一种海豚链球菌三价dna疫苗及其构建方法
技术领域：
本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种海豚链球菌三价DNA疫苗及其构建方法。
背景技术：
海豚链球菌(Streptococcus iniae)是一种革兰氏阳性菌,能够感染多种养殖海水和淡水鱼类，包括牙鲆、罗非鱼、石斑、美国红鱼等，因此长期以来在我国以及国际上被认为是一种主要鱼类病原菌。另外，海豚链球菌是一种人畜共患性病原，能够通过患病动物而 传染人类，因此其免疫防治研究具有重要意义。目前，由于缺乏有效的疫苗，我国海豚链球菌病防治主要依赖抗生素等药物的使用。在这种情况下，针对该菌的有效疫苗研发已成为水产养殖业的迫切需要。
发明内容
本发明目的在于提供一种海豚链球菌三价DNA疫苗及其构建方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种海豚链球菌三价DNA疫苗，以海豚链球菌G26为模板分别经引物F1/R1、F2/R2 和F3/R3进行PCR扩增，产物与载体pCN3质粒连接转化后质粒等体积混合，即为三价DNA
疫苗；所述引物为Fl :5，-CCCGGGACCACCATGAAAATTATATTAGGACTGC-3 ‘ ；Rl :5’ -CAGACCCGGGATGTTGTTCTTTAAAACTAATCAA-3’ ；F2 :5’ -CCCGGGACCACCATGAGTTTTATCGAGATTCAAA-3 ；R2 :5’ -GTCCCGGGATCTCTTAACTTCTTACCAGT-3’ ； F3 :5， -CCCGGGACCACCATGAAAATTGGTGTATTAGATAAGGA-3，；R3 :5 ’ -CGTCCCGGGTACTCTAGAAGGCTTTAATAACA-3，。以海豚链球菌G26为模板分别经引物Fl/Rl、F2/R2和F3/R3进行PCR扩增，扩增产物分别于用SmaI酶切的质粒pCN3连接，连接液分别转化到大肠杆菌DH5 α后分别在含有100 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基上培养18-24小时，所得转化子等体积混合，即为三价DNA疫苗。海豚链球菌三价DNA疫苗的构建方法，以海豚链球菌G26为模板分别经引物Fl/Rl、F2/R2和F3/R3进行PCR扩增，扩增产物分别于用SmaI酶切的质粒pCN3连接，连接液分别转化到大肠杆菌DH5 α后分别在含有100 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基上培养18-24小时，所得转化子等体积混合，即为三价DNA疫苗；所述引物为Fl :5，-CCCGGGACCACCATGAAAATTATATTAGGACTGC-3 ‘ ；Rl :5’ -CAGACCCGGGATGTTGTTCTTTAAAACTAATCAA-3’ ；
F2 :5’ -CCCGGGACCACCATGAGTTTTATCGAGATTCAAA-3 ；R2 :5’ -GTCCCGGGATCTCTTAACTTCTTACCAGT-3’ ；F3 :5， -CCCGGGACCACCATGAAAATTGGTGTATTAGATAAGGA-3，；R3 :5，-CGTCCCGGGTACTCTAGAAGGCTTTAATAACA-3，。所述三价DNA疫苗在PBS中稀释至终浓度为150 μ g/ml,即为疫苗制备液。本发明具有如下优点本发明的三价DNA疫苗在免疫后一个月和两个月时对海豚链球菌感染的保护效应高达90%以上。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而 非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法I.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor LaboratoryPress 2001)；3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。实施例I三价DNA疫苗S3D的构建I)质粒pCNF的构建以海豚链球菌G26为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR条件为94°C 60s预变性模板DNA，然后94°C 40s, 50°C 60s, 72°C 60s，5个循环后改为94°C 40s, 62°C 60s, 72°C 60s, 25个循环后再在72°C延伸反应lOmin。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化。将质粒pCN3(pCN3构建过程参见Jiao XD, Zhang M，Hu YH,Sun L. Construction and evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiella tardaantigens. Vaccine 2009 ；27 :5195 202.)用 SmaI 酶切，回收 5. 4kb 片段，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化大肠杆菌DH5 α后在含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB固体培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为pCNF。所述菌株G26保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCJi址北京市海淀区中关村北一条13号，保藏日期2007年3月22日。保藏编号为CGMCCNo. 1984,分类命名为海豚链球菌(Streptococcus iniae)。所述弓丨物为Fl :5’ -CCCGGGACCACCATGAAAATTATATTAGGACTGC-3’和 Rl :5’ -CAGACCCGGGATGTTGTTCTTTAAAACTAATCAA-3，。所述LB组成成分按重量百分比计I. O %蛋白胨，0. 5%酵母粉，1.0%氯化钠，97. 5%蒸馏水·2)质粒pCNG的构建pCNG的构建过程与上述pCNF的构建完全相同，唯一区别在于所用 PCR 引物为 F2 :5’ -CCCGGGACCACCATGAGTITTATCGAGATTCAAA-3’ 和 R2 :5’ -GTCCCGGGATCTCTTAACTTCTTACCAGT-3’。3)质粒pCNI的构建pCNI的构建过程与上述pCNF的构建完全相同，唯一区别在于所用 PCR 引物为 F3 :5’ -CCCGGGACCACCATGAAAATTGGTGTATTAGATAAGGA-3’ 和 R3 :5’ -CGTCCCGGGTACTCTAGAAGGCTTTAATAACA-3，。4)三价DNA疫苗S3D的构建将上述质粒pCNF、pCNG和pCNI以等比例混合，即为三价DNA疫苗S3D。实施例2疫苗的应用步骤I)疫苗制备液的制备。将上述DNA疫苗S3D在PBS中稀释至终浓度为150 μ g/ml，即为疫苗制备液。
