性细胞。特别地，受胞内病原体，例如病毒、细菌、真菌、寄生虫、或原生动物感染的细胞是优选的。在此可以使用的能感染细胞的传染物的示范性目录提供于第5.18节中。
在另一实施方案中，可导致传染性疾病的任何病原体或传染物可用作制备抗原性肽的抗原性细胞。病原体或传染物的变体，例如但限于复制有缺陷的变体、非病原的或减弱的变体、非传染性的变体，也可用作这个目的的抗原性细胞。例如，许多可体外培养或分离自感染物质的病毒、细菌、真菌、寄生虫和原生动物可以作为抗原性细胞的来源。可以使用本领域已知的用于繁殖这些病原体，包括病毒颗粒的方法。可用作抗原性细胞的病原体或传染物的示范性目录提供于第5.18节中。
来源于癌症组织、癌细胞或受感染细胞的细胞系也可用作抗原性的细胞。癌症或受感染的组织、细胞或起源于人的细胞系是优选的。癌细胞、受感染细胞或抗原性细胞可以通过本领域已知的任何方法鉴定和分离。例如，癌细胞或受感染细胞可以通过形态学、酶活测定、增殖测定或病原体或导致癌症的病毒的存在而被鉴定。如果令人感兴趣的抗原的特征是已知的，抗原性细胞也可以通过本领域已知的任何生物化学或免疫的方法被鉴定或分离。例如，癌细胞或受感染的细胞可以通过外科手术、内窥镜检查、其他活体检查技术、来自体液(例如血液)、亲和色谱法和荧光活化细胞分类法(例如，具有针对细胞表达的抗原的荧光标记抗体)而分离。显示相似抗原性的抗原性细胞具有一种或多种共同针对受试个体中所需的免疫应答的抗原决定簇(例如，用于治疗或预防的目的)。
优选地，当用于治疗或预防癌症时，使用已知的肿瘤特异性(即，在肿瘤细胞中表达的)或与肿瘤相关的抗原(即，在肿瘤细胞中过表达的)或其片段或衍生物。例如，这种肿瘤特异的或与肿瘤相关的抗原包括但不限于KS1/4泛-癌抗原((Perez和Walker，1990，J.Immunol.1423662-3667；Bumal，1988，Hybridoma 7(4)407-415)；卵巢癌抗原(CA125)(Yu等人，1991，Cancer Res.51(2)468-475)；前列腺的过磷酸盐(Tailer等人，1990，Nucl.Acids Res.18(16)4928)；前列腺特异的抗原(Henttu和Vihko，1989，Biochem.Biophys.Res.Comm.160(2)903-910；Israeli等人，1993，Cancer Res.53227-230)；与黑素瘤相关的抗原p97(Estin等人，1989，J.Natl.CancerInst.81(6)445-446)；黑色素瘤抗原gp75(Vijayasardahl等人，1990，J.Exp.Med.171(4)1375-1380)；高分子量的黑色素瘤抗原(Natali等人，1987，Cancer 5955-63)和前列腺特异性膜抗原。其他的可结合hsps的外源性抗原包括在癌细胞中高频率突变的部分或蛋白质，例如致癌基因(例如ras，特别是只发生在4个氨基酸残基(12、13、59或61)上的活化突变的ras突变体(Gedde-Dahl等人，1994，Eur.J.Immunol.24(2)410-414))和肿瘤抑制基因(例如p53，因为已经确定多种突变体的或多形态的p53肽抗原能够刺激细胞毒素的T细胞应答(Gnjatic等人，1995，Eur.J.Immunol.25(6)1638-1642)。
优选地，当用于治疗或预防病毒性疾病时，包括已知病毒的表位的合适的蛋白质和肽可在合适的细胞中表达。例如，这种抗原性表位来自病毒，该病毒包括但不限于甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流行性感冒、水痘、腺病毒、单纯性疱疹类型I(HSV-I)、单纯性疱疹类型II(HSV-II)、牛瘟、鼻病毒、艾可病毒，轮状病毒、呼吸道合胞病毒、乳头状瘤病毒、乳多空病毒、巨细胞病毒、棘病毒、虫媒病毒、huntavirus、柯萨其病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、天花病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒、人类免疫缺陷性病毒类型I(HIV-I)和人类免疫缺陷性病毒类型II(HIV-II)。
优选地，当用于治疗或预防细菌感染时，包括已知细菌的表位的合适的蛋白质和肽可在合适的细胞中表达。例如，这种细菌表位可来源于多种细菌，该细菌包括但不限于，革兰氏阳性芽胞杆菌(例如，李斯特菌、芽胞杆菌，例如炭疽杆菌、丹毒丝菌属种)、革兰氏阴性芽胞杆菌(例如，巴尔通氏体、布鲁氏杆菌、弯曲杆菌、肠杆菌、埃希氏杆菌、弗朗西斯氏菌、嗜血杆菌、克雷伯氏杆菌、摩根氏菌、变形杆菌、普罗威登斯菌、假单胞菌、沙门氏杆菌、沙雷氏菌、志贺氏杆菌、弧菌和耶尔森氏菌属种)、螺旋体细菌(例如，疏螺旋体属种，包括导致Lyme疾病的布氏疏螺旋体和钩端螺旋体)、厌氧菌(例如，放线菌和梭状芽胞杆菌属种，包括破伤风梭菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌)、革兰氏阳性和阴性的球状细菌、链球菌属种、肺炎球菌属种、葡萄球菌属种(例如，金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌)、奈瑟氏球菌属种(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌)。
优选地，当用于治疗或预防真菌感染时，包括已知真菌的表位的合适的蛋白质和肽可在合适的细胞中表达。例如，这种抗原性表位可来源于多种真菌，包括曲霉(例如，Aspergillus fumigatus)、隐球酵母(例如，新型隐球菌)、Sporotrix、球孢子菌、副球霉菌、组织胞浆菌、芽生菌、念珠菌(例如，白色念珠菌)、酒曲菌、Rhizomucor、犁头霉和蛙粪霉属种。
优选地，当用于治疗或预防寄生虫感染时，包括已知的原生动物、线虫或蠕虫感染表位的合适的蛋白质和肽可在合适的细胞中表达。例如，这种抗原性表位可来源于多种原生动物，包括但不限于Entoamoeba、变形体、利什曼虫、艾美虫、隐孢子虫、贾第鞭毛虫、弓形虫和锥虫属种。
