一种含幽门螺杆菌UreB、CagA蛋白的基因疫苗的制备方法
技术领域：
本发明的实施方式涉及生物医学技术领域，具体涉及ー种含幽门螺杆菌UreB、CagA蛋白的基因疫苗的制备方法。
背景技术：
目前已经确认幽门螺杆菌(helicobacter pylori,H.Pylori,Hp)与上消化道疾病中的ー些疾病密切相关，包括胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌。幽门螺杆菌全菌有非常复杂的抗原成分，此菌菌种保存不易、生产周期长、产量低、易受污染。随着分子生物学的发展，人们迅速投入了对 Hp各种特殊基因的研究，已成功克隆了十多种Hp不同的基因组或基因，其中包括趋化因子CheA和cheY、细胞毒素相关基因cagA和cagC、鞭毛素基因fIaA和flaB、热休克蛋白质基因hspA、空泡毒素基因vacA、尿素酶基因ureA、ureB、ureC、修复基因recA、空泡韋素基因vacA、喊性憐酸酶基因组等。目如已发现重组的尿素酶、热休克蛋白、细胞毒素相关蛋白、空泡毒素、黏附素等亚单位蛋白或融合蛋白均可以作为免疫原刺激机体产生保护性免疫反应。此外还发现幽门螺杆菌核酸疫苗也存在重要的免疫保护性。细胞毒素相关蛋白(CagA) :CagA是ー种亲水性免疫显性蛋白，免疫原性强，是Hpcag毒力岛的标志，相对分子质量为120000 140000，位于细菌表面，与消化性溃疡、萎缩性胃炎及胃癌的发生密切相关，能刺激胃上皮细胞分泌IL-8，促进粒细胞在胃黏膜中聚集，从而发生严重的炎症反应。cagA基因5’端高度保守，3’端区域含有数目可变的谷氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-酪氨酸-丙氨酸(EPIYA)重复序列，CagA大小的变化与cagA基因3’端存在的重复序列有关。Ghiara、han、黄琢等对cagA基因做了许多研究，包括克隆cagA基因、在大肠杆菌中表达重组的cagA，将表达蛋白免疫小鼠。结果酶联免疫吸附试验(ELISA)证明表达的蛋白都具有強弱不等的抗原性，不仅成功清除了小鼠胃内的Hp，而且有效保护小鼠免遭Hp的再感染，可见重组的CagA全长或片段都有较强的免疫原性，是幽门螺杆菌疫苗的首选抗原
之一 O尿素酶及其亚单位(ureA、ureB、ureC等)是幽门螺杆菌的定植因子和毒力因子，为幽门螺杆菌在胃内生存的必要条件。研究表明所有幽门螺杆菌菌株均能产生尿素酶，井且序列高度保守，表达量高。尿素酶ー组基因位于4. 2kb的DNA片段中，有4个开放读码框(ORFs)，编码相对分子量分别为26 500 (尿素酶A亚单位，UreA)、61 600 (尿素酶B亚单位，UreB)、49 200 (尿素酶C亚单位，UreC)、15 000 (尿素酶D亚单位，UreD)的多肽。A和B两个亚单位是主要的功能单位，以I :1的比例构成ー个基本的酶分子，UreC和UreD的功能目前还不清楚，可能为调节基因。其中以B亚单位抗原性和保护作用最強，是幽门螺杆菌免疫防治的主要候选疫苗之一。研究表明，单ー的幽门螺杆菌抗原免疫水平低，但多种抗原成分联合免疫可以提高免疫性，可使100%的小鼠避免幽门螺杆菌感染。姜政、朱森林等成功克隆并融合表达了Hp的hsp和外膜蛋白,Western印迹法检测显示重组蛋白有良好的免疫原性,构建了 UreB/hpaA双价抗幽门螺杆菌活疫苗。
发明内容
本发明克服了现有单ー幽门螺杆菌基因疫苗免疫水平低的不足，提供ー种幽门螺杆菌UreB、CagA蛋白联合免疫的基因疫苗的制备方法，以达到提高免疫性，避免幽门螺杆菌的感染的目的。为解决上述的技术问题，本发明的一种实施方式采用以下技术方案
本发明提供了一种幽门螺杆菌UreB、CagA蛋白疫苗的制备方法，其具体步骤如下以EcoR I、Pst I分别正向酶切重组质粒pUC-ureB及pUC-cagA,经I. 0%琼脂糖凝胶电泳割胶回收目的片段，连接并转化，挑取抗性克隆扩增，抽提质粒，得到pUC-ureB-cagA,酶切鉴定。 采用氯化钙法将表达载体PlRES转化受体菌DH5a感受态细胞，筛选氨卞西林抗性菌落选择性扩增，碱裂解法小量抽提质粒，得到PIRES。分别将抽提所得pIRES及重组质粒pUC-ureB-cagA双酶切，所使用的两种酶为EcoR I ,Pst I，然后将酶切产物分别进行O. 8%琼脂糖凝胶电泳，割胶回收目的片段。