仔猪大肠埃希氏菌K88ac-K99-ST<sub>1</sub>-LT<sub>B</sub>四价基因工程灭活疫苗生产用菌株及其构建方法...的制作方法
技术领域：
本发明涉及仔猪大肠埃希氏菌黄痢病疫苗技术领域，尤其涉及的是仔猪大肠埃希 氏菌KSSac-Kgg-ST1-LIe四价基因工程灭活疫苗生产用菌株及其构建方法和灭活疫苗生产 方法。
背景技术：
产肠毒素性大肠埃希氏菌(ETEC)的致病力主要依靠产生粘着素和肠毒素两类毒 力因子。经试验证明在ETEC的致病机制上粘着素和肠毒素缺一不可，粘着素是ETEC感染的 首要致病因子，是促进菌细胞在肠道内定居的先决条件，已知来源于猪的ETEC主要有K88、 K99、987P和F41四种，其中以K88ac、K99居多；肠毒素是导致宿主腹泻的直接致病因子，包 括耐热性肠毒素ST1和不耐热肠毒素LT两种。现已证实ST1为18或19个氨基酸的小肽， 100°C加热30分钟仍保持活性，没有免疫原性。目前国内应用的疫苗有K88-K99双价基因工程灭活苗，K88、K99、987P四价全菌 体苗等。洪孟民、陈章水等于1985年前后构建了含Κ88和Κ99抗原基因的大肠埃希氏菌， 将这种双价基因工程菌株用于制备预防仔猪腹泻的疫苗，在妊娠母猪产前21d左右注射该 K88-K99双价基因工程疫苗，母猪分娩后初乳中存在K88、K99高效价抗体，仔猪吮吸初乳 后，能够有效地阻止大肠埃希氏菌的感染。此后，1990年黄培堂等构建了 K88ac-LTB双价基 因工程菌株，也取得了较好的免疫效果，但是他们均没有解决ST的免疫原性这一难题，所 以疫苗效力有限，不能完全预防仔猪大肠埃希氏菌性腹泻。由于ST免疫原性极差，难以制备有效的疫苗进行预防，为了增强ST的免疫原性， 八十年代FRANTZ等将ST偶联到载体蛋白上，加上福氏佐剂免疫动物(母猪和母牛)可以 产生抗体，新生动物对产肠毒素性大肠埃希氏菌的攻击有保护作用。这提示将ST连接载体 蛋白，使ST成为全抗原，可以引起免疫系统对ST的免疫应答。九十年代CLEMENTS(1990) 和⑶ZMEN-GERDUZC0等(1990)人致力于ST1与LTB基因融合研究，他们分别将ST1基因融 合到LTB结构基因的上游或下游，最后得到了一株重组菌株，该重组菌可表达具有ST1和 LTB两种抗原性的融合蛋白，这一成果使该方面的研究提高到一个新的水平；国外AITKEN 等(1993)采用ST1前体(Pre-ST1)构建了 pre-STfLTB融合基因，动物实验观察到了表达 的融合蛋白具有免疫原性，并引起免疫应答，且融合蛋白ST1毒性下降；许崇波等(1994)构 建成了 Pre-ST1-LacZ融合基因，对其表达的融合蛋白进行了免疫原性研究，结果表明，免疫 的小白鼠产生的抗体具有中和天然ST1毒性的能力，这表明LacZ蛋白已赋予了 ST1免疫原 性，而且无ST1毒性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种克服上述缺 点，菌苗抗原成份能达到缓慢释放、能更有效地预防仔猪黄痢的仔猪大肠埃希氏菌KSSac-Kgg-ST1-Lie四价基因工程灭活疫苗生产用菌株及其构建方法和灭活疫苗生产方法。本发明采用以下技术方案一种仔猪大肠埃希氏菌KSSac-Kgg-ST1-Lie四价基因工程灭活疫苗生产用菌株 BL21(DE3) (pXKKSL)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址北京市朝阳区北辰 西1号院3号，中科院微生物研究所，菌种保藏编号CGMCC No. 3491，建议的分类命名大肠 埃希氏菌(Escherichia coli)。