产生免疫调节细胞之方法、依该方法所制备之细胞及其应用
[0066] 实施例2:制备免疫调节性单核细胞
[0067] 于本发明中，发现间充质干细胞可经由分泌肝细胞生长因子（HGF)而诱发免疫调 节性产生IL-10之⑶14+单核细胞群。该等免疫调节性单核细胞之存在会抑制T细胞增殖， 及改变T细胞之效应物功能，由Thl走向Th2。亦测试HGF与CD14+单核细胞间的交互作用， 且该信号途径系与该免疫调节性单核细胞生成IL-10相关。
[0068] 材料与方法
[0069] 细胞培养
[0070]如实施例1所述方式，分离及培养人类胎盘衍生之间充质干细胞。
[0071] 将得自美国菌种中心（ATCC)之人类组织细胞淋巴瘤细胞株U937及人类T细胞急 性白血病细胞株Jurkat，依其所公开之流程培养。在部分实验中，于重组人类HGF(rhHGF， 购自P印rotech)处理前，以ERK1/2抑制剂U0126 (细胞讯息传导）、p38MAPK抑制剂 SB203580 (购自 Merck)、及 STAT3 抑制剂 cpdl88 (购自 Merck)处理 U937 达 30 分钟。
[0072] 细胞增殖测试
[0073] 以 2. 5uM 之 CFSE (carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester，购 自Gibco-Invitrogen)将细胞于25 °C及0. 1 %之小牛血清蛋白（BSA)下染色10分钟。 以0. 1% BSA洗涤两次后，以RPMI-1640培养基重新溶散该细胞，并于25°C下培养10分 钟。将外周血白细胞、或移除⑶14之外周血白细胞，以人类T细胞活化剂，即，抗-⑶3/ CD28Dynabeads (购自 Gibco-Invitrogen)，或有丝分裂剂 PHA (phytohemagglutinin， 100 y g/ml，购自Sigma-Aldrich)，在间充质干细胞培养基与rhHGF存在或不存在下进行刺 激。另外，将经抗-⑶3/⑶28珠粒刺激之⑶4+T细胞与rhHGF-处理之HLA-错配之⑶4+细 胞以不同比例进行共培养。在72小时后，将以CFSE标记之细胞（5x 105细胞/孔）收集 并以0. 1% BSA洗涤两次。如前述，以FACS进行细胞分裂次数之分析。
[0074] 细胞因子阵列
[0075] 以间充质干细胞培养盘（包括与CD14+细胞共培养或否）所收集之条件培养 基进行分析，藉由人类定量抗体阵列（购自RayBiotech)并依制造商所建议流程测定细 胞因子图谱。简言之，将试膜与阻断缓冲液共置于室温下30分钟，再加入样本共置于室 温下90分钟，接着，在室温下以洗涤缓冲液I洗涤该试膜三次、洗涤缓冲液II洗涤该试 膜两次，每次洗涤为5分钟；与经生物素接合之抗体共置于室温下90分钟。最后，洗涤 该试膜，并与经辣根过氧化氢酶接合之抗生蛋白链菌素在室温下共置2小时，再与检测 缓冲液共置2分钟。以焚光检测仪（GenePix 4000B Microarray Scanner，购自Axon Instruments, Inc.)进行检测，并将数据数字化并进行影像分析（GenePix Pro software， 购自Axon Instruments, Inc.)。藉由消去背景染色、及以同一膜上之阳性对照组标准化后， 可获得相对蛋白质浓度。
[0076] RNA 沉默（silencing)测试
[0077] 间充质干细胞之HGF分泌之RNA沉默测试系利用两种不同HGF-干扰RNA (简 称 HGF siRNA) (Stealth Select RNAi?siRNA，购自 Gibco-Invitrogen)，并依制造商所建 议流程测定，并使用制造商所建议之阴性对照组（StealthTM negative control)。使用 Lipofectamine?RNAiMAX (购自 Gibco-Invitrogen)，并依制造商所建议流程，将 siRNA 转染 间充质干细胞。简言之，将细胞于无血清培养基中培养24小时，添加转染混合物达4-6小 时，并转移至完全培养基，培养3天后，以ELISA检测其培养液以确认于间充质干细胞中之 HGF抑制效果。如前人文献所述方法及依制造商说明书（购自R&D systems)，使用HGF及 IL-10之酶联免疫吸附测定（ELISA)检测条件培养基中由间充质干细胞所产生之HGF、及单 核细胞/细胞株所产生之IL-10。
[0078] 免疫表型测试
[0079] 如前人文献所述方法，将细胞（外周血白细胞、⑶14+细胞、血癌细胞株）进行 不同表面标记表达之染色，并以BD FACSCalibur(购自BD Biosciences)进行分析。除 了抗c-Met之抗体购自eBiosciences以外，其余流式细胞仪分析所用抗体均购自BD Biosciences。各分析均使用适当的FITC-接合及PE-接合之同型免疫球蛋白对照组。
[0080] 胞内细胞因子染色