将pUC-ureB-cagA 经双酶切所得的 ureB-cagA 片段插入 pIRES 的 EcoR I、Pst I切点。获得连接产物pIRES-ureB-cagA。将连接产物全部转化受体菌DH5a的感受态细胞，筛选氨卞西林抗性菌落，选择性扩增，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切鉴定；以抽提质粒为模板，ureB上游引物及cagA下游引物为ー对引物PCR扩增目的片段。将pIRES-ureB-cagA化学转化活减毒鼠伤寒沙门菌LB5000进行甲基化修饰，筛选氨卞西林抗性菌落，选择性扩增，碱裂解法小量抽提质粒，进ー步电击转化终宿主菌SL7207,挑取抗性克隆于含100ug/ml氨卞西林LB培养液扩增60代，每10代抽提质粒进行PCR及双酶切鉴定，得到蛋白质和寡核苷酸的混合物。采用SDS-PAGE分离上述所得蛋白质和寡核苷酸；SDS_PAGE使用12%的分离胶和4%的积层胶。使用缓冲液B洗涤上述所得蛋白质后分别用浓度为2mol/l、4mol/l、6mol/l、8mol/l尿素变性缓冲液溶解包涵体。采用亲和层析洗脱部分杂质蛋白，使表达蛋白初纯化。制备小鼠抗血清初纯化蛋白SDS-PAGE后，以去离子水洗胶，然后以O. 05%考马斯亮兰R-250水溶液染胶30分钟，继续以去离子水洗胶，反复几次至目的蛋白条带变白。割下蛋白条带磨碎后加入Iml PBS，皮下注射小鼠，两周后再予以皮下注射加强免疫。加强免疫一周后收集小鼠内侧眼窝血液，制备血清。与现有技术相比，本发明的有益效果之一是本发明提供的含幽门螺杆菌UreB、CagA蛋白的新疫苗，不是UreB蛋白和CagA蛋白単独免疫时免疫效カ相加的和，而是UreB、CagA蛋白共同免疫使免疫效カ达到一个更高的水平，解决了目前幽门螺杆菌基因疫苗免疫水平低的问题。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，对本发明进行进一歩详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用干限定本发明。I融合基因ureB-cagA的构建及鉴定以EcoR I、Pst I分别正向酶切重组质粒pU C-ureB及pUC-cagA,割胶回收目的片段，连接并转化，挑取抗性克隆扩增，抽提质粒，得到pUC-ureB-cagA,酶切鉴定。I. I酶切重组质粒
Positive pUC-ureB or pi 1C- cagA Plasmid4ul
10 X Buffer B2 Li I [coR I0.5ul Pst I0.5ul ddH2013ul37°C酶切I小时，2ul IOxLoadding Buffer终止反应，I. 0%琼脂糖凝胶电泳I. 2重组质粒pIRES-ureB-cagA的构建及鉴定(亚克隆)I. 2. IpIRES的扩增和抽提 采用氯化钙法将表达载体pIRES转化受体菌DH5a感受态细胞，筛选氨卞西林抗性菌落选择性扩增，碱裂解法小量抽提质粒。I. 2. 2pIREs 和 pUC-ureB-cagA 酶切回收分别将抽提所得pIRES及重组质粒pUC-ureB-cagA双酶切
pUC-ureB- CagA 或 pIRES vector4ul
10 X Buffer D2ul EcoR I0.5ul Pst I0.5ul
CidH2O13ul37°C酶切I小时，2ul IOxLoadding Buffer终止反应，0. 8%琼脂糖凝胶电泳。割胶回收目的片段。I. 2. 3 重组质粒 pIRES-ureB-cagA 的构建将pUC-ureB-cagA 经双酶切所得的 ureB-cagA 片段插入 pIRES 之 EcoR I、Pst I切点。反应体系及条件Ligation Solution IIOulEnzyme digested piRES vector 2. 5ulureB-cagA fragment7. 5ul混匀，16°C反应30分钟或4°C过夜。2 pIRES-ureB-cagA的转化,筛选,扩增及鉴定
