产生免疫调节细胞之方法、依该方法所制备之细胞及其应用
[0039] 实施例1:免疫调节性骨髓衍生的抑制细胞（MDSC)之制备
[0040] 材料与方法
[0041] 细胞培养
[0042]如参考文献（Yen BL et al.，Stem Cells. 2005 ;23(1) :3-9 ;Chang CJ et al.,Stem Cells. 2006 ；24(11):2466-77 ；Liu KJ et al.,Cell Transplant. 2011 ； 20:1721-30)所述之方法，分离并扩增人类胎盘衍生之间充质干细胞（MSC)(来自足月胎盘 之间充质干细胞细胞群）。经机构审议委员会批准并在知情同意情况下，取得来自健康提 供者母体之足月胎盘（38 - 40周孕期）。简言之，间充质干细胞培养于含有10%胎牛血清 (FBS，购自HyClone)之低葡萄糖-DMEM培养基（购自Gibco-Invitrogen)。将间充质干细胞 培养至70%致密度之条件培养基，收集并贮存于-80°C直到测试。经机构审议委员会批准 并在知情同意情况下，随机取得采自健康自愿者之白细胞层之人类外周血淋巴细胞。如先 前所述之方法，利用Ficoll-Paque(1.077g/ml ;Gibc〇-Invitrogen)密度梯度离心分离外 周血白细胞。利用MACS(磁珠细胞分离）⑶14及⑶4分离试剂盒（购自Miltenyi Biotec) 并依照制造商之说明书，自外周血白细胞分别纯化出CD14+及CD4+之T细胞。简言之，将外 周血白细胞与适当的磁珠置于4°C下20分钟，接着以包含1 %之FBS之磷酸盐缓冲食盐水 (PBS)洗涤外周血白细胞与磁珠之复合物，并藉由AutoMACS(Miltenyi Biotec)分成阳性 组分及阴性组分。收集阳性组分，其中⑶14+及⑶4 +之T细胞纯化物经FACS分析证实纯度 高于98 %，并培养于RPMI-1640培养基中。
[0043] 免疫表型分析
[0044] 以BD FACSCalibur流式细胞仪系统（购自BD Biosciences, Mississauga, Canada)进行细胞表面标记分析。除了抗 CD14、CD33 及 CDllb 之抗体系购自 BioLegend，San Diego，CA，USA、抗 ARG1 抗体购自 R&D Systems, Minneapolis, MN, USA、抗 iNOS 抗体购自 Abeam, Cambridge, UK、及抗 c-met 抗体购 自 eBiosciences, San Diego, CA, USA 以外，其余抗体均购自 BD Biosciences。
[0045] 骨髓衍生的抑制细胞之扩增
[0046] 外周血白细胞（PBL)与间充质干细胞或癌症细胞株（比例为10:1)共培养3天，接 着进行⑶14XD1 lb+CD33,估，其亦为用于骨髓衍生的抑制细胞之FACS细胞分离法之细胞 表面标记（利用BD Aria Cell Sorter (购自BD Biosciences)进行）。依照制造商之说明 书（购自Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)，部分实验以磁珠阴性组分筛出 之0)14_细胞取代PBL而进行。将预定剂量之重组人类HGF(rhHGF，购自R&D Systems)加入 外周血白细胞，进行下述PBL细胞分裂之MDSC抑制作用之分析评估。简言之，以2. 5 y mol/ L 焚光染剂 CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester ;购自 Molecular Probes/ Gibco-Invitrogen, Grand Island, NY, USA)标记异体 PBL 达 10 分钟，接着，以抗-CD3/CD28 珠粒（购自Gibco-Invitrogen)刺激。以FACS细胞分离法分离出同构型MSC-扩增之骨髓 衍生的抑制细胞，再与经刺激之异体PBL以不同的作用细胞-标的细胞（E:T)比例共培养 3天。以流式细胞分析法，藉由CFSE染剂强度评估PBL细胞分裂作用。
[0047] HGF分泌作用之定量
[0048] 以细胞培养盘所收集之上清液，利用商业购得之ELISA试剂盒（购自R&D Systems)，依制造商之说明书操作，以测定HGF。
[0049] RNA干扰测试
[0050]利用针对 IL-6 及 HGF 之 siRNA(specific small interfering RNA，购自 Gibco-Invitrogen)并依制造商之说明书进行抑制（knockdown)测试。以ELISA验证siRNA 对于间充质干细胞-分泌因子之抑制效果。
[0051] 体内（invivo)试验
[0052] 所有动物实验均依循机构动物照护及使用委员会所核准之规范进行。C57BL/6小 鼠（4至8周大）均来自台湾实骀动物中心（中国台湾，台北）。由尾静脉注射重组小鼠 HGF(100ng，购自R&D Systems)，于注射3天后将小鼠牺牲。收集外周血、骨髓及脾脏，进行 Grl+CDllb+细胞之流式细胞分析。
[0053] 统计分析
[0054]在上述测试中，以SPSS 18. 0软件（购自SPSS Inc.，Chicago, IL，USA)进行统计 分析，并将统计显著性定义为P〈〇. 05。Student' s t-test用于两群组之间的比对，ANOVA 则用于复数群组之间的比对。
