促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌的多因子载体exosome的制备及应用
[0048]如图2可知:提取物表达exosome的标志蛋白0)63，0)9，符合exosome蛋白学鉴定;
[0049]如图3A、3B可知:通过nanosight可视化动态追踪exosome并对其大小直径分布的浓度进行测量发现其直径大小聚集在30-100nm大小范围内，符合exosome的形态学鉴定结果。
[0050]本发明第二目的在于提供多基因载体exosome在促进皮肤创伤愈合中的应用。
[0051]本发明第三目的在于提供一种利用人脂肪干细胞分泌的多因子载体exosome制备的溶剂或针剂，采用上述方法提取的多因子载体exosome溶解在磷酸盐缓冲液中制成溶剂或针剂；多因子载体exosome的含量与磷酸盐缓冲液的使用比例为lug: lul ;即在lul磷酸盐缓冲液中加入lug多因子载体exosome。
[0052]本发明第四目的在于提供溶剂或针剂在促进皮肤创伤愈合中的应用。
[0053]实施例1
[0054]脂肪干细胞分泌的exosome可以促进皮肤正常成纤维细胞的迀移增殖和对胶原合成的影响:
[0055](1)、CCK-8增殖实验:将人成纤维细胞以2X 103接种于96孔板，3h后待细胞完全贴壁后，换无血清培养液，分别用不同浓度的exosome (0ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml)以及50 %培养过脂肪干细胞的条件培养液CM对细胞进行处理，每组五个复孔，连续检测五天。分别在1，2，3，4，5天取出96孔板，每孔加入10ul CCK-8溶液，37°C孵育2小时，在酶标仪下检测450nm波长的吸光度值，观察比较每孔细胞的增殖情况。结果发现，exosome随着时间的延长对其增殖有促进作用，且48h作用明显。如图4A、4B所示，图4A所示随着exosome刺激天数的增加，对成纤维细胞FB的增殖增强，且在第二天达到增殖高峰期，第三天开始进入增殖平台期；图4B所示发现在第二天增殖高峰期随着exosome刺激浓度的增加，成纤维细胞的增殖亦增强。
[0056](2)、划痕迀移实验:将饥饿处理24小时的人成纤维细胞以1X105密度接种于6孔板，4h待细胞完全贴壁后，用lOOul枪头做一 “ + ”划痕，弃去原培养液，PBS洗涤两遍后，换无血清培养液，并加入不同浓度的exosome (0ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml)以及50%培养过脂肪干细胞的条件培养液CM，分别在0，6，12，24h时间点显微镜下拍照，计算细胞迀移率。结果发现exosome对FB的迀移在12h开始具有显著的促进作用。如图5A、5B、5C所示，随着exosome刺激浓度的增加，成纤维细胞的迀移能力亦增强。
[0057](3)、RT-PCR胶原合成的影响:将细胞以1 X 105接种于6孔板，无血清培养液饥饿处理24小时后，在培养液中加入不同浓度的exosome (0、25、50、100ug/ml)，分别孵育1，2，3，4，5天后收集细胞，提取RNA，检测不同浓度刺激下，细胞中I型、III型胶原的mRNA表达量。发现exosome对I型胶原(如图6所示)、111型胶原(如图7所示)的合成有抑制作用。如图6可知，随着exosome刺激浓度的增加，I型胶原的mRNA表达量逐渐降低，说明I型胶原合成是逐渐降低的；如图7可知，随着exosome刺激浓度的增加，III型胶原的mRNA表达量逐渐降低，说明III型胶原合成是逐渐降低的。
[0058]实施例2
[0059]脂肪干细胞分泌的exosome可以归巢到皮肤创口周围参与创伤修复作用:
[0060]选取6-8周的选取6-8周龄的BALB/c雄性小鼠构建皮肤创伤模型。将小鼠麻醉后，在小鼠背部靠近尾巴(避开心脏)部位进行消毒，剃毛备皮后，做2cmX 1.5cm大小的全层皮肤伤口。将建好创伤的小鼠随机分为3组exosome实验组，染料阴性对照组，PBS阴性对照组。实验取1ml终浓度为lug/ul的exosome悬液(exosome溶于PBS中)，向悬液中加入lul焚光染料DIR按照的说明书对exosome进行孵育洗涤标记作为exosome实验组，取lul荧光染料溶于1ml的PBS中作为染液阴性对照组，lmlPBS作为另一阴性对照组，所有操作均按照相同步骤避光进行。将小鼠固定，水浴加热小鼠尾巴，让血管充盈，然后三组分别取200ul液体经鼠尾静脉注射。并且在注射后第1，3，7，14，21天通过小鼠活体成像仪对其荧光分布和强度进行检测。结果表明荧光标记的exosome迀移到创口周围参与创伤愈合过程，而染料和PBS的阴性对照组则没有出现在创口周围，排除了非特异性干扰。如图9所示，发现标记的exosome通过鼠尾静脉迀移到创口周围，而作为阴性对照的染料组和PBS组则没有出现在创口周围。
[0061]实施例3
[0062]小鼠皮肤伤口的愈合修复:
[0063](1)、选取6-8周龄的BALB/c雄性小鼠分别在其背部和腹股沟处构建皮肤创伤模型。小鼠常规处理后分别在背部和腹股沟处做1.5cmX0.5cm大小的全层皮肤创口。观察伤口愈合情况以及愈合时间，同时取创伤周围组织做HE染色，以及exosome标志蛋白⑶63的免疫荧光，发现有脂肪层的创口比没有脂肪层的创口愈合快(如图8B所示)，并且有脂肪层的CD63比无脂肪层的表达明显(如图8A所示)。如图8A、8B所示，发现有脂肪层创口愈合比无脂肪层创口愈合快，且exosome标志蛋白表达明显，说明有脂肪层无脂肪层中exosome含量丰富。