5.12.1抗原性蛋白质的制备在本发明的一个实施方案中，提供源自癌细胞、受感染细胞或病原体的蛋白质制品。例如，为了治疗癌症，该蛋白质制品是手术后从获得自癌症患者的肿瘤细胞制备的。在本发明的另一个实施方案中，令人感兴趣的一种或多种抗原性蛋白质在通过导入编码这种抗原的重组表达系统而改变的细胞系中合成，并且使用这种细胞制备蛋白质。蛋白质可获得自一种或多种细胞级分，例如，抗原性细胞的胞液，或它们可从抗原性细胞的膜或细胞壁中提取或溶解出来。本领域已知的任何用于细胞溶解、细胞内容物的分级分离和蛋白质的富集或分离技术都能被使用。参见，例如，Current Protocols in Immunology，vol.2，chapter 8 Coligan等人(编辑)，John Wiley和Sons，Inc.；Pathogenicand Clinical MicrobiologyA Laboratory Manual，Rowland等人，LittleBrown和Co.，1994年6月；其在此全部引入作为参考。根据所使用的分离细胞内容物的技术，细胞级分包括至少20，50、100，500、1,000、5,000、10,000或20,000种不同的蛋白质。
如在此所使用的，术语″蛋白质制品″是指从抗原性细胞，抗原性细胞的细胞级分或病毒颗粒获得的蛋白质混合物。蛋白质可获得自例如细胞质的细胞级分。蛋白质也可以是非细胞质的蛋白质(例如，来自细胞壁、细胞膜或细胞器的蛋白质)或两者皆是。细胞级分可以包括但不限于，胞质级分、膜级分和细胞器级分，例如核、线粒体、溶酶体和内质网衍生的级分。蛋白质制品可从非重组或重组的细胞获得。
在特定的实施方案中，蛋白质制品没有经受任何从抗原性细胞的其它蛋白质中选择性地除去或保留一种或多种特定蛋白质的制备方法。
在特定的实施方案中，蛋白质制品是未分离和/或纯化的总的细胞裂解物，并且可能包含细胞的其他非蛋白质物质。
在另一个特定的实施方案中，蛋白质制品是细胞级分中未经受进一步的分级分离或纯化的总的蛋白质，并且可能包含细胞的其他非蛋白质物质。
另一实施方案中，蛋白质制品是病毒颗粒制品中总的蛋白质。
在特定的实施方案中，蛋白质制品包括抗原性细胞的总的细胞蛋白质、总的胞质蛋白质，或总的膜结合的蛋白质。
在多种实施方案中，蛋白质制品包括至少20，50、100，500、1,000、5,000、10,000或20,000种不同的蛋白质。大量不同的抗原性蛋白质存在于抗原性细胞的蛋白质制品中。此外，蛋白质制品中的蛋白质可能在体外结合hsps前经受蛋白酶消化的步骤。备选地，蛋白质制品中的蛋白质可能在体外结合hsps前不经受蛋白酶消化的步骤。
为了制备抗原性细胞或病毒颗粒的蛋白质制品，抗原性细胞的裂解或细胞壁、细胞膜或病毒颗粒结构的破坏可以使用本领域已知的标准方法进行。在多种实施方案中，抗原性细胞可以例如通过机械剪切、超声处理、冻融、调节细胞周围介质的渗透性或这些技术的组合而裂解。在其他的实施方案中，抗原性细胞可以通过例如去污剂的化学品裂解。
一旦细胞裂解，可将细胞碎屑、非蛋白质的物质或不包含胞质和/或从膜得到的蛋白质的物质(包括细胞器膜中的蛋白质)除去。这些成分的除去可以通过例如低速离心或过滤的技术完成。除去细胞碎屑和完整的细胞后，可以使用高速离心的步骤分离上清液中的胞质蛋白质和沉淀颗粒中收集的膜衍生的蛋白质。本领域通常已知的标准方法容许进一步从沉淀颗粒中分离膜衍生的蛋白质。可以使用本领域通常已知的标准技术从病毒颗粒提取病毒蛋白质。这些分离方法根据存在于抗原性细胞、细胞液或膜中分子普遍的和总的大小、密度和/或电荷而起作用。这些分离方法不是用来从其他蛋白质中选择性地除去或保留任何一种或多种特定的蛋白质。
在多种实施方案中，来自抗原性细胞的蛋白质可任意地通过其普遍的生物化学和/或生物物理学特性，例如大小、密度、电荷、细胞定位或其组合而分离。可使用本领域已知的许多技术进行该分离。
示范性地但不限于，可用于制备包含胞质蛋白质的蛋白质制品的方法提供如下将来源于患者活体检查的可能为肿瘤细胞的细胞或体外培养的肿瘤细胞，或受到病原体感染的细胞，悬浮在包含30mM碳酸氢钠，pH7.5，1mM PMSF的3体积1×裂解缓冲液中，在冰上孵育20分钟，并随后将低渗溶胀的细胞在dounce匀浆器中均质化直到＞95％细胞裂解。作为剪切作用的替代，可在冰上超声处理细胞直到通过显微镜检查确定＞99％的细胞裂解。当使用超声处理时，在超声处理前将细胞悬浮在例如可包含1mM PMSF的磷酸盐缓冲盐水(PBS)的缓冲液中。
然后将该裂解物在1,000×g离心10分钟以除去完整的细胞、细胞核和其他细胞碎屑。将所得到的上清液在大约100,000×g再次离心大约1小时，并回收上清液。可以将100,000×g的上清液相对于PBS或其他合适的缓冲液于4℃透析36小时(3次，每次100倍体积)，以提供本发明的可溶解的胞质蛋白质。如有必要，制品中的不溶性物质可以通过过滤或低速离心除去。
如下示范性地提供但不限于，可用于制备包含膜-衍生的蛋白质的蛋白质制品的方法将来源于患者活体检查的可能为肿瘤细胞的细胞或体外培养的肿瘤细胞或受到病原体感染的细胞悬浮在包含30mM碳酸氢钠，pH 7.5，1mM PMSF的3体积1×裂解缓冲液中，在冰上孵育20分钟，并随后将低渗溶胀的细胞在dounce匀浆器中均质化直到＞95％细胞裂解。作为剪切作用的替代，可在冰上超声处理细胞直到通过显微镜检确定＞99％的细胞裂解。当使用超声处理时，在超声处理前将细胞悬浮在例如可包含1mM PMSF的磷酸盐缓冲盐水(PBS)的缓冲液中。
然后将裂解物在100,000×g离心10分钟以收集细胞膜。膜衍生的蛋白质可从脂双分子层取出并且通过将沉淀颗粒再悬浮于含有1％脱氧胆酸钠(无Ca2+和Mg2+)的5体积PBS中并且在冰上孵育1h而从100,000g的沉淀颗粒(膜衍生的蛋白质位于其中)中分离出来。将所得到的悬浮液于20,000g离心30分钟，以及收获所得到的上清液并相对于几种PBS的代替物(也无Mg2+和Ca2+)透析以除去去污剂。将所得到的透析液在100,000g离心90分钟并进一步纯化上清液。然后将钙和镁都加入上清液达到2mM的终浓度。如有必要，可以通过过滤或低速离心将制品中的不溶性物质除去。
在具体的实施方案中，从抗原性细胞获得的胞质和/或膜衍生的蛋白质群可不经蛋白酶处理或更进一步的提取或选择过程而直接结合hsp。备选地，蛋白质可在结合前受到蛋白酶处理。
5.12.2抗原性肽的制备根据本发明，可任选地消化从抗原性细胞获得的胞质和膜衍生的蛋白质以产生抗原性的肽。在一个实施方案中，胞质或膜衍生的蛋白质分别被用于消化。在另一个实施方案中，胞质蛋白质和膜衍生的蛋白质在消化反应中组合以产生抗原性的肽。在优选的实施方案中，蛋白酶消化中所使用的蛋白质制品没有经受任何从抗原性细胞或抗原性细胞的细胞质或膜的另一种蛋白质中选择性地除去或保留一种或多种特定蛋白质的制备方法。