一种仔猪大肠埃希氏菌KSSac-Kgg-ST1-Lie四价基因工程灭活疫苗生产用菌 株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤:A1、设计并合成4对PCR引物P1-P8 =Pl (C ATGCCATGGCATTTACTGACTATGAAG)、P2 (CCGGAATTCGGGAGAATATCATTTCTTGA)用于从大肠 埃希氏菌 C83902 质粒中扩增 K88ac 抗原基因；P3 (CCGGAATTCAGATCTTGGGCAGGCTGCT)、 P4(CCGGAATTCATATAAGTGACTAAGAA)用于从大肠埃希氏菌C83539质粒中扩增K99抗原基 因；P5 (CCGGAATTCAGATCTTTCTTCAAAAG)、P6 (ATAGGATCCCTATAGCACCCGGTACAAG)用于从大 肠埃希氏菌 C83902 质粒中扩增 Pre-ST1 抗原基因；P7 (GCGGATCCTCTAGAGTCAATTCGAGCT)、 P8 (ATAGGATCCTCTAGAGTCAATTCGAGCT)用于从大肠埃希氏菌C83902质粒中扩增LTb抗原 基因；所述PCR扩增程序为总体积为50 μ L，其中5 μ LlO倍反应缓冲液，IOng质粒DNA， 200ymol/L dNTPs，引物各 250ng，3U Taq DNA 聚合酶，按 94°C 60s — 50°C 60s — 72°C 90s 的温度转换模式，共进行30个循环；A2、将PCR产物分别进行酶切，将ST1突变基因融合在 LTb抗原基因的上游，然后将K88ac抗原基因融合在ST1-LTb融合基因的上游，再将K99抗 原基因插入在K88ac抗原基因和ST1突变基因的中间，构建了融合基 因；A3、最后将构建的融合基因插入到表达载体pET-28b相应的酶切位 点上，构建了重组质粒PXKKSL，通过氯化钙转化法转入到受体菌BL21 (DE3)中，构建了含 K88ac-K99-STrLTB融合基因表达载体的基因工程菌株BL21 (DE3) (pXKKSL)。一种仔猪大肠埃希氏菌KSSac-Kgg-STfLiB四价基因工程灭活疫苗的生产方法， 其特征是(1)把冻干菌种BL21 (DE3) (pXKKSL)用LB培养基制成一级种子、二级种子和生产 用三级种子；(2)将三级种子按2 5%的量接种于发酵罐中，进行通气培养，通气量3 4V/ MIN，50%灭菌葡萄糖调节PH值，调节范围7. 2 .8，37°C培养18 24H ；(3)收获的菌液添加灭活剂10%甲醛溶液至终浓度0. 4 0. 6%，37°C灭活48h ；(4)按50亿活菌苗/mL比例加入氢氧化铝胶和菌液，并按终浓度0. 01 %添加 1 2%硫柳汞溶液，磨制2分钟，装入大瓶子，沉淀后弃上清或添加生理盐水，然后装入分 装筒，混勻，调PH6. 8 7. 2，制成含20%氢氧化铝胶的佐剂菌苗，菌苗成品含BL21 (DE3) (pXKKSL)菌 50 亿个 /mL。所述的生产工艺，其特征在于，在培养过程中可以添加诱导剂0. lmmol/L异丙 基_硫代-d-半乳糖苷(IPTG)或0. lg/L乳糖。所述的生产工艺，其特征在于，其特征在于，所述LB培养基的配方蒸馏水 lOOOmL，蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化钠5g，用2mol/L氢氧化钠调pH7. 6 7. 8，加入 适量消泡剂，116°C灭菌40分钟，保存备用。采用DNA重组技术，构建了含有1(88肌-1(99-51-1^融合基因的重组表达质粒pXKKSL，并将构建的重组表达质粒转化至受体菌BL21 (DE3)中，动物试验证实，构建的基因 工程菌株表达的KSSac-Kgg-ST1-LIe融合蛋白没有毒性且具有良好的免疫原性。本发明研制的大肠埃希氏菌四价基因工程疫苗，将使得由产肠毒素性大肠埃希氏 菌引起的仔猪黄痢的免疫预防问题得到有效的解决，大幅度地减少养猪业的经济损失，具 有广阔的市场前景。待工业化生产后，该四价基因工程灭活苗每头份成本为0.2元，而市场 价在0. 5 1. 0元左右，因母猪每年产仔猪2次，实际上每年国内市场需要7000万头份，如 果按每年销售3000万头份，每年可实现纯利润1800万元，经济效益巨大。另外，更重要一 点是，该基因工程疫苗属于I类安全生物制品，对环境是十分安全的，不存在任何的环境污 染，不会对环境造成任何破坏，还可减少抗生素使用带来的药物残留问题，保护人类健康， 具有较高的社会效益。