[0064](2)、选取6-8周龄的BALB/c雄性小鼠构建皮肤创伤模型。将小鼠麻醉后，对小鼠背部进行消毒、去毛，暴露皮肤，在皮肤上用无菌刀片及剪刀等器械做2cmX 1.5cm大小的全层皮肤伤口。将建好创伤的小鼠随机分为2组:exosome实验组，PBS对照组。根据文献报道，我们选择的exosome的实验浓度为lug/ul。通过鼠尾注射，每天观察不同组小鼠皮肤创伤愈合，并拍照，统计分析愈合时间快慢，发现exosome组比PBS组愈合快。如图10、11所示，如图10所示，发现脂肪干细胞来源的exosome对小鼠皮肤创伤愈合有促进作用；如图11所示，发现注射脂肪干细胞来源的exosome小鼠皮肤创伤愈合时间比阴性对照组PBS组愈合时间短。
[0065]本发明公开的促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌的多因子载exosome的制备及应用，人脂肪干细胞分泌的exosome可以促进皮肤成纤维细胞的迀移和增殖，能够抑制成纤维细胞分泌I型胶原、III型胶原的mRNA表达，能够显著的促进皮肤创伤愈合减少瘢痕形成，帮助患者缩短疗程，提高美观要求，减轻痛苦；其制备的用于治疗皮肤损伤的exosome与脂肪干细胞无关，无任何细胞成分，便于运输和储存；与目前现有的超速离心的方法相比，本发明应用离心结合试剂提取的方法得到的exosome产量更高，纯度更好，可以在冰箱中长期保存并保存活性高达1年以上，可以作为细胞治疗的有效替代品，具有极佳的临床应用价值。
[0066]以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌多因子载体exosome的制备方法，其特征在于，该方法包括: 步骤一、取处于对数生长期的第三代到第六代的人脂肪干细胞，待细胞融合至80 %后，弃去原培养液，用磷酸盐缓冲液冲洗2-3遍后，换无血清培养液培养，24h后收集培养上清液； 步骤二、将步骤一中收集的上清液，在温度4°C、离心力3000g下离心15分钟，离心去除细胞碎片和悬浮细胞，离心后的上清液经0.22um孔径的无菌滤膜过滤得到脂肪干细胞条件培养液； 步骤三、将步骤二中的条件培养液放入分子量为lOOKDa超滤离心管中，在温度4°C、离心力1000g下离心30分钟，离心浓缩，得到含有exosome的浓缩液； 步骤四、将步骤三中的浓缩液与Exoquick-TC试剂按照5:1的体积比混合，震荡混匀后，4°C孵育过夜； 步骤五、孵育过夜后的混合液在温度4°C、离心力1500g下离心30分钟，弃去上清液保留沉淀; 步骤六、在温度4°C、离心力1500g下对沉淀离心5分钟，吸净残余液体后，用磷酸盐缓冲液重悬，经0.22um孔径的无菌滤膜过滤后_80°C保存，即得多因子载体exosome。2.根据权利要求1所述的促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌多因子载体exosome的制备方法，其特征在于，在步骤一中，所述原培养液内各成分的体积为:88 %人脂肪干细胞专用基础培养基、10%胎牛血清、1 %青霉素/链霉素、1 %谷氨酰胺。3.根据权利要求1所述的促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌多因子载体exosome的制备方法，其特征在于，在步骤一中，所述无血清培养液内各成分的体积为:98%人脂肪干细胞专用基础培养基、1 %青霉素/链霉素、1 %谷氨酰胺。4.根据权利要求1?3中任一权利要求所述的多因子载体exosome的应用，其特征在于，所述多基因载体exosome在促进皮肤创伤愈合中的应用。5.一种利用人脂肪干细胞分泌的多因子载体exosome制备的溶剂或针剂，其特征在于，包括权利要求1所述的多因子载体exosome ;所述多因子载体溶解在磷酸盐缓冲液中制成溶剂或针剂；所述多因子载体exosome的含量与磷酸盐缓冲液的使用比例为lug:lul。6.根据权利要求5所述的利用人脂肪干细胞分泌的多因子载体exosome制备的溶剂或针剂，其特征在于， 所述磷酸盐缓冲液的pH为7.2?7.4，磷酸盐缓冲液中各成分的含量为NaCl137mmol/L, KC1 2.7mmol/L, Na2HP0410mmol/L，KH2P042mmol/Lo7.根据权利要求5?6中任一项权利要求所述的溶剂或针剂的应用，其特征在于，所述溶剂或针剂在促进皮肤创伤愈合中的应用。
【专利摘要】本发明公开了促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌的多因子载体exosome的制备及应用，经过原培养基培养、无血清培养基培养、离心浓缩、添加Exoquick-TC试剂、孵育过夜、离心、重悬、过滤，制得多因子载体exosome。本发明制备的exosome与脂肪干细胞无关，无任何细胞成分，便于运输和储存；应用离心结合试剂提取的方法得到的exosome产量更高，纯度更好，可以在冰箱中长期保存，可以作为细胞治疗的有效替代品，具有极佳的临床应用价值。
【IPC分类】C12N5/071, A61K9/08, A61P17/02, A61K35/12
【公开号】CN105296419
【申请号】CN201510859257
【发明人】陈莉莉, 胡丽, 王娟, 赵佳佳, 周鑫, 熊泽欢
【申请人】华中科技大学同济医学院附属协和医院
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月30日
文档序号 :
【 9541087 】
技术研发人员：陈莉莉,胡丽,王娟,赵佳佳,周鑫,熊泽欢
技术所有人：华中科技大学同济医学院附属协和医院
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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