多种蛋白酶或蛋白水解酶可用于本发明以从抗原性细胞的蛋白质制品生产包含抗原性肽的肽群。酶促消化可个别进行或适当地与任何本领域公知的蛋白水解酶组合进行，这些酶包括但不限于胰蛋白酶、葡萄球菌肽酶I(又名蛋白酶V8)、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、组织蛋白酶G、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶和木瓜蛋白酶。胰蛋白酶是切割赖氨酸和精氨酸的羧基末端侧链的高度特异的丝氨酸蛋白酶。由于切割位点数目的限制，预期留下许多MHC-结合的完整表位。葡萄球菌肽酶I是丝氨酸蛋白酶，具有在谷氨酸和天冬残基后切割的特异性。消化可使用单个蛋白酶或蛋白酶的混合物进行。将所使用的蛋白酶或蛋白水解酶在适合于该特定酶的条件下孵育。优选地，酶是纯化的。非酶催化的方法，例如溴化氰裂解，也可用于产生肽。可将待消化的蛋白质制品等分成各自使用不同酶的多元反应，并且所得到的肽可任选地汇集在一起备用。在酶促反应中可不必完全消化该蛋白质。这些反应导致产生存在于蛋白质制品中的各自蛋白质的互异的和不同组的肽。当抗原性肽结合hsps时，生产不同的肽组提供了产生能够针对蛋白质制品中的抗原诱导免疫应答的抗原性肽的更大的可能性。在优选的实施方案中，将待消化的蛋白质制品等分成2个分离的反应并且使用2种不同的蛋白水解酶产生存在于蛋白质制品中的蛋白质的2组不同的肽。根据蛋白质、酶和反应条件，未消化的蛋白质可在反应中保留。在优选的实施方案中，分别使用胰蛋白酶和葡萄球菌肽酶I以消化蛋白质制品。
在另一个优选的实施方案中，酶促消化在该肽结合hsps前终止。在本发明的一个实施方案中，可以使用抑制剂来终止酶促消化。可以在本发明中使用的酶促抑制剂包括但不限于PMSF、苯丁抑制素、抑氨肽酶肽、亮抑酶肽和半胱氨酸蛋白酶抑制剂，取决于在蛋白质消化中所使用的酶。大部分蛋白酶的抑制剂是本领域中公知的。备选地，另一个终止酶促消化的方法是通过从反应中以物理方式除去酶。这可以通过将所选择的酶结合到例如树脂的固相上，或结合到可以通过公知的方法例如离心或过滤而容易地从反应中除去的物质上来进行。容许蛋白质制品接触或流经固相一段时间。这种固定化的酶可商业上购买或可以通过本领域公知的用于固定化酶的方法生产。
在消化反应的末尾，可任选地在制备中将肽从低分子量的物质，例如二肽或单个的氨基酸残基分离。任选地，可以通过肽的普遍的生物化学和/或生物物理学特性，例如大小、电荷或其组合而分离肽。可以使用本领域已知的任何技术进行分离。
在本发明的另一个实施方案中，内源性性存在于抗原性细胞中的肽可单独或与通过蛋白水解消化胞质和膜衍生的蛋白质而产生的肽结合用于本发明。内源性性存在于抗原性细胞中的肽包括体内结合hsp和/或MHC类型I和II的分子的肽。根据本发明，这种直接分离自抗原性细胞的蛋白质制品的肽可结合hsps。
在一个实施方案中，可在存在ATP或低pH时将抗原性肽从hsp-肽复合物中洗脱下来。可使用这些实验条件从可能潜在包含有效的抗原决定簇的细胞中分离肽。一旦分离，可使用常规的氨基酸测序方法学测定每种抗原性肽的氨基酸序列。然后这种抗原性分子可以通过化学合成或重组方法生产、纯化并体外结合hsps。
示范性地但不限于，将可用于从hsp-肽复合物洗脱肽的方法提供如下将令人感兴趣的hsp-肽复合物通过Centricon 10装置(Millipore)离心以除去任何与复合物松散相关的低分子量物质。可除去大分子量的级分并通过SDS-PAGE分析，同时可如下所述通过HPLC对低分子量的级分进行分析。在一个示范性的方法中，将大分子量级分中的hsp-肽复合物与10mM ATP在室温下孵育30分钟。在另一个示范性的方法中，将乙酸或三氟乙酸(TFA)加入应激蛋白-肽复合物中达到10％的终浓度(vol/vol)，并且将混合物在室温下或在沸水浴中或在任何两者之间的温度下孵育10分钟(参见，Van Bleek等人，1990，自然Nature348213-216；和Li等人，1993，EMBO Journal 123143-3151)。
将所得到的样品如前所述通过Centricon 10装置离心。回收高和低分子量的级分。剩余的大分子量的应激蛋白-肽复合物可与ATP或于低pH中再孵育以除去任何剩余的肽。
汇集所得到的低分子量级分，通过蒸发浓缩并溶于0.1％的TFA。然后通过使用例如用0.1％TFA平衡的VYDAC C18反相柱的反相高压液相色谱法(HPLC)将已溶解的物质分离。然后以大约0.8ml/min的流速通过用0.1％TFA中的0-80％的乙腈线性梯度发展的柱洗脱未结合物质。肽的洗脱可以通过OD210监测并收集含有肽的级分。
在另一个实施方案中，抗原性肽可分离自MHC-肽复合物。从MHC分子分离潜在的免疫原性肽是本领域公知的。参见，例如，Falk等人，1990自然Nature 348248-251；Rotzsche等人，1990自然Nature348252-254 Elliott等人，1990，自然Nature 348191-197；Falk等人，1991，自然Nature 351290-296；Demotz等人，1989，自然Nature 343682-684；Rotzsche等人，1990，科学Science 249283-287，其所公开的内容在此引入作为参考。
在一些实施方案中，MHC-肽复合物可以通过常规的免疫亲和方法分离。然后可以通过将复合物在存在大约0.1％TFA的乙腈中孵育而将该肽从MHC-肽复合物洗脱出来。可分离洗脱的肽并通过反相HPLC纯化。所洗脱的肽的氨基酸序列可以通过本领域公知的手工或自动的氨基酸测序技术而确定。一旦潜在保护的肽的氨基酸序列已经确定，可使用本领域公知的常规的肽合成或其他的方法而大量合成该肽。
与上述分离的肽具有相同的氨基酸序列的肽可使用与由Merrifield，1963，J.Am.Chem.Soc.，852149所描述的相似方法通过固相肽合成法合成。在合成期间，将具有受保护的侧链的N-α-保护的氨基酸逐步加入通过其C-末端连接的延伸的多肽链和不溶的聚合支持物，即聚苯乙烯珠。可以通过连接N-α-去保护的氨基酸和已通过将其与例如二环己基碳二亚胺的试剂反应而活化的N-α-保护的氨基酸的羧基来合成肽。将自由氨基连接到活化的羧基上导致肽键的形成。通常所使用的N-α保护基包括酸不稳定的Boc和碱不稳定的Fmoc。