[0055] 实施例1-⑴：间充质干细胞可使来自外周血白细胞之功能性 ⑶14_CDllb+⑶33_骨髓衍生的抑制细胞大量增加
[0056] 先前技术均未报导过关于不同来源之间充质干细胞（MSC)之强烈免疫抑制特性 会与骨髓衍生的抑制细胞（MDSC)扩增相关。骨髓及胎盘之间充质干细胞均具有CD73、 ⑶105及⑶90阳性之表面标记表现，且为造血性标记（包括共刺激分子⑶80及86)阴性之 表现（参照第1A图）。两种间充质干细胞群均可分化为成骨系（osteogenic lineage)、成 软骨系（chondrogenic lineage)、成脂系（adipogenic lineage)，符合多元性间充质干细 胞之原则（参照第1B图）。
[0057] 将间充质干细胞与人类同种异体外周血白细胞共培养，并进行骨髓衍生的抑制细 胞分析，在人类系统之特征系表达⑶33及⑶11b，但不表达⑶14。如第2A、2B图所示，骨 髓及胎盘间充质干细胞均可增加外周血白细胞中的⑶14TDllb+⑶331田胞数量。检测间充 质干细胞-扩增之⑶14TDllb+CD33_细胞（以下有时简称「MSC-诱导之骨髓衍生的抑制细 胞」）之特性及生物学功能，其结果显示于第2C至2F图。藉由共培养，MSC-诱导之骨髓衍 生的抑制细胞具有抑制淋巴细胞增殖之功能，且呈现剂量依赖性（参照第2C图）。MSC-诱 导之骨髓衍生的抑制细胞可表达ARG1及iN0S(参照第2D&2E图），并可于经刺激之外周血 白细胞中诱发大量的⑶4+⑶25 high I；egs(参照第2F图）。据此，MSC-诱导之骨髓衍生的抑制 细胞确实具有多种免疫调节功能。
[0058] 实施例1- (2) :MSC-诱导之骨髓衍生的抑制细胞之扩增系由分泌性HGF所调控
[0059] 如第3A图所示，由间充质干细胞所诱导之骨髓衍生的抑制细胞之扩增，并不受细 胞分隔培养之影响，此暗示了无须细胞-细胞接触，且在此过程中可能关系到分泌性因子。 如第3B图所示之间充质干细胞之上清液分析，间充质干细胞分泌多种基质相关因子，如： RANTES/CCL5、HGF、及IL-6。IL-6已知与骨髓衍生的抑制细胞增殖有关，然而，阻断抗体及 siRNA抑制实验两者均显示，IL-6对于间充质干细胞诱发之骨髓衍生的抑制细胞增殖并无 关联（实验数据未显示于说明书中）。
[0060] 由于间充质干细胞会大量分泌HGF，因此测试并评估此分子是否与间充质干细胞 诱发之骨髓衍生的抑制细胞增殖有关联，如第3C图所示，添加重组HGF可使骨髓衍生的抑 制细胞扩增，且呈现剂量依赖效果，最高至HGF浓度为约30ng/ml，近似于间充质干细胞之 条件培养基中测得之上限（第3B图）。HGF-扩增之骨髓衍生的抑制细胞亦会表达iNOS及 ARG1，且具有抑制性效应物功能（分别参照第3D&3E图）。为确认HGF在间充质干细胞诱发 之骨髓衍生的抑制细胞扩增作用之关联性，利用siRNA对间充质干细胞进行RNA干扰，以抑 制HGF分泌。当有效抑制间充质干细胞之HGF分泌时，间充质干细胞诱发之骨髓衍生的抑 制细胞扩增现象也消失（第3F图）。因此，本实验数据证实间充质干细胞所分泌之HGF系 与骨髓衍生的抑制细胞增殖有关。
[0061] 亦测试来自其它细胞株之HGF，如第4A、4B图所示，由不同细胞株分泌之HGF之量， 系与骨髓衍生的抑制细胞增加之量相关。
[0062] 为了于体内（in vivo)验证上述发现，将重组HGF以静脉注射方式注入野生型 C57BL/6小鼠。3天后，可观察到该等小鼠骨髓中之CDllb+Grl+骨髓衍生的抑制细胞增加 (第4C图），显示HGF可于体内环境扩增骨髓衍生的抑制细胞。
[0063] 实施例1_(3) :HGF诱发之骨髓衍生的抑制细胞扩增，系经由c-met、其受体、及增 加STAT3磷酸化所调控
[0064] 进一步研宄HGF-调控之骨髓衍生的抑制细胞扩增之机制。检测骨髓衍生的抑制 细胞上之c-met(HGF之同源受体）之表达，并发现⑶14_白细胞持续表达低量c-met(第5A 图），且若以中和性抗体阻断⑶14_细胞之c-met，则HGF诱发之骨髓衍生的抑制细胞扩增 现象会消失（第5B图）。再检测骨髓衍生的抑制细胞之HGF-诱发之STAT3磷酸化作用， 以确认HGF/c-met之主要效用系经由STAT3调控。如第5C图所示，添加外源性HGF会诱发 高于基准线之磷酸化STAT3 (pSTAT3)，暗示该途径被活化。于外源性HGF存在下添加STAT3 抑制剂（cpdl88)，该骨髓衍生的抑制细胞中pSTAT3增加的现象会消失，且展现剂量依赖 性（第图）。因此，HGF藉由与其受体c-met结合，其导致STAT3磷酸化增加，进而调控 骨髓衍生的抑制细胞之增生。
[0065] HGF-调控之骨髓衍生的抑制细胞扩增之机制系如第6图所示，HGF(尤其是由间充 质干细胞所分泌者）可使骨髓衍生的抑制细胞增加。从机制上而言，间充质干细胞所诱导 的骨髓衍生的抑制细胞增生系
文档序号 :
【 8460339 】
技术研发人员：颜伶汝,刘柯俊,司徒惠康
技术所有人：财团法人卫生研究院
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：颜伶汝,刘柯俊,司徒惠康
技术所有人：财团法人卫生研究院
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除