一种5-α还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷A及其制备方法
专利名称：：一种5-α还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷A及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及中药生物活性成分的提取制备方法，具体涉及一种5-a还原酶抑制剂一荨麻裂环木脂素苷A及其制备方法。荨麻属植物中含有大量的木脂素类成分，从中鉴定出了13个木脂素类化合物(+)-新橄榄树脂素、(-)-开环异落叶松脂素、异落叶松脂素、松醋醇、3，4-二香草基四氢吠喃、新橄榄树脂素-4-0-e-D-葡萄糖苷、9-乙酰基-新橄榄树脂素、9-乙酰基-新橄榄树脂素-4-0-e-D-葡萄糖苷、9，9'-二乙酰基-新橄榄树脂素、9，9'-二乙酰基-新橄揽树脂素-4-0-e-D-葡萄糖苷、(-)-开环异落叶松脂素-9-o-e-D-葡萄糖苷、(-)-开环异落叶松脂素-4-O"e-D-葡萄糖苷、新橄榄树脂素-9-0-e-D-葡萄糖苷。其结构类型主要有新橄榄树脂素及其苷类和开环落叶松脂素、落叶松脂素及其苷类，其中新橄榄树脂素及其苷类结构如下
背景技术：
：新橄榄树脂素新橄榄树脂素4-0-P-D-葡萄糖苷新橄榄树脂素-9-O-P-D-葡萄糖苷9-乙酰基-新橄榄树脂素.OGIucose9,9、-二乙酰基-新橄榄树脂素、9-乙酰基-新橄榄树脂素-4-0-P-D-葡萄糖苷OCH39,9、-二乙酰基一新橄揽树脂素-4-0-p-D-葡萄糖苷橄榄脂素开环落叶松脂素、落叶松脂素及其苷类结构如下(一)-开环异落叶松脂素-4-0-P-D-葡萄糖苷5-甲氧基开环异落叶松脂素4<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>异落叶松脂素有研究表明从大荨麻根中分离到(+)-新橄榄树脂素、(-)-开环异落叶松脂素、脱氢二松柏醇、异落叶松脂素、松脂醇和3,4-二香草基四氢呋喃，并检验了以上几种物质体外与SBHG的亲和作用，结果除松脂醇外，其余化合物都有亲合力，其中3,4-二香草基四氢呋喃的亲合作用最强，浓度为250ug/ml时抑制率为95%。提示大荨麻根中木脂素类是治疗BPH的活性成分之一。本发明的课题组曾对国产的8种荨麻属植物根的不同提取物进行了抗前列腺增生的生物活性筛选，结果表明滇藏荨麻根的20%和95°/。乙醇提取物能显著地抑制前列腺增生大鼠的病变组织。
发明内容本发明的目的是在前期研究的基础上，为了进一歩研究提取物抗前列腺增生的活性部位和作用机理，选取甜列腺组织中一个关键酶一5ci-还原酶为作用耙点，采用酶联免疫(Enzyme-linkedi,nospecificassayELISA)的方法，建立抑制5a-还原酶体外模型，从大鼠前列腺组织中提取5a-还原酶，与底物睾酮以及供氢体NADPH共同组成了一种微量反应体系，利用酶标仪检测双氢睾酮(DHT)的含量，以DHT的含量来判断荨麻提取物是否有抑制5a-还原酶的活性。本发明从三角叶荨麻中分离得到了荨麻裂环木脂素苷A，该成分的结构不同于上述木脂素类成分，为一种新的裂环木脂素类成分，对抑制5a-还原酶作用研究发现具有较强活性，是一种潜在的抗前列腺增生药物成分。本发明的技术方案是:一种5-a还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷A,其分子结构式如下:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>上述的5-a还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷A的制备方法是以三角叶荨麻为原料，制备步骤如K:(1)将三角叶荨麻干燥地下部分粉碎处理后，用质量浓度为95%的工业乙醇回流提取，过滤后减压浓縮；(2)将醇提取物用50-9(TC的水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，各萃取三次；(3)正丁醇萃取物经大孔树脂D101分离，采用质量浓度为30%的乙醇洗脱，收集洗脱液；(4)乙醇洗脱液用硅胶柱色谱分离纯化，采用体积比为氯仿甲醇=30:1、10:1、5:1、3:1、1:l的梯度洗脱，收集洗脱液；(5)步骤(4)的洗脱液经反相硅胶柱色谱分离纯化，采用体积比为甲醇水=3:7的溶液洗脱，每15-30ml收集成1份，收集第15-20份洗脱液，合并浓缩后得到荨麻裂环木脂素苷A。采用核磁共振(NMR)等波谱技术测定其结构，荨麻裂环木脂素苷A的波谱数据见表1。表1.荨麻裂环木脂素皆A的'HNMR和'3CNMR<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>荨麻裂环木脂素苷A可以用于制备抗前列腺增生药物，将有效剂量的荨麻裂环木脂素苷A与药用载体混合并制成适当剂型的药物。本发明的有益效果是原料为纯天然植物根，安全易得，方法简单易操作，不引入有毒物质，成本低廉，在抗前列腺增生药物研究开发上具有非常重要的意义。具体实施例方式下面以具体实施例对本发明作进一歩的说明，但并不影响本发明的保护范围。实施例l三角叶荨麻药材采集自四川省阿巴州。