在一个实施方案中，将C末端的N-α-保护的氨基酸首先附着于聚苯乙烯珠上。然后除去N-α-保护基。去保护的α-氨基与紧邻的N-α-保护的氨基酸的活化的α-羧基偶联。重复该方法直到合成所需要的肽。然后将所得到的肽从不溶的聚合支持物上切割下来并且将氨基酸侧链去保护。更长的肽可以通过缩合受保护的肽片段而得到。详细的合适的化学物质、树脂、保护基、受保护的氨基酸和试剂是本领域公知的(参见，Atherton等人，1989，Solid Phase Peptide SynthesisAPractical Approach，IRL Press，和Bodanszky，1993，PeptideChemistry，A Practical Textbook，第二版，Springer-Verlag)。
所得到的肽的纯化使用常规方法完成，例如使用凝胶渗透、分配的制备性的HPLC和/或离子交换色谱法完成。合适的基质和缓冲液的选择是本领域公知的，因此在此不详细描述。
5.12.3外源的抗原性分子显示病原体或癌症的肿瘤特异性的已知抗原或与肿瘤相关抗原的抗原性的分子，例如其抗原或抗原性的部分，可被选择用作抗原性的分子以用于结合热休克蛋白。本领域已知的几个测定方法可用于测定免疫原性或抗原性，包括但不限于，使用例如放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、″三明治″免疫测定、免疫放射测定法、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、体内免疫测定(例如使用胶态金、酶或放射性同位素标记)、蛋白质印迹、免疫沉淀反应、凝集测定(例如，凝胶凝集测定、血细胞凝集测定)、补体固定测定、免疫荧光测定、蛋白质A测定和免疫电泳测定等技术的竞争性的和非竞争性的测定系统。在一个实施方案中，抗体结合是通过检测第一抗体上的标记而检测的。在另一个实施方案中，第一抗体是通过检测第二抗体或试剂与第一抗体的结合而检测。在进一步的实施方案中，第二抗体是标记的。许多用于检测免疫测定中的结合的方法是本领域中已知的并且预期可被使用。在一个用于检测免疫原性的实施方案中，T细胞介导的应答可以通过标准方法测定，例如通过体外细胞毒性测定或体内延迟型超敏性测定来测定。
用作抗原性分子的潜在有效的抗原或其衍生物也可以通过多种标准鉴定，例如在病原体传染性的中和中抗原的涉及(其中需要治疗或预防这种病原体的感染)(Norrby，1985，Summary，in Vaccines 85，Lerner等人(编辑的)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，第388-389页)、类型或种群的专一性、经患者抗血清或免疫细胞的识别，和/或抗血清或免疫细胞的特异于该抗原的保护效应的证明。此外，当需要治疗或预防由病原体引起的疾病时，抗原的编码表位应优选及时地或在相同病原体的不同分离物之间显示小的或没有抗原变异的程度。
5.13 HSP/抗原性分子复合物的体外生产在不使用hsps和与其在体内的内源性相关的肽的特异复合物的实施方案中，hsps和抗原性分子的复合物是体外生产的。如本领域的技术人员所认识到的，通过上述方法分离或化学合成或重组产生的肽可与多种纯化的天然的或体外重组的应激蛋白重新构成以产生免疫原性的非共价的应激蛋白-抗原性分子的复合物。备选地，外源性的抗原或抗原性的或免疫原性的片段或其衍生物可结合应激蛋白以用于本发明的免疫治疗疫苗或预防疫苗。优选地，用于体外结合应激蛋白和抗原性分子的示范性的方法如下论述。
在结合前，将hsps用ATP或低pH预处理以除去与令人感兴趣的hsp相关的任何肽。当使用ATP方法时，通过加入三磷酸腺苷双磷酸酶，如Levy等人，1991，细胞Cell 67265-274所描述的而将过量的ATP从制品中除去。当使用低pH方法时，通过加入pH改变试剂而将缓冲液再调节到中性的pH。
混合抗原性的分子(1μg)和预处理的hsp(9μg)以达到大约5个抗原性分子1个应激蛋白的摩尔比率。然后，将混合物于4℃-45℃在例如含有20mM磷酸钠，pH 7.2，350mM NaCl，3mM MgCl2和1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)的适当的结合缓冲液中孵育15分钟-3小时。将该制剂通过Centricon 10装置(Millipore)离心以除去任何未结合的肽。肽与应激蛋白的结合物可以通过SDS-PAGE进行测定。这是用于体外结合分离自从内源性的hsp-肽复合物解离的肽的MHC-肽复合物的优选方法。
在本发明的，例如但不限于，并且优选用于生产hsp70和外源抗原性分子例如蛋白质的复合物的备选实施方案中，将5-10微克纯化的hsp与等摩尔量的抗原性分子在100微升体积的20mM磷酸钠缓冲液pH7.5，0.5M NaCl 3mM MgCl2和1mM ADP中于37℃孵育1hr。进一步将该孵育的混合物在磷酸盐缓冲盐水中稀释到1ml。
在本发明的，例如但不限于，并且优选用于生产gp96或hsp90和肽的复合物的备选实施方案中，将5-10微克纯化的gp96或hsp90与等摩尔量的或过量的抗原性肽在例如含有20mM磷酸钠缓冲液pH 7.5，0.5M NaCl，3nM MgCl2的适当缓冲液中于50-65℃孵育5-20分钟。将该孵育的混合物冷却到室温并且如有必要通过Centricon 10装置(Millipore)离心一或多次以除去任何未结合的肽。
结合后，可任选地使用例如如下所述的混合的淋巴细胞靶细胞测定(MLTC)对免疫原性的应激蛋白-抗原性分子复合物进行体外测定。一旦免疫原性的复合物已经被分离，可使用优选的给药方法和如下所述的赋形剂进一步在动物模型中任选地表征它们。
5.14HSPs和抗原性分子的寡聚化本发明的寡聚剂可以是本领域中已知的促进2个或多个hsps或hsps和抗原性分子复合物的寡聚化的任何化合物。所使用的寡聚剂包括通过共价结合来促进寡聚化的分子和通过非共价结合热休克蛋白或hsp-抗原性分子复合物来促进寡聚化的分子。一般地，通过共价结合来促进两个或多个部分之间寡聚化的寡聚剂被称作“交联剂”或“交联制剂”。交联剂是一般可与特定的化学基团发生反应，以容许2个或多个部分结合而产生寡聚物的化合物。
交联剂可以是双官能团的；即它们包含2个可发生反应的基团，可与2个不同的部分或同一部分的2个区域反应或共价连接，或是多官能团的，例如三官能团的。此外，交联剂可以是同功能的(例如，同源双功能的)或异功能的(例如异双功能的)。在同双功能的交联制剂中，反应性基团是相同的并且这些试剂偶联类似的功能基团。在异双功能的交联制剂中，反应基团具有不同的化学特性，容许不同功能的基团之间形成交联。下面论述几种示范性的同双功能和异双功能的交联制剂。