将连接产物悉数转化受体菌DH5a的感受态细胞，筛选氨卞西林抗性菌落，选择性扩增，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切鉴定；以抽提质粒为模板，ureB上游引物及cagA下游引物为ー对引物PCR扩增目的片段。3重组DNA疫苗的构建及稳定性将pIRES-ureB-cagA化学转化活减毒鼠伤寒沙门菌LB5000进行甲基化修饰，筛选氨卞西林抗性菌落，选择性扩增，碱裂解法小量抽提质粒，进ー步电击转化终宿主菌SL7207,挑取抗性克隆于含100ug/ml氨卞西林LB培养液扩增60代，每10代抽提质粒行PCR及双酶切鉴定。3. I取_20°C冻存的SL7207接种至新鲜LB液体培养基，在37°C，250_300rpm离心12小时。3. 2移取30ul上述离心后的LB液体培养基接种至3ml新鲜LB液体培养基上，在37°C，300rpm 离心 3 小时。3. 3在A6qq=O. 4时将上述液体培养基分装于I. 5ml离心管，冰浴20分钟，在4V，12000g离心I分钟。3. 4弃上清，等体积冰预冷双蒸水重悬沉淀，在4°C，12000g离心I分钟。3. 5弃上清，10%甘油750ul重悬沉淀，在4°C，12000g离心I分钟。3. 6弃上清，10%甘油30ul重悬沉淀，在4°C，12000g离心I分钟。3. 7弃上清，10%甘油500ul重悬沉淀(A600=O. 8 I. 0)，移取40ul至0. 5ml冰冷离心管。3. 8取目的DNA (pIRES-ureB-cagA) 2ul，与冰冷离心管里的悬浮细胞混匀，冰浴I分钟，_20°C预冷电击杯(0. 2cm)，电击转化，获得转化菌，转化条件25uF，2. 5kV,200Q,5ms ο3. 9电击转化完成后，向转化菌中迅速加入在37°C水浴预热的LB培养液lml，然后37°C、160-200rpm 离心 I 小时。3. 10用IOOul转化菌涂布含100ug/ml氨卞西林的LB平板，室温平放至液体吸收，37°C倒置培养12-16小时。3. 11挑取单个白色菌落接种至3ml含100ug/ml氨卞西林的LB培养液，37°C、250rmp离心12小时。3. 12收取细菌，-80°C冻存·4蛋白表达检测SDS-PAGE:安装玻璃板，制备12%的分离胶和4%的积层胶灌胶将分离胶迅速注入玻璃夹层中，上部以异丁醇封面，垂直置于室温，保持胶面平稳，待其聚合完全后，倒去异丁醇，去离子水冲洗数次以除去未聚合的丙烯酞胺，吹干，灌入积层胶，立即插入干净点样梳。样品制备将待测沉淀加入等体积IXSDS加样缓冲液(SDS Ig, β-巯基こ醇2ml，甘油5ml,O. 1%溴酚蓝O. 5ml，O. 5M Tris-小时Cl 6.25ml，pH6. 8，去离子水定容至50ml。上清加2XSDS)，沸水浴5_10分钟，使蛋白质变性。加样将I X电泳缓冲液(Tris 3. 03g,甘氨酸14. 4g，SDS Ig,溶解于去离子水至终体积1000ml)加入电泳槽，拔去上样梳，注射器冲洗，以微量加样器分别吸取20ul待测样品和蛋白分子量标准加样。电泳加样后，接通电源，先以低电压80V，待样品于积层胶浓缩成一条线后，再加至150V恒压电泳,待溴酹蓝指标剂到达分离胶 底部边缘时停止电泳。Western-blot:电转移将凝胶从玻璃板内取出，切除积层胶，在转移缓冲液(Tris 3.03g，甘氨酸14. 4g，SDS lg，溶解于700ml去离子水，甲醇200ml，去离子水补至终体积1000ml)平衡30分钟。同时将硝酸纤维素膜及厚滤纸剪成与待转移胶相同尺寸，井置于电转移缓冲液中浸泡。将semi-Dry装置的阳极扳起，依次叠放6层厚滤纸ー硝酸纤维素膜一待转移胶一6层厚滤纸，去除气泡，盖上阴极板，电压5-6V转移30分钟。显色将转移后的硝酸纤维素膜剪下含有蛋白分子量Marker的一道，放入氨基黑染色液(O. 1%氨基黑10B，45%甲醇，10%こ酸，45%去离子水混合液)中染色5-10分钟，再放入氨基黑脱色液(90%甲醇，2%こ酸，8%去离子水混合液)中脱色至蛋白条带显露，观察转移效果。封闭非特异结合位点PBS冲洗硝酸纤维素膜后，以封闭液(含3%BSA，1%明胶的PBS)覆盖膜表面，37°C温育I. 5小时后PBS洗涤。一抗反应加入1:1000以PBS (含3%BSA)稀释的小鼠源His Tag单克隆抗体，37°C温育I. 5小时。ニ抗反应以PBS (含O. 3%Tween-20)洗涤硝酸纤维素膜3次，每次10分钟。カロ入1:1000以PBS (含3%BSA)稀释的AP偶联马抗鼠IgG抗体，37°C温育I. 5小时。