所述PBS组成成分按重量百分比计0. 8 % NaCl,O. 02 % KCl,O. 358 %Na2HPO4. 12Η20，0· 024% NaH2PO4,余量为水。步骤2)疫苗的接种。将100条牙鲆(每条重约11. 4g)随机分为4组，每组25条。将这4组分别命名为A、B、C和D。将A和C组的每条鱼分别腹腔注射IOOul上述步骤I)的疫苗制备液，将B和D组(对照组)的每条鱼分别腹腔注射IOOul PBS。步骤3)海豚链球菌悬液的制备。在LB培养基中培养海豚链球菌G26至0D600为
O.9，然后离心(5000g，4°C，IOmin)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为lxl08cfu/ml，即为海豚链球菌悬液。步骤4)疫苗的免疫保护效应检测。在步骤2)免疫注射后的第30天，用上述步骤3)的海豚链球菌悬液腹腔注射步骤2)的A和B组鱼，每条鱼的注射量为IOOul ;在步骤2)免疫注射后的第60天，用上述步骤3)的海豚链球菌悬液腹腔注射步骤2)的C和D组鱼，每条鱼的注射量为lOOul。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目A组，2条；B组，22条；C组，2条；D组，20条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)RPS = IOOx (I-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)故三价DNA疫苗S3D在免疫后一个月和两个月时对海豚链球菌的免疫保护效率分别为91%和90%。由此得出DNA疫苗S3D对海豚链球菌具有非常好的免疫保护效应。
权利要求
1.一种海豚链球菌三价DNA疫苗，其特征在于以海豚链球菌G26为模板分别经引物Fl/Rl、F2/R2和F3/R3进行PCR扩增，产物与载体pCN3质粒连接转化后质粒等体积混合，即为三价DNA疫苗； 所述引物为Fl :5’ -CCCGGGACCACCATGAAAATTATATTAGGACTGC-3 ‘ ；Rl :5’ -CAGACCCGGGATGTTGTTCTTTAAAACTAATCAA-3’ ；F2 :5’ -CCCGGGACCACCATGAGTTTTATCGAGATTCAAA-3 ；R2 :5’ -GTCCCGGGATCTCTTAACTTCTTACCAGT-3’ ；F3 :5’ -CCCGGGACCACCATGAAAATTGGTGTATTAGATAAGGA-3’ ；R3 :5’ -CGTCCCGGGTACTCTAGAAGGCTTTAATAACA-3’。
2.按权利要求I所述的海豚链球菌三价DNA疫苗，其特征在于以海豚链球菌G26为模板分别经引物F1/R1、F2/R2和F3/R3进行PCR扩增，扩增产物分别于用SmaI酶切的质粒PCN3连接，连接液分别转化到大肠杆菌DH5 α后分别在含有100 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基上培养18-24小时，所得转化子等体积混合，即为三价DNA疫苗。
3.—种权利要求I所述的海豚链球菌三价DNA疫苗的构建方法，其特征在于以海豚链球菌G26为模板分别经引物Fl/Rl、F2/R2和F3/R3进行PCR扩增，扩增产物分别于用SmaI酶切的质粒PCN3连接，连接液分别转化到大肠杆菌DH5 α后分别在含有100 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基上培养18-24小时，所得转化子等体积混合，即为三价DNA疫苗； 所述引物为Fl :5’ -CCCGGGACCACCATGAAAATTATATTAGGACTGC-3 ‘ ；Rl :5’ _CAGACCCGGGATGTTGTTCTTTAAAACTAATCAA-3’ ；F2 :5’ -CCCGGGACCACCATGAGTTTTATCGAGATTCAAA-3 ；R2 :5’ -GTCCCGGGATCTCTTAACTTCTTACCAGT-3’ ；F3 :5’ -CCCGGGACCACCATGAAAATTGGTGTATTAGATAAGGA-3’ ；R3 :5’ -CGTCCCGGGTACTCTAGAAGGCTTTAATAACA-3’。
4.权利要求I所述的海豚链球菌三价DNA疫苗的构建方法，其特征在于所述三价DNA疫苗在PBS中稀释至终浓度为150 μ g/ml,即为疫苗制备液。
全文摘要
本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种海豚链球菌三价DNA疫苗及其构建方法。以海豚链球菌G26为模板分别经引物F1/R1、F2/R2和F3/R3进行PCR扩增，产物与载体pCN3质粒连接转化后质粒等体积混合，即为三价DNA疫苗；本发明所得疫苗在免疫后一个月和两个月时对海豚链球菌感染的保护效率高达90％以上。
文档编号A61K39/116GK102716499SQ201210152378
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月16日 优先权日2012年5月16日
发明者孙云, 孙黎, 胡永华 申请人:中国科学院海洋研究所
文档序号 :
【 810020 】
技术研发人员：孙黎,孙云,胡永华
技术所有人：中国科学院海洋研究所
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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技术研发人员：孙黎,孙云,胡永华
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