在此所使用的术语“寡聚剂”也包括促进免疫治疗部分，例如通过非共价结合的热休克蛋白的寡聚的试剂。这种寡聚剂的实例，包括但不限于双价(或双特异性)抗体。生物素化和半抗原化试剂以及其同源的结合伴侣被认为是交联试剂或非共价的寡聚剂。这些试剂交联或共价结合有待寡聚的靶物的生物素或半抗原部分。共价修饰的靶物上的生物素或半抗原部分随后非共价地与可附着于其他靶分子上的抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白(生物素)或免疫球蛋白G(IgG)相互作用。抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、结合中性抗生物素蛋白生物素的蛋白和结合捕获抗生物素蛋白生物素的蛋白可紧密地结合至多4个分子的生物素化的靶物而IgG可结合至多2个半抗原。
本发明提供用于偶联第一热休克蛋白分子和第二热休克蛋白分子的化学交联试剂，其中第一和第二热休克蛋白分子可以是，但不必一定是相同的。在一个实施方案中，交联试剂是同双功能交联试剂，并且一般将第一热休克蛋白分子上的胺基或巯基分别偶联至第二热休克蛋白分子上的胺基或巯基上。同双功能的交联试剂包括，例如同双功能的胺交联剂，比如戊二醛、双(亚胺基酯)、双(琥珀酰亚胺酯)、二异氰酸盐(酯)和二酰氯。同双功能交联试剂的实例包括但不限于对叠氮苯基乙二醛一水合物(APG)、1，8-双-马来酰亚胺三亚乙基二醇(BM[PEO]3)、3，3’-二硫代二[硫代琥珀酰亚胺基丙酸酯]；(DTSSP)、双[2-(硫代琥珀酰亚胺氧羰基氧基)乙基]砜(硫代-BSOCOES)、二琥珀酰亚胺基辛二酸盐(DSS)、乙二醇二[硫代琥珀酰亚胺基琥珀酸酯](硫代-EGS)、N，N’-二(3-马来酰亚胺基丙酰基)-2-羟基-1，3-丙二胺、PEG二(对-硝基苯基碳酸酯)和辛二酸二甲基酯二盐酸盐(DMS)。上述及其他同双功能交联剂都可从商业上购买，例如，Sigma(St.Louis，MO)、Pierce生物技术有限公司(Rockford，IL)或Molecular Probes(Eugene，OR)。根据在此所公开的内容，本领域的技术人员将能够选择或设计其他的交联剂用于本发明的应用。
在另一个实施方案中，交联剂是聚乙二醇(“PEG”)，优选具有衍生的偶联或激活部分(例如硫醇、三氟甲磺酸酯、tresylate、aziridune、环氧乙烷或优选马来酰亚胺)。例如马来酰亚胺基一甲氧基PEG的化合物是示范性的活化的PEG化合物。其他的实例包括，一甲氧基聚(乙二醇)-马来酰亚胺(mPEG-MAL)或NHS-聚(乙二醇)-马来酰亚胺(PEG-MAL)。本发明包括使用PEG连接剂交联第一和第二热休克蛋白分子。
在另一实施方案中，交联剂是异双功能交联剂，并且一般使第一热休克蛋白分子上的胺基偶联第二热休克蛋白分子上的巯基或相反进行。异双功能交联剂的实例包括但不限于N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、硫代琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(sSMCC)、2-亚氨基硫代环戊烷(Traut’s试剂)、N-[α-马来酰亚胺基乙酰氧基]琥珀酰亚胺酯(AMAS)、N-β-马来酰亚胺基丙酸(BMPA)、N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼·TFA(BMPH)、1-乙基-3-[3-二甲基胺基丙基]碳化二亚胺盐酸盐(EDC)、[N-e-马来酰亚胺基己酰氧基]琥珀酰亚胺酯(EMCS)、N-[g-马来酰亚胺基丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS)；间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)和N-琥珀酰亚胺碘代乙酸酯(SIA)。上述及其他同双功能交联剂都可商业上购买，例如从Sigma(St.Louis，MO)、Pierce生物技术有限公司(Rockford，IL)或Molecular Probes(Eugene，OR)购买。根据在此所公开的内容，本领域的技术人员将能够选择或设计其他的交联剂用于本发明的应用。
在另一实施方案中，交联制剂是三官能团的。三官有团交联剂的每个分子具有3个不同的反应性或结合基团，并且可寡聚例如热休克蛋白的3个不同的生物分子。三官能团交联剂的实例包括但不限于β-[三(羟甲基)膦基]丙酸(THPP)和三-琥珀酰亚胺基胺基三乙酸(TSAT)。上述及其他同双功能的交联剂都可商业上购买，例如Sigma(St.Louis，MO)、Pierce生物技术有限公司(Rockford，IL)或Molecular Probes(Eugene，OR)。根据在此所公开的内容，本领域的技术人员将能够选择或设计其他的交联剂用于本发明的应用。
本发明的交联剂是指可促进2个或多个热休克蛋白分子之间寡聚的任何化合物。在一个实施方案中，本发明的交联剂是线性的或支链的取代的脂肪族的化合物。在另一实施方案中，本发明的交联剂是环烷基、杂环烷基、取代的环烷基或取代的杂环烷基。在一个实施方案中，交联剂是光活性的。
在一个实施方案中，本发明的寡聚剂是链霉抗生物素蛋白-生物素连接剂。在该实施方案中，生物素可与第一热休克蛋白结合，同时抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白可与第二热休克蛋白结合。生物素对抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白的强亲和力导致生物素-抗生物素蛋白或生物素-链霉抗生物素蛋白的稳定结合，这种结合又可促进与生物素和抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白缀合的热休克蛋白分子的寡聚化。在一些实施方案中，第一和第二热休克蛋白分子是相同的。
在另一实施方案中，寡聚剂是多价的，例如，双价(也称作双特异性)抗体。双特异性抗体非共价地结合第一和第二蛋白质例如热休克蛋白，其中该抗体对于蛋白是特异性的，并以此促进第一和第二蛋白质的寡聚。在一些实施方案中，第一和第二蛋白质是相同的。
根据本发明，所使用的寡聚剂并不破坏例如hsp-肽复合物的热休克蛋白部分的免疫调节活性。在一个实施方案中，寡聚剂不破坏例如肽的抗原性分子与热休克蛋白的结合。在另一实施方案中，寡聚剂不破坏hsp与其受体的结合。在另一实施方案中，寡聚剂在中性pH下是活化并有功能的。