图1为含K88AC-K99-ST1-LTB融合基因的表达载体酶切鉴定图；其中1 :LTb基因双酶切鉴定；2 =STl基因双酶切鉴定；3 :K99基因双酶切鉴定；4 K88AC 基因双酶切鉴定；M :TRANS2K II DNA MARKER(50 00，3000，2000，1000，750，500，250， 100)。
具体实施例方式以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例1一种仔猪大肠埃希氏菌KSSac-Kgg-ST1-LIe四价基因工程灭活疫苗生产用菌株 BL21 (DE3) (pXKKSL)，菌种保藏编号CGMCC No. 3491。本发明的这种新型基因工程灭活苗生产用菌株，采用聚合酶链反应(PCR)和基因 突变技术，从大肠埃希氏菌C83902质粒中扩增出K88ac、Pre-ST1和LTb基因，从大肠埃希氏 菌C83539质粒中扩增出K99基因。采用DNA重组技术和基因融合技术，将这四个基因连接 成KSSac-Kgg-ST1-LIe融合基因并插入pET-28b载体上，然后转化至受体BL21 (DE3)中，构 建了含1(88肌-1(99-51-1^四价保护性抗原基因的基因工程菌株BL21 (DE3) (pXKKSL)(菌种 保藏号CGMCC No. 3491)，该菌株表达的有效抗原成份在菌体内部，能达到缓慢连续释放的 作用，克服了目前市场上使用的大肠埃希氏菌菌苗的缺点。该基因工程菌株经发酵培养后， 用0.4%甲醛灭活，并辅以氢氧化铝胶制成基因工程灭活苗。K88ac-K99-STrLTB融合基因表达质粒pXKKSL的基因结构式
权利要求
一种仔猪大肠埃希氏菌K88ac K99 ST1 LTB四价基因工程灭活疫苗生产用菌株BL21(DE3)(pXKKSL)，菌种保藏编号CGMCC No.3491。
2.一种仔猪大肠埃希氏菌KSSac-Kgg-ST1-LIe四价基因工程灭活疫苗生产用菌 株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤:Al、设计并合成4对PCR引物P1-P8 =Pl (C ATGCCATGGCATTTACTGACTATGAAG)、P2 (CCGGAATTCGGGAGAATATCATTTCTTGA)用于从大肠 埃希氏菌 C83902 质粒中扩增 K88ac 抗原基因；P3 (CCGGAATTCAGATCTTGGGCAGGCTGCT)、 P4 (CCGGAATTCATATAAGTGACTAAGAA)用于从大肠埃希氏菌C83539质粒中扩增K99抗原基 因；P5 (CCGGAATTCAGATCTTTCTTCAAAAG)、P6 (ATAGGATCCCTATAGCACCCGGTACAAG)用于从大 肠埃希氏菌 C83902 质粒中扩增 Pre-ST1 抗原基因；P7 (GCGGATCCTCTAGAGTCAATTCGAGCT)、 P8 (ATAGGATCCTCTAGAGTCAATTCGAGCT)用于从大肠埃希氏菌C83902质粒中扩增LTb抗原基 因；所述PCR扩增程序为总体积为50 μ L，其中5 μ L 10倍反应缓冲液，IOng质粒DNA， 200ymol/L dNTPs，引物各 250ng，3U Taq