大规模连续生产病毒疫苗的方法

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专利名称：大规模连续生产病毒疫苗的方法
技术领域：
应用生物反应器大规模培养动物细胞(如CHO，BHK，293细胞，杂交瘤细胞，昆虫细胞等)已有很多报道。可生产的基因工程产品，如蛋白分泌型产品红细胞生成素(EPO)和组织型纤溶酶原(t-PA)等均有报道。
然而，由于蛋白分泌型产品和病毒疫苗在培养基配方、生产工艺上存在很大区别，因此现在利用生物反应器来大规模生产病毒疫苗的方法还很少。以人用狂犬疫苗为例狂犬病是一种自然疫源性疾病，是由狂犬病引起的所有温血动物都易感染的人兽共患性疾病，一旦发病，100％死亡。据世界卫生组织的统计，每年约有30,000人死于狂犬病。据中国卫生部统计，中国2001年狂犬病人的病死率高达95.88％，高居甲、乙类传染病首位。研制良好的狂犬疫苗不仅可预防狂犬病，也可治疗狂犬病。中国国内传统的狂犬疫苗生产方法是将原代细胞地鼠肾细胞经过滚瓶培养后接种狂犬病毒，然后经浓缩而成。这种生产方法生产的狂犬疫苗品质差，效价低，有些疫苗需要添加佐剂，部分病人接种疫苗后会出现全身性过敏反应，而且免疫和治疗效果不十分理想，存在许多后遗症。2001年中国政府已经明令禁止生产和销售用地鼠肾细胞经过浓缩而灌装的狂犬疫苗，只允许暂时生产纯化后的地鼠肾细胞精制狂犬疫苗。“暂时允许”是指国家将强制执行洁净动物相关法规，所有的用于生物药物的动物必须饲养在符合国家标准的动物房内。届时以地鼠肾细胞为原料的狂犬疫苗的生产成本将大大提高。而国家允许生产和销售的另一种类型狂犬疫苗就是以传代细胞Vero细胞(从非洲绿猴肾细胞培养而来)为宿主的狂犬疫苗。目前，国内已有部分单位用转瓶机工艺来生产Vero细胞狂犬疫苗，并经纯化精制而成。但仍然处于起步阶段，表现为规模小，成本高，产品批次之间质量相差较大，而且整体质量不稳定。目前国内尚未见到用生物反应器生产狂犬疫苗的报道。
国外目前用生物反应器生产狂犬疫苗主要有两种工艺方法。(1)在大型细胞培养罐(通常罐体积在800升至1200升之间)中，用Vero细胞作为宿主细胞，用球形微载体(商品名Cytodex-1)作为细胞生长载体，每升培养基只能加入3-5克微载体；批式培养，达到一定细胞密度后接种病毒。这种方法的缺点是显而易见的每升培养基所加的微载体太少，不能连续培养，生产过程中若造成污染损失巨大，因而产品成本特高，市场价格相应更高。(2)在可以连续培养的7.5-30升生物反应器里用一种特别的搅拌桨(商品名Cell-LiftImpeller)，以Vero细胞为宿主细胞，球形微载体(商品名Cytodex-1)作为细胞生长载体，每升培养基可加入25克微载体，连续培养，连续收获。此方法比较前一种虽然有改进，但在生物反应器上要配细胞沉降系统，而且微载体最多只能重复使用两次，设备投资较大，生产过程中耗材成本较高。
因此，本领域中仍然需要有一种成本更低的大规模连续生产诸如狂犬疫苗等病毒疫苗的方法。