根据上面所公开的内容，其他用于促进热休克蛋白寡聚的寡聚剂对于本领域的技术人员来说是显而易见的。上述所公开的，以及可从例如Sigma(St.Louis，MO；参见Sigma目录，2002-2003，第573-580页)，Pierce生物技术有限公司(Rockford，IL；参见PierceBiotechnology，Inc.目录，2001-2002，第294-334页)或MolecularProbes(Eugene，OR；参见Molecular Probes手册，第9版，2002，第5章)的几个公司商业购买的其他交联剂，每种都在此全部引入作为参考。
在本发明具体的实施方案中，某些化合物不能用作寡聚剂。在一个实施方案中，本发明的寡聚剂不是凝集素。在另一实施方案中，本发明的寡聚剂是凝集素。在另一实施方案中，本发明的寡聚剂不是戊二醛。在另一实施方案中，本发明的寡聚剂不是硫代琥珀酰亚胺基(4-叠氮基水杨酰氨基)己酸酯(“SASD”)。在另一实施方案中，本发明的寡聚剂不能是BAG家族蛋白的成员(参见Takayama和Reed，2001，自然细胞生物学Nature Cell Biology 3E237-E241)。
在另一实施方案中，本发明的寡聚剂不是4，4′-双苯胺基-1，1′-联萘-5，5′-二磺酸(“双-ANS”)、1，8-苯胺基萘磺酸盐(″8-ANS″)或N-乙基羧酰胺基腺苷(″NECA″)。在另一实施方案中，本发明的寡聚剂不是包含腺苷部分或其结构类似物的化合物。腺苷部分的结构类似物包括在腺苷的2’、3’和5’位具有任何种类的取代的分子(参见Gewirth等人，美国专利申请公开No.2002/0160496)。
5.15 HSP-肽复合物免疫原性的测定任选地，本发明的特异复合物和稀释的复合物都可以使用本领域已知的任何方法测定免疫原性。例如但不限于，可使用下列方法中的一种。
5.15.1 MLTC分析简要地，使用任何便利的给药途径将一定量特异的或稀释的hsp-肽复合物注射小鼠。作为阴性对照，用，例如用作非特异的或稀释的复合物的hsp-肽复合物给其他小鼠注射。已知含有特定抗原的细胞，例如肿瘤细胞或受传染性疾病的因子感染的细胞，可以作为该分析的阳性对照。在7-10天内给小鼠分开注射两次。在最后免疫的十天后取出脾脏并释放淋巴细胞。释放的淋巴细胞可随后在体外通过加入表达令人感兴趣的抗原的死细胞而受到再刺激。
例如，8×106的免疫脾细胞可用4×104的丝裂霉素C处理而刺激或在含10％胎牛血清的3ml的RPMI培养基中，γ-照射(5-10,000rads)含有令人感兴趣的抗原(或转染合适基因的细胞，根据具体情况而定)的细胞而刺激。在某些情况下，可以将33％次级混合的淋巴细胞培养上清液包括在培养基中，以作为T-细胞生长因子的来源(参见Glasebrook等人，1980，J.Exp.Med.151876)。为了检测免疫后初级细胞毒素的T-细胞应答，可将脾细胞无刺激培养。在一些实验中，也可用抗原性明确的细胞再刺激免疫小鼠的脾细胞，以测定细胞毒素的T-细胞应答的特异性。
六天后在4小时的51Cr-释放测定中(参见Palladino等人，1987，Cancer Res.475074-5079和Blachere等人，1993，免疫治疗杂志J.Immunotherapy 14352-356)检测培养物的细胞毒性。在测定中，将混合的淋巴细胞培养物加入靶细胞悬液以达到不同的效应子靶(E∶T)比率(通常为1∶1-40∶1)。通过将1×106的靶细胞在含有20mCi51Cr/ml的培养基中于37℃培养1小时而预标记靶细胞。标记后将细胞洗涤三次。每个测试点(E∶T)比率重复进行三次，并且引入合适的对照以测量自发的51Cr释放(未在测定中加入淋巴细胞)和100％的释放(用洗涤剂裂解细胞)。培养细胞混合物4小时后，以200g离心细胞5分钟而沉淀。释放到上清液中的51Cr的量由γ计数器测量。细胞毒性百分数是将测试样品中的cpm减去自发释放的cpm，除以总的洗涤剂释放的cpm减去自发释放的cpm而测量的。
为了阻断MHC I类级联反应，将来源于K-44杂交瘤细胞(抗-MHCI类杂交瘤)的浓缩的杂交瘤上清液加入测试样品中至终浓度为12.5％。
5.15.2 CD4+T-细胞增殖测定初级T-细胞来源于脾、新鲜的血液或CSF，并使用FICOLL-PAQUE PLUS(Pharmacia，Upsalla，Sweden)离心纯化，其基本的描述在Kruse和Sebald，1992，EMBO J.113237-3244中。将外周血单核细胞与表达抗原性分子的细胞裂解物一起培养7-10天。可任选地，在测定前24-48小时将抗原呈递细胞加入培养物，以保证在裂解物中含有并提供抗原。然后离心收获细胞，并在RPMI 1640培养基(GibcoBRL，Gaithersburg，Md.)中洗涤。将5×104的活化的T-细胞/孔(PHA-胚细胞)在含有10％胎牛血清，10mM HEPES，pH 7.5，2mM L-谷氨酸，100单位/ml青霉素G和100μg/ml链霉素硫酸盐的RPMI 1640培养基中在96孔板上于37℃培养72小时，用1μCi3H-胸苷(DuPont NEN，Boston，Mass.)/孔脉冲6小时，收获，并在TOPCOUNT闪烁计数器(Packard Instrument Co.，Meriden，Conn.)中测定放射性。
5.15.3抗体应答分析在本发明的某个实施方案中，通过测定对接种复合物的应答中产生的抗体而确定hsp-肽复合物的免疫原性。在实施方案的一个模式中，将微量滴定板(96-孔免疫平板II，Nunc)用50μl/孔在疫苗(例如Aβ42)中所使用的0.75μg/ml纯化的非-hsp-复合物形式的肽，在PBS中于4℃铺被16小时以及在20℃铺被1小时。将孔排空并且每孔用200μl的PBS-T-BSA(含有0.05％(v/v)TWEEN 20和1％(w/v)牛血清白蛋白的PBS)在20℃封闭1小时，然后用PBS-T洗涤三次。加入50μl/孔的血浆或来源于接种动物的CSF(例如模型小鼠或患者)在20℃施用1小时，并且将平板用PBS-T洗涤三次。然后在与50μl/孔的羊抗鼠或抗人免疫球蛋白于20℃孵育1小时后，量热测定抗肽的抗体活性，视情况而定，与在PBS-T-BSA中稀释为1∶1,500的辣根过氧化酶(Amersham)和(如上用PBS-T进一步洗涤三次后)50μl的邻苯二胺(OPD)-H2O2底物溶液连接。5分钟后加入150μl的2M H2SO4中止反应，并在Kontron SLT-210光度计(SLT Lab-instr.，Zurich，瑞士)中于492nm测定光吸收值(参照为620nm)。