[0081] 经抗-⑶3/⑶28所刺激之⑶4+T细胞（包括与经HGF处理之⑶14+细胞共培养 与否）所产生的IFN-y、IL-4及IL13,系于培养72小时后测量。将细胞于50μg/ml之 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate，购自 Sigma-Aldrich)、0.745iig/ml 之离子霉素 (购自Sigma-Aldrich)、及4yM之莫能菌素（购自BioLegend)之存在下重新溶散达4-6 小时。接着，将细胞与抗-人类IFN-yFITC(购自BioLegend)、抗-人类IL-4PE(购自 BioLegend)、或抗-人类IL13PE (购自BD Biosciences)于4°C下共置45分钟。并平行使用 FITC-接合及PE-接合之同型免疫球蛋白作为对照组。将细胞洗涤两次、并悬浮于PBS-BSA 以进行FACS分析。
[0082] 重组小鼠HGF之体内测试
[0083] 将小鼠（C57BL/6)以静脉注射注入以150 y 1之PBS稀释之200ng之重组小鼠 HGF(rmHGF，购自P印rotech)。8天后，藉由以PBS灌洗方式，由小鼠股骨取出骨髓细胞；及将 脾脏于4°C下以3-ml注射器头磨碎，再以尼龙筛过滤。将所得细胞悬浮液离心，将红细胞溶 裂，并洗涤所得单细胞悬浮液。以磁珠分离法（auto-MACS)，分别使用⑶45R/B220PE (购自 13;[016区611(1，（310116:狀3-6132)、0090.2?￡(购自613;[08(^61106，（310116:53-2.1)及抗-?￡磁珠， 以去除脾细胞中的B-淋巴细胞及T-淋巴细胞。将细胞悬浮液与抗-小鼠⑶lib PE(购 自 BioLegend)及抗-小鼠 IL10PerCPCy5. 5 (购自 BD Biosciences)共置，并以 FACS 检测。
[0084] RNA分离及反转录-聚合酶链反应（RT-PCR)
[0085] 以Trizol试剂（购自Gibco-Invitrogen)萃取全RNA，并如前人文献所述方法 进行 RT-PCR，使用下列PCR引子：IL-10 之顺向引子为5' -CTGTGAAAACAAGAGCAAGGC-3'、 且反向引子为V-GAAGCTTCTGTTGGCTCCC-3 ^ ;而0 -肌动蛋白（阳性对照组）之顺向 引子为5 ' -TGGCACCACCTTCTACAATGAGC-3'、且反向引子为5 ' -GCACAGCTTCTCCTTAAT GTCACGCHV。每实验为三重复。使用ImageJ软件（NIH)以光密度分析方式，并以肌 动蛋白标准化可获得mRNA相对定量。
[0086] 蛋白质印迹分析
[0087] 如前人文献所述方法自细胞萃取蛋白质。针对ERK1/2、STAT3及a-微管蛋白之 主要抗体系购自 Santa Cruz Biotechnology，而针对 phosph〇-ERKl/2、phospho_STAT3、 p38MAPK、phospho_p38MAPK、Akt、及 phospho-Akt 之主要抗体系购自 Cell Signaling Technologies。
[0088] 统计分析
[0089]以 SPSS 软件（购自 SPSS Inc.，version 19. 0)进行统计分析，以 Student' s t-test用于两群组之间的比对，ANOVA则用于复数群组之间的比对。所有资料均以平均数 土SEM表示，并将统计显著性定义为p〈0. 05。所有实验均为至少三重复。
[0090]实施例2-(1)
[0091] HGF可抑制经抗-⑶3/28-活化之外周血白细胞之增殖
[0092] 如实施例1所示，间充质干细胞展现对T淋巴细胞之强力免疫调节性，其效果系 经由分泌因子所调控。如第7A图所示，该间充质干细胞之条件培养基（MSC-CM)可抑制外 周血白细胞增殖，其会被PHA (会优先刺激单核细胞）活化，或被抗-CD3/28 (会专一刺激T 细胞）活化。与经PHA-刺激之外周血白细胞相较，MSC-CM可对经抗-⑶3/28-刺激之外 周血白细胞展现略强的抑制效果。又，经抗-CD3/28-刺激之外周血白细胞与间充质干细胞 共培养时，其细胞因子图谱会改变，由Thl促炎环境（pro-inflammatory Thlmilieu) -以 IFN-y及TNF-a为代表，转向强化的免疫调节环境（more immunomodulatory milieu) - 以IL-10为代表（第7B图）。
[0093] 在不同细胞因子、趋化激素、及基质相关分子分析（第7C图）中，HGF为MSC-CM中 分泌最大量者。接着，添加rhHGF至经活化之外周血白细胞。令人惊讶的是，rhHGF可抑制 经抗-⑶3/28-活化之外周血白细胞之增殖，但对经PHA-刺激之外周血白细胞则否（第7D 图），表示HGF之免疫抑制作用系针对T细胞。且HGF对外周血白细胞之抑制作用并无剂量 依赖性。又，以siRNA对间充质干细胞之HGF抑制（knockdown)试验，其ELISA检测结果如 第7E图所示。当经抗-CD3/28-活化之外周血白细胞与siHGF-间充质干细胞共培养时，该 免疫抑制效果则降低至明显程度（第7F图）。另外，HGF-siRNA间充质干细胞之培养基可 使对外周血白细胞之增殖抑制作用部分恢复（数据未显示）。该等结果显示，间充质干细胞 所分泌之HGF可抑制经抗-⑶3/28-活
文档序号 :
【 8460339 】
技术研发人员：颜伶汝,刘柯俊,司徒惠康
技术所有人：财团法人卫生研究院
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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