显色以PBS (含O. 3%Tween-20)洗涤硝酸纤维素膜3次，每次10分钟。将IOml显色液(100mmol/L Tris-HCI, 100mmol/L NaCl, 5mol/LMgCI2: IOul, 50mg/mlNBT 66ul, 50mg/ml BCIp 33ul，pH9. 5)均匀铺在硝酸纤维膜的表面，避光显色30分钟-2小时。5包涵体的溶解5. I 缓冲液 B(20mmol/L Tris-HCI,0. 5mol/LNaCI, 5mmol/L 咪哇，ρΗ7· 5)洗涤 2次,4°C、IOOOOrpm离心10-13分钟，弃上清。5. 2 最小体积 2mol/L 尿素变性缓冲液(20mmol/L Tris-HCI,0. 5mol/L NaCI,pH7. 9)重悬沉淀,4°C、IOOOOrpm离心10分钟，弃上清.5. 3最小体积4mol/L尿素变性缓冲液重悬沉淀，4°C、IOOOOrpm离心10分钟弃上
清5. 4最小体积6mol/L尿素变性缓冲液重悬沉淀,4°C、IOOOOrpm离心10分钟,弃上清。5. 5最小体积8mol/L尿素变性缓冲液重悬沉淀,4°C、IOOOOrpm离心10分钟,弃沉
淀。上清中融合蛋白含量高达92%，浓度约50ug / ml。
6表达蛋白的初纯化利用亲和层析法，洗脱部分杂质蛋白。6. I 灌柱:取 lml His-Bind Resin 上柱，pH7. 4PBS 平衡后，以 O. 3-0. 4ml/分钟的速度将 lmol/L NiSO4上柱至饱和，并以 10倍柱体积的Binding Buffer (20mmo1/T.Tri s~HCT,
0.5mol/L NaCI,50mmol/L 咪哇，pH7. 9)洗平。6. 2上样以O. 3-0. 4ml/分钟的速度将预处理的样品上柱，待出现蛋白峰后收集上样流出液。以 I. Oml/分钟的速度以 Washing Buffer (20mmol/L Tris-HCI, O. 5mol/LNaCI,50mmol/L 咪哇，pH7. 9)洗平。 6. 3 洗脱:以 O. 3-0. 4ml/分钟的速度以 Elution Buffer (20mmol/L Tris-HCI,
0.5MNaCI,咪哇，ρΗ7· 9)进行梯度洗脱，咪哇的浓度分别为IOOmmoI/L, 150mmol/L,250mmol/L,收集各梯度洗脱峰。6.4 再生以 Stripping Buffer(20mmol/L Tris-HCI,O. 5mol/L NaCI,50mmo/LEDTA, pH7. 9)去除Ni2+后，15%こ醇液封。6. 5电泳将上样流出液、梯度洗脱液加入样品处理液，SDS-PAGE检测。最后蛋白含量达91%，终浓度30ug / ml。7小鼠抗血清的制备初纯化蛋白SDS-PAGE后，以去离子水洗胶，然后以O. 05%考马斯亮兰R-250水溶液染胶30分钟，继续以去离子水洗胶，反复几次至目的蛋白条带变白。割下蛋白条带磨碎后加入lml PBS，腹部皮下注射免疫小鼠，2周后复予500ul加强免疫。加强免疫I周后，以l_2mm毛细管插入小鼠内侧眼窝，收集血液,室温放置1_2小时，至血清充分析出后离心(1200rpm，10分钟)，收集血清，加入叠氮化钠至终浓度O. 02%,4°C保存。抗体检测Western Blot检测小鼠抗体产生情况。ー抗为1:1000 (以含3%BSA PBS稀释)鼠血清；ニ抗为1:1000 (以含3%BSAPBS稀释)AP偶联马抗鼠IgG抗体。8抗血清效价测定采用ELISA 法。包被将纯化UreB、NaPA及hpaA分别以包被缓冲液(O. 05mol/L碳酸盐缓冲液3. 5 份 5. 3g/LNa2C03 与 6. 5 份 4. 2g/LNaHC03 现混，pH 9. 6)按 1:1000 倍稀释(终浓度约10ug/ml)，沿酶标板孔壁滴加200ul至每个板孔中，排除气泡，4°C过夜。洗涤甩干板孔内液体，分别加满洗涤缓冲液(PBS+0. 05%Tween-20,pH7. 4)，浸泡5分钟后甩干。重复3次。加样将待检抗血清以洗涤缓冲液行一系列1/2梯度稀释，分别移取稀释抗血清加入己包被反应孔中，每孔200ul，37°C孵育2小时，洗涤。加酶标抗体于各反应孔中，加入200ul新鲜稀释AP标记马抗鼠IgG，37°C孵育2小时，洗涤。显色于各反应孔中加入临时配制AP显色液(100mmol/L Tris, lOOmmol/LNaCI,20mmol/Lp-Npp,pH9. 5) 200ul，室温放置5_10分钟，待显色后，加入50ul反应终止液(2mol/L NaOH)。