5.15.4细胞因子检测分析针对本发明的hsp-肽复合物的CD4+T细胞增殖应答可以通过检测和定量特定细胞因子的水平来测定。在一个实施方案中，例如，可使用IFN-γ检测分析来测定胞内细胞因子以检验本发明复合物的免疫原性。在这种方法的实例中，将来自用hsp-肽复合物治疗的受试个体的外周血单核细胞用给定肿瘤的肽抗原或传染性疾病因子的肽抗原刺激。然后使用通过流式细胞仪检测的T-细胞特异性标记的抗体将细胞染色，例如结合FITC的抗CD8和PerCP-标记的抗CD4抗体。洗涤后，将细胞固定，渗透化并和与人IFN-γ(PE-抗-IFN-γ)反应的染料标记的抗体反应。使用标准技术经流式细胞仪分析样品。
备选地，过滤免疫分析、酶联免疫点分析(ELISPOT)测试都可用于检测T-细胞周围的特定细胞因子。在一个实施方案中，例如，将硝酸纤维素支持的微量滴定板用纯化的细胞因子特异性初级抗体，即抗-IFN-γ铺被，并且封闭平板以避免由于非特异性结合其他蛋白质而产生的背景。将含有从用hsp-肽复合物治疗的受试个体得到的分泌细胞因子的细胞的单核血细胞样品稀释到微量滴定板上。加入标记的，例如生物素标记的、次级抗细胞因子抗体。然后可以检测抗体细胞因子复合物。与酶结合的链霉抗生物素蛋白-细胞因子-分泌细胞可以通过可见的、显微镜的或电子检测方法而显示出“点”。
5.15.5四聚体分析在另一实施方案中，可使用“四聚体染色法”分析(Altman等人，1996，Science 27494-96)来鉴定抗原特异性的T-细胞。例如，在一个实施方案中，包含特异的肽抗原，例如肿瘤特异性抗原的MHC分子可多聚化形成可溶性的肽四聚体，并且例如通过与链霉抗生物素蛋白结合而标记。然后MHC-肽抗原复合物与获得自用hsp-肽复合物治疗的受试个体的T-细胞群混合。可以使用生物素染色表达令人感兴趣的抗原，即肿瘤特异性抗原的T-细胞。
5.16与过继性免疫疗法的结合过继性免疫治疗是指治疗癌症或传染性疾病的治疗方法，其中将免疫细胞施用于宿主，以便细胞根据具体情况，直接或间接介导对肿瘤细胞和/或抗原成分的特异免疫或肿瘤抑制或传染病治疗。(参见1999年11月16日公开的美国专利号5,985,270，其在此全部引入作为参考)。作为任选的步骤，根据在此所描述的方法，将APC用与抗原性(或免疫原性)分子复合的hsp敏化并用于过继性免疫治疗。
在具体的实施方案中，使用任何给药途径，通过施用稀释的复合物的治疗可任选地与使用hsp-抗原性分子复合物敏化的APC的过继性免疫疗法结合。Hsp-肽复合物-敏化的APC可以单独给药，也可以与稀释的hsp-肽复合物结合给药，或在稀释的hsp-肽复合物给药前或后给药。此外，给药的方式可以变化，包括但不限于，例如皮下、静脉内或肌肉内给药，尽管皮内或粘膜给药是优选的。
5.16.1获得巨噬细胞和抗原呈递细胞抗原呈递细胞，包括但不限于巨噬细胞、树突细胞和B-细胞，如Inaba，K.等人，1992，J.Exp.Med.，1761693-1702所描述的，优选通过在体外从人外周血细胞或骨髓的干细胞和祖细胞产生而获得。
APC可以通过本领域已知的多种方法获得。在优选的方面，使用从人血细胞中获得的人巨噬细胞。例如但不限于，巨噬细胞可如下获得将单核细胞通过Ficoll-Hypaque梯度离心从患者(优选为待治疗的患者)的外周血分离，并接种到用患者自身的血清或其他AB+人血清预先铺被的组织培养皿中。在37℃培养细胞1小时，然后吸去未粘附的细胞。对于留在培养皿中的粘附细胞，加入冷的(4℃)含1mM EDTA的磷酸盐缓冲液，并在室温放置15分钟。收获细胞，用RPMI缓冲液洗涤，并悬浮在RPMI缓冲液中。如Inaba，K.等人，1992，J.Exp.Med.，1761693-1702中所描述的细节，可以通过在37℃与巨噬细胞-集落刺激因子(M-CSF)一起培养而获得数目增加的巨噬细胞；通过与粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)一起培养而获得数目增加的树突细胞。
5.16.2用hsp-肽复合物敏化巨噬细胞和APCs可以用结合抗原性分子的hsp，优选通过将细胞与复合物在体外培养而敏化APCs。将APC用hsp和抗原性分子的复合物，通过在体外与hsp-复合物于37℃培养15分钟至24小时而敏化。例如但不限于，4×107的巨噬细胞可在1ml的简单RPMI培养基中，与每毫升10微克的gp96-肽复合物或每毫升100微克的hsp90-肽复合物在37℃培养15分钟至24小时。将细胞洗涤三次，并重悬在优选为无菌的生理培养基中，达到便于给患者注射的浓度(例如1×107/ml)。优选地，被注射敏化的APCs的患者就是最初从中分离APC的患者(自体同源的实施方案)。
任选地，敏化的APCs刺激例如，抗原特异性的、I型限制性的细胞毒素T-淋巴细胞(CTL)的能力可以通过它们刺激CTLs释放肿瘤坏死因子的能力，以及它们作为这种CTLs的靶物的能力来进行监测。
5.16.3敏化的APC的再注入将hsp-抗原性分子-敏化的APCs通过常规的临床方法，优选为静脉方式再次注入患者体内。再次注入这些活化的细胞，优选通过全身给药进入自体同源的患者体内。根据患者的病况，患者通常接受大约106到大约1012的敏化的巨噬细胞。在一些疗法中，患者可任选地接受附加的合适剂量的生物应答调节剂，包括但不限于细胞因子IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、TNF或其他细胞生长因子。
5.17被动免疫治疗本发明的组合物也可用于被动免疫治疗癌症和传染病。被动免疫是对宿主的短期保护，通过施用针对异源生物体的预先形成的抗体而实现。例如，包括从受到传染性生物体感染的细胞获得的稀释的hsp-肽复合物的本发明的组合物，可用于激发受试个体的免疫应答，从受试个体中分离血清，并用于治疗或预防在另一受试个体中由传染性生物体导致的疾病。
5.18疾病的预防和治疗根据本发明，将本发明的组合物，包括例如来源于抗原细胞的消化的胞质和/或膜-衍生的蛋白质或病毒颗粒的肽的抗原性肽和hsp的复合物，施用于患有癌症或传染病的受试个体。在一个实施方案中，“治疗”或“处理”是指癌症或传染病或至少其中一种的可识别症状的改善。在另一实施方案中，“治疗”或“处理”是指改善至少一种与癌症或传染病相关的可测量的物理参数，而不必让受试个体觉察到。在另一实施方案中，“治疗”或“处理”是指抑制癌症或传染病的进展，或是身体上的，例如，可识别症状的稳定，或是生理上的，例如，物理参数的稳定，或两者皆是。