发明内容
本发明的目的就是提供一种成本更低的大规模连续生产病毒疫苗的方法。
本发明涉及一种大规模连续生产病毒疫苗的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤a)在具有固定床篮式搅拌系统的Celligen Plus生物反应器中，以聚酯切片Fibra-CelTMDisks为载体，培养用于生产病毒的细胞；b)在细胞生长至一定密度时，接种所述病毒，使所述病毒感染细胞；c)使病毒增殖；d)纯化收获病毒。
在本发明的方法中，所用的Celligen Plus生物反应器是购自New BrunswickScientific Co.，Inc.公司的生物反应器。该生物反应器中装有固定床篮式培养系统(商品名为固定床篮式搅拌系统(Fibrous-Bed Basket System))，该培养系统是一种用于细胞培养的搅拌系统，其特点在于a)搅拌时形成的剪切力非常低，尤其在50-120rpm之间作用在细胞上的剪切力几乎为零；b)设计有专门的气体回路，当培养细胞过程中需要向生物反应器通入各种气体，例如空气，氧气，二氧化碳和氮气时所产生的气泡会沿着特定的回路进出，而不会像其他培养系统那样让细胞贴在气泡表面，当气泡升至液面破裂时，细胞也随之死亡；c)是唯一可使用聚酯切片载体的细胞培养系统。
本发明方法可采用总体积为5.0升和7.5升的生物反应器，但是本领域技术人员在阅读了本说明书的描述后可以预计到，体积更大的生物反应器也适用于本发明方法。
本发明方法中采用的载体是由英国BIBBY STERILIN COMPANY生产的聚酯切片载体(Fibra-CelDisks)。该载体成分为50％聚酯非织造纤维和50％聚丙烯片。经发现，该聚酯切片载体可在特定的环境里提供细胞生长空间。
在本发明中用来生产病毒疫苗的细胞(即，宿主细胞)可以是本领域技术人员所熟知的那些动物细胞，例如CHO细胞，BHK细胞，293细胞，Vero细胞等。
在本发明的一个较佳实施方案中，宜采用Vero细胞作为病毒生产细胞。因为Vero细胞是广谱宿主细胞，接种狂犬病毒后，可生产狂犬疫苗；接种出血热病毒，可生产出血热疫苗；同理，还可生产乙脑疫苗，小儿脊髓灰质炎疫苗，轮状病毒疫苗等病毒性疫苗。因此预计将本发明广泛应用于上述疫苗以及其他各种疫苗的生产。
因此，在本发明的一个较佳实施方案中，所述疫苗选自狂犬疫苗、出血热疫苗、乙脑疫苗、小儿脊髓灰质炎疫苗和轮状病毒疫苗等病毒疫苗。更佳的疫苗是狂犬疫苗、出血热疫苗和乙脑疫苗。
在本发明的方法中，首先是在上述生物反应器中，在上述聚酯切片存在下，将生产病毒用的细胞培养至一定密度，然后再进行接种。接种病毒的时间是影响疫苗产量的主要因素之一。在本发明中，接种病毒时细胞密度可在1.0×107-2.0×108/毫升之间。在较佳的实施方案中，接种病毒时的细胞密度为1.0-1.4×108/毫升。在一个特别佳的实施方案中，接种病毒时的细胞密度为每毫升1.2×108个细胞左右(也就是细胞在反应器里培养了5-7天左右)。
在一个较佳的实施方案中，在接种病毒后，宜在低速搅拌条件下进行培养，以使病毒感染宿主细胞。较佳的，宜在50-100rpm(更佳的在60-80rpm)的搅拌速度下进行培养。
本发明方法比照现有技术的不同特点之一是可以连续培养。在连续培养过程中病毒在宿主细胞(如Vero细胞)中不断增殖并释放到培养上清中，通过蠕动泵排到反应器外；与此同时，另一个蠕动泵则把新鲜培养基加入反应器内，以提供细胞生成和病毒增殖所消耗的营养。另一方面，每天加入的培养基的量(灌注量)不能过少，一般需使培养基中的葡萄糖含量保持在2g/L以上(通常在2-3克/升，更通常地在2-2.5克/升)，这样才能维持高产量的病毒。同时，如果搅拌速度太低，则产量将极大减少甚至导致所有细胞死亡。
本发明方法可分为三个阶段1)宿主细胞生长阶段、2)病毒感染阶段和3)病毒增殖和收获阶段。在这三个阶段中所用的培养基组成、培养条件(如温度，pH，溶氧)等不难由本领域普通技术人员根据所用的宿主细胞类型来加以确定。然而，应注意，病毒增殖阶段的温度和pH应低于前两个阶段的温度和pH。例如，对于用Vero细胞来生产狂犬疫苗而言，在宿主细胞生长阶段和病毒感染阶段的pH宜为7.2-7.5(较佳的为7.3)，温度宜在37℃左右；而在病毒产生阶段，pH宜在7.0-7.2(较佳的为7.1)，温度宜在32-35℃之间(较佳的为34℃)。
在病毒感染后一定时间后，就可开始连续收获培养上清中的病毒。病毒滴度可用常规手段(如小鼠注射法)来测定。
与现有技术相比，本发明的大规模连续生产病毒疫苗的方法具有培养的细胞密度高、可连续收获和产量高(平均滴度高)的优点。据报道，在利用转瓶机培养Vero细胞来生产狂犬疫苗的方法中，每个转瓶每次收获300毫升上清液，每个周期每瓶收获2-3次，收获周期为9天，污染率3％，放架率为90％，用于产毒的转瓶机大约只能占全部转瓶机数量的60％。而本发明通过使用150克聚酯载体，相当于150个内表面积为1200平方厘米的转瓶，可连续培养，每天可以收获7000毫升上清，而且连续培养时间可长达20天，收获期污染率为零。现有技术中接种病毒时的细胞密度仅为1×106细胞/毫升，而本发明方法接种病毒时的细胞密度可达1×108细胞/毫升。综合可比因素分析对比，本发明方法的产量比现有技术中转瓶机方法提高了100倍。
具体实施方案给出以下的实施例目的是阐明本发明，但不能解释成限制本发明的范围。