从二角叶荨麻中制备荨麻裂环木脂苷A方法步骤如下(1)将三角叶荨麻干燥地下部分粉碎处理后，用质量浓度为95%的工业乙醇回流提取，料液比(kg/1)=1:8，提取温度9(TC，提取时间3h,提取次数3次，合并提取液，过滤后减压浓縮至无醇味；(2)将醇提物200g用2L温度为6(TC的水混悬，依次用2L的石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，各萃取3次。(3)正丁醇萃取物30g经D101大孔树脂(lkg)分离，采用质量浓度为30%的乙醇洗脱，收集洗脱液10L;(4)乙醇洗脱液浓縮至干得5g，用硅胶柱色谱(硅胶150g)分离纯化，采用体积比为氯仿甲醇=30:1、10:1、5:1、3:1、1:1梯度洗脱，收集每个比例洗脱液1L;(5)步骤(4)的洗脱液浓縮至干得lg,然后经反相硅胶柱色谱(反相硅胶30g)分离纯化，采用体积比甲醇水=3:7的溶液洗脱，每25ml收集成l份，合并15-20份洗脱液，浓縮后得到荨麻裂环木脂素苷A120mg。实施例25-a还原酶抑制作用实验步骤如下(1)5-a还原酶的制备雄性SD大鼠3只，体重200il0g，大连医科大学实验动物中心提供，禁食不禁水过夜处死，迅速取出腹侧的前列腺组织在冰台上剪碎，用预冷的匀浆液(蔗糖0.73moH/1，氯化钙1.91mmol丄-1)在玻璃匀浆器中匀浆，在4。C下以10000rpm低温高速离心20min,取上清液再以16000rpm低温高速离心30min，即得5a-还原酶提取物。采用lowiy法测定蛋白含量，以酶提物中的总蛋白含量表示5a-还原酶提取物的含量，将提取物放入小离心管在-70。C下保存，备用。(2)5a-还原酶抑制活性测定操作分两部分完成，即①将反应成分37'C恒温缓冲液、睾酮、实施例l制备的荨麻裂环木脂苷A样品、阳性对照药、NADPH及酶组织液依次加入96孔板内，使之微量化，设置不同反应孔和对照孔板。反应温度为37。C(相对饱和湿度)，反应时间为60min;②采用ELISA法定量测定产物DHT，以产物的生成量大小反映酶活性的强弱。受试样品管中DHT的含量低于酶反应管中DHT含量时，则视为具有抑制5a-还原酶的活性。检测方法及计算参照睾酮试剂盒(购于AdlitteramDiagnosticLaboratories公司)使用说明进行。所有实验孔均为双复孔操作。在已经确定的反应体系基础上，辅酶NADPH浓度为lmmol乇"，睾酮浓度为0.5pmol丄—、结合睾酮试剂盒微量测定的特点，将整个反应体系的总量定为20(^1。酶反应体系中各组分的原始浓度分别为缓冲溶液(PBS20mmol七-l，蔗糖O.2mol七—1，EDTANa2l薩ol七-1，pH6.8);NADPH浓度(20mmol丄力；粗酶浓度(4.3mg'mr1);睾酮浓度(20拜ol.L—1);非那雄胺(1.3mmol七'1)。测定结果见表2。表2荨麻裂环木脂素苷A抑制5a-还原酶作用空白对照组非那雄胺组样品组DHT含量(ng/ml)7.43.53.8从上表可以看出荨麻裂环木脂素A能显著抑制DHT的生成，与阳性药非那雄胺相当。权利要求1、一种5-α还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷A，其特征在于，其分子结构式如下2、权利要求1所述的一种5-a还原酶抑制剂一荨麻裂环木脂素苷A的制备方法，其特征在于，该方法是以三角叶荨麻为原料，歩骤如下(1)将三角叶荨麻干燥地下部分粉碎处理后，用质量浓度为95%的工业乙醇回流提取，过滤后减压浓縮；(2)将醇提取物用50-9(TC的水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，各萃取三次；(3)正丁醇萃取物经大孔树脂D101分离，采用质量浓度为30%的乙醇洗脱，收集洗脱液；(4)乙醇洗脱液用硅胶柱色谱分离纯化，采用体积比为氯仿甲醇=30:1、10:1、5:1、3:1、1:l的梯度洗脱，收集洗脱液；(5)步骤(4)的洗脱液经反相硅胶柱色谱分离纯化，采用体积比为甲醇水=3:7的溶液洗脱，每15-30ml收集成1份，收集第15-20份洗脱液，合并浓縮后得到荨麻裂环木脂素苷A。全文摘要本发明涉及中药生物活性成分的提取制备方法，具体涉及一种5-α还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷A及其制备方法。本发明在前期研究的基础上，从三角叶荨麻中分离得到了荨麻裂环木脂素苷A，该成分的结构不同于上述木脂素类成分，为一种新的裂环木脂素类成分，其分子结构式如上，上述的5-α还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷A的制备是以三角叶荨麻为原料，5-α还原酶抑制剂-荨麻裂环木脂素苷A对抑制5α-还原酶作用研究发现具有较强活性，是一种潜在的抗前列腺增生药物成分。文档编号A61P13/08GK101671379SQ20091001270公开日2010年3月17日申请日期2009年7月22日优先权日2009年7月22日发明者冯宝民,史丽颖,王恵国,王永奇申请人:大连大学
文档序号 :
【 1300837 】
技术研发人员：冯宝民,王恵国,史丽颖,王永奇
技术所有人：大连大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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