比色測定以全自动酶标检测仪于405nm波长测定各反应孔A值。尽管这里參照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开、和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变型和改进外，对于本领域技术人员来说，其 他的用途也将是明显的。
权利要求
1.ー种含幽门螺杆菌UreB、CagA蛋白的基因疫苗的制备方法，其特征在于通过基因工程技术重组质粒pIRES-ureB-cagA，并将其扩增、修饰、转化、筛选后电击转化到终宿主菌SL7200中表达UreB、CagA蛋白进行联合免疫而制备得到的基因疫苗。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述重组质粒pIRES-ureB-cagA由表达载体PlRES和重组质粒pUC-ureB-cagA经双酶切重组构建。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述扩增是指重组质粒pIRES-ureB-cagA以ureB上游引物及cagA下游引物为ー对引物的PCR扩增。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述修饰是重组质粒pIRES-ureB-cagA转化活减毒鼠伤寒沙门菌LB5000进行的甲基化修饰。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述转化是指将重组质粒pIRES-ureB-cagA化学转化到DH5a的感受态细胞或者活减毒鼠伤寒沙门菌LB5000。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述筛选是指重组质粒pIRES-ureB-cagA进行化学转化或电击转化后筛选氨卞西林抗性菌落。
7.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述重组质粒pUC-ureB-cagA由重组质粒pUC-ureB及pUC_cagA经酶切重组构建。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述双酶切的酶为EcoRI和Pst I。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述酶切是指由EcoRI、Pst I分别正向酶切重组质粒pUC-ureB及pUC_cagA。
全文摘要
本发明提供一种含幽门螺杆菌UreB、CagA蛋白的基因疫苗的制备方法，是利用基因工程技术将重组质粒pUC-ureB及pUC-cagA构建重组质粒pIRES-ureB-cagA，转化，筛选，扩增及鉴定后，化学转化活减毒鼠伤寒沙门菌LB5000进行甲基化修饰，筛选氨卞西林抗性菌落，选择性扩增，碱裂解法小量抽提质粒，进一步电击转化终宿主菌SL7207，挑取抗性克隆于含100ug/ml氨卞西林LB培养液扩增后将得到的蛋白纯化制成的幽门螺杆菌疫苗。本发明提供的含幽门螺杆菌UreB、CagA蛋白的新疫苗，是UreB、CagA蛋白共同免疫使免疫效力达到一个更高的水平。
文档编号A61P31/04GK102688502SQ20121017594
公开日2012年9月26日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者侯文礼, 冯晓, 蔡勇, 钟泽荣 申请人:成都康华生物制品有限公司
文档序号 :
【 810707 】
技术研发人员：侯文礼,蔡勇,钟泽荣,冯晓
技术所有人：成都康华生物制品有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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技术研发人员：侯文礼,蔡勇,钟泽荣,冯晓
技术所有人：成都康华生物制品有限公司
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