实施例1狂犬疫苗的大规模生产在本实施例中，采用的主要设备是5.0升生物反应器(商品名CELLIGEN PLUS，购自美国NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC CO.，INC.)。该生物反应器的罐体为夹套式耐高温高压玻璃罐体，总体积5升，工作体积3.5升。该生物反应器采用的搅拌系统是固定床篮式搅拌系统(FibrousTM-Bed Basket System)。
本实施例中所用的培养基是M199培养基或DMEM培养基。所用其它试剂包括胎牛血清，胰酶，人血清白蛋白，FeSO4，AlCl3，ZnSO4为分析纯试剂，及滤膜，滤芯，硅胶管等为细胞培养常用材料。
从种子细胞库中复苏1支Vero细胞(由非洲绿猴肾细胞培育出的可传代的广谱宿主细胞，购自中国药品生物制品检定所)，48小时传代，用175cm2方瓶扩增到30瓶，使细胞总数达到1-2×109细胞。
在生物反应器罐体中加入150克聚酯切片(Fibra-CelTMDisks，购自NEWBRUNSWICK SCIENTIFIC CO.，INC)作为载体，并加入3.5升磷酸缓冲液PBS(pH7.4)，121℃消毒30分钟。
消毒后，排空磷酸缓冲液。加入Vero细胞生长培养基(M199+5％FBS(胎牛血清))，并接种种子细胞，在37℃、pH7.2-7.4、溶氧为40-60％、搅拌速度为90-120rpm下进行培养。最大灌流速度为8-10升培养基/天(使培养基中的葡萄糖含量保持在1-2克/升)。
在培养细胞5-7天后，将生长培养基全部抽出，换上病毒生产期培养基(M199，含1％(W/V)人血清白蛋白、1.5克/升葡萄糖、0.5毫克/升FeSO4、0.3毫克/升AlCl3、0.195毫克/升ZnSO4，pH7.3)。以2-10的感染复数(MOI)接种aG狂犬病毒株(购自中国药品生物制品检定所)。在37℃、pH7.2-7.4、溶氧为40-60％、搅拌速度为60-80rpm下培养6-8小时，使病毒感染细胞。
然后，在32-35℃、pH7.0-7.2、溶氧为40-60％、搅拌速度为120rpm下进行培养，并恢复接种病毒前的灌注速度，使病毒在细胞中大量增殖。在病毒感染36小时以后，开始收获含病毒的上清，并用于纯化。
上清收获量为5-8升培养基/天(使培养基中的葡萄糖含量保持在2克/升或以上)，如此可维持连续收获时间在20天以上。总收获量为140升病毒上清。用小鼠注射法测得病毒滴度最高可达到9Lg LD50/毫升(半致死量的对数)。
实施例2出血热病毒疫苗的生产采用与实施例1基本相同的步骤进行本实施例，不同的是采用体积为7.5升的生物反应器，并给Vero细胞接种出血热病毒疫苗。病毒生产阶段的pH为7.0，温度为33℃。结果收获得到为250升病毒上清。用直接荧光抗体法测得病毒滴度在8Lg LD50/毫升左右。
上面虽然根据一些具体的较佳实施方案对本发明作了详细描述，但应认为，本发明并不局限于这些具体的实施例。本领域技术人员在阅读了上述描述后可在不脱离所附权利要求范围的条件下对本发明作任何改动。
权利要求
1.一种大规模连续生产病毒疫苗的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤a)在具有固定床篮式搅拌系统的Celligen Plus生物反应器中，以聚酯切片Fibra-CelTMDisks为载体，培养用于生产病毒的细胞；b)在细胞生长至一定密度时，接种所述病毒，使所述病毒感染细胞；c)使病毒增殖；d)纯化收获病毒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒疫苗选自狂犬疫苗、出血热疫苗、乙脑疫苗、小儿脊髓灰质炎疫苗和轮状病毒疫苗。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接种病毒时的细胞密度为1.0×107-2.0×108/毫升。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤b)中，使病毒在搅拌速度为50-l00rpm下感染所述细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用于生产病毒的细胞选自CHO细胞、BHK细胞、293细胞和Vero细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述用于生产病毒的细胞是Vero细胞。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在病毒增殖期间维持培养基中葡萄糖含量在2-2.5克/升。
全文摘要
本发明提供了一种大规模连续生产病毒疫苗的方法，该方法包括下列步骤a)在具有固定床篮式搅拌系统的Celligen Plus生物反应器中，以聚酯切片Fibra－Cel
文档编号A61K39/12GK1390604SQ0211201
公开日2003年1月15日申请日期2002年6月10日优先权日2002年6月10日
发明者贾抚, 刘冬连申请人:上海恩培科学仪器咨询有限公司

文档序号 : 【 998057 】

技术研发人员：贾抚,刘冬连
技术所有人：上海恩培科学仪器咨询有限公司

备注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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贾抚丨刘冬连丨上海恩培科学仪器咨询有限公司