在某些实施方案中，将本发明的组合物施用于受试个体，作为预防癌症或传染病的措施。如在此所使用的，“预防”或“防止”是指减少患已知癌症或传染病的风险。在实施方案的一个模式中，本发明的组合物作为预防措施而施用于遗传性的易患癌症的个体。在实施方案的另一模式中，本发明的组合物作为预防措施而施用于暴露于致癌物质的个体，其中致癌物质包括但不限于化学试剂、放射线、香烟烟雾或其组合，或施用于暴露于传染疾病因子的个体。在特定的实施方案中，本发明的组合物作为预防措施而施用于周围环境暴露在致癌物质，例如香烟烟雾中的个体。
例如，在某些实施方案中，本发明组合物的给药，相对于缺乏所述的组合物时的生长，导致将癌细胞的生长或传染因子抑制或减缓了至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％或至少10％。
根据本发明的方法制备的组合物包括热休克蛋白和抗原肽群的复合物。该组合物显示在肿瘤位点诱导炎症反应并最终可以导致所治疗的癌症患者中肿瘤负荷的消退。根据本发明的方法制备的组合物可以增强受试个体的免疫竞争性并激发针对传染因子的特异性免疫或针对前肿瘤细胞和肿瘤细胞的特异性免疫。这些组合物能够阻止传染病的发作和进展，并抑制肿瘤细胞的生长和扩展。
结合治疗是指使用其他形式的hsp-肽复合物或本发明的组合物来预防或治疗癌症和传染病。本发明组合物的给药可以增加抗癌试剂或抗传染的效果，并且反之亦然。优选地，该另外的形式不是基于hsp的形式，即这种形式不包括热休克蛋白作为成分。这种方法通常被称为联合治疗、附加治疗或结合治疗(在此该术语可相互交换)。通过联合治疗，可观察到加性效力或加性治疗效果。也可预料到协同作用中治疗效果大于加性作用。使用联合治疗也可提供比单独施用治疗形式或hsp-肽复合物更好的治疗方案。加性或协同效果可容许调节单一的或两种形式的剂量和/或剂量频率以减少或避免不想要的或不利的效应。
在各种特定的实施方案中，联合治疗包括将hsp-肽复合物施用于已经用治疗形式治疗过的受试个体，其中单独给药的该治疗形式在临床上不足以治疗该个体，以致于其需要另外有效的治疗，例如，该受试个体对无hsp-肽复合物给药的治疗形式不产生应答。在这样的实施方案中包括的方法，包括将hsp-肽复合物施用于接受治疗形式的受试个体，其中所述个体对治疗有应答，但是遭受副作用、复发、形成抗性等。这样的受试个体可能对单独使用治疗形式不应答或难以控制治疗，即至少癌细胞的某些重要部分或病原体并没有被杀死或它们的细胞分裂没有受到抑制。当根据本发明的方法所预期的方式给药时，本实施方案提供的包括将hsp-肽复合物施用于单独使用治疗形式时难以医治的受试个体的本发明的方法，可以提高治疗形式的治疗效果。治疗形式的效果的确定可以使用本领域已知的方法在体内或体外测定。本领域所接受的难以医治的意义在癌症的上下关系中是众所周知的。在一个实施方案中，癌症或传染病是难以医治的或非应答性的，其分别指癌症细胞或病原体的数目没有显著的减少或增加。治疗的这些受试个体是接受化疗或放疗的。
根据本发明，本发明的复合物可与许多不同类型的治疗模式一起使用。一些这样的模式对于特定类型的癌症或传染病尤其有效。许多其他的模式对免疫系统的功能有作用，并且通常应用于肿瘤形成和传染病。
在一个实施方案中，本发明的复合物与一种或多种生物应答调节剂联合使用以治疗癌症或传染病。一组生物反应调节剂是细胞因子。在一个这样的实施方案中，将细胞因子施用于接受hsp-肽复合物的受试个体。在另一个这样的实施方案中，将hsp复合物施用于接受与细胞因子联合使用的化疗试剂的受试个体。在各种实施方案中，可使用一种或多种细胞因子并选自IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IFNα、IFNβ、IFNγ、TNFα、TNFβ、G-CSF、GM-CSF、TGF-β、IL-15、IL-18、GM-CSF、INF-γ、INF-α、SLC、内皮单核细胞激活的蛋白-2(EMAP2)、MIP-3α、MIP-3β，或MHC基因，例如HLA-B7。另外，细胞因子的其他实例包括TNF家族的其他成员，包括但不限于与TNF-α-相关的诱导凋亡的配体(TRAIL)、与TNF-α-相关的诱导激活的细胞因子(TRANCE)、与TNF-α-相关的凋亡弱诱导剂(TWEAK)、CD40配体(CD40L)、淋巴毒素α(LT-α)、淋巴毒素β(LT-β)、OX40配体(OX40L)、Fas配体(FasL)、CD27配体(CD27L)、CD30配体(CD30L)、41BB配体(41BBL)、APRIL、LIGHT、TL1、TNFSF16、TNFSF17，和AITR-L，或其功能部分。参见例如，Kwon等人，1999，Curr.Opin.Immunol.11340-345关于TNF家族的综述。优选地，hsp-肽复合物在治疗形式前给药。在特定的实施方案中，本发明的一种或多种复合物施用于接受与IL-12联合用于治疗癌症的环磷酰胺的受试个体。
在另一实施方案中，本发明的复合物与一种或多种生物应答调节剂联合使用，其中的生物应答调节剂是多种配体、受体和免疫系统的信号传导分子的激动剂或拮抗剂。例如，生物应答调节剂包括但不限于Toll类受体(TLR-2、TLR-7、TLR-8和TLR-9；LPS；，41BB配体、OX40配体、ICOS和CD40的激动剂以及Fas配体、PD1和CTLA-4的拮抗剂。这些激动剂和拮抗剂可以是抗体、抗体片段、肽、与肽类似的化合物和多糖。
在另一实施方案中，本发明的复合物与作为免疫刺激核酸的一种或多种生物应答调节剂联合使用。这类核酸，其中许多是包含没有甲基化的CpG基序的寡核苷酸，对于脊椎动物淋巴细胞来说是促有丝分裂的，并且已知增强免疫应答。参见Woolridge等人，1997，Blood 892994-2998。这类寡核苷酸在国际专利
发明者J·R·扎布雷基, C·刘, S·A·蒙克斯, A·瓦塞尔曼, P·K·斯里瓦斯塔瓦 申请人:抗基因公司, 康涅狄格大学健康中心
文档序号 :
【 448464 】
技术研发人员：J.R.扎布雷基,C.刘,S.A.蒙克斯,A.瓦塞尔曼,P.K.斯里瓦斯塔瓦
技术所有人：抗基因公司,康涅狄格大学健康中心
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：J.R.扎布雷基,C.刘,S.A.蒙克斯,A.瓦塞尔曼,P.K.斯里瓦斯塔瓦
技术所有人：抗基因公司,康涅狄格大学健康中心
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除