DNA 聚合酶，按 94°C 60s — 50°C 60s — 72°C 90s 的温度转换模式，共进行30个循环；A2、将PCR产物分别进行酶切，将ST1突变基因融合在LTb抗原基因的上游，然后将 K88ac抗原基因融合在ST1-LTb融合基因的上游，再将K99抗原基因插入在K88ac抗原基因 和ST1突变基因的中间，构建了 KSSac-Kgg-ST1-LIe融合基因；A3、最后将构建的融合基因插入到表达载体pET-28b相应的酶切 位点上，构建了重组质粒PXKKSL，通过氯化钙转化法转入到受体菌BL21 (DE3)中，构建了含 K88ac-K99-STrLTB融合基因表达载体的基因工程菌株BL21 (DE3) (pXKKSL)。
3.一种仔猪大肠埃希氏菌KSSac-Kgg-ST1-Lie四价基因工程灭活疫苗的生产方法，其 特征是(1)把冻干菌种BL21(DE3) (pXKKSL)用LB培养基制成一级种子、二级种子和生产用三 级种子；(2)将三级种子按2 5%的量接种于发酵罐中，进行通气培养，通气量3 4V/MIN， 50%灭菌葡萄糖调节PH值，调节范围7. 2 .8，37°C培养18 24H ；(3)收获的菌液添加灭活剂10%甲醛溶液至终浓度0.4 0. 6%，37°C灭活48H ；(4)按50亿活菌苗/ML比例加入氢氧化铝胶和菌液，并按终浓度0.01%添加1 2% 硫柳汞溶液，磨制2分钟，装入大瓶子，沉淀后弃上清或添加生理盐水，然后装入分装筒，混 勻，调PH6. 8 7. 2，制成含20 %氢氧化铝胶的佐剂菌苗，菌苗成品含BL21 (DE3) (PXKKSL) 菌50亿个/ML。
4.根据权利要求3所述的生产工艺，其特征在于，在培养过程中可以添加诱导剂 0. lmmol/L异丙基-硫代-D-半乳糖苷(IPTG)或0. lg/L乳糖。
5.根据权利要求3所述的生产工艺，其特征在于，其特征在于，所述LB培养基的配方 蒸馏水lOOOmL，蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化钠5g，用2mol/L氢氧化钠调pH7. 6 7. 8， 加入适量消泡剂，116°C灭菌40分钟，保存备用。
全文摘要
本发明公开了种仔猪大肠埃希氏菌K88ac-K99-ST1-LTB四价基因工程灭活疫苗生产用菌株BL21(DE3)(pXKKSL)，菌种保藏编号CGMCC No.3491。还公开了其构建方法和疫苗生产方法。采用DNA重组技术，构建了含有K88ac-K99-ST1-LTB融合基因的重组表达质粒pXKKSL，并将构建的重组表达质粒转化至受体菌BL21(DE3)中，动物试验证实，构建的基因工程菌株表达的K88ac-K99-ST1-LTB融合蛋白没有毒性且具有良好的免疫原性。
文档编号C12N15/62GK101955905SQ20101028278
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月16日 优先权日2010年9月16日
发明者卫广森, 才学鹏, 窦永喜, 许崇波 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所
文档序号 :
【 585920 】
技术研发人员：才学鹏,卫广森,许崇波,窦永喜
技术所有人：中国农业科学院兰州兽医研究所
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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技术研发人员：才学鹏,卫广森,许崇波,窦永喜
技术所有人：中国农业科学院兰州兽医研究所
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