产生免疫调节细胞之方法、依该方法所制备之细胞及其应用
【专利说明】产生免疫调节细胞之方法、依该方法所制备之细胞及其应 用
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年9月10日提交的美国申请13/607976的优先权。以磁盘提交 的序列表
[0003] 序列表是依照37C. F. R § 1. 823 (a)以纸件形式提交的说明书的一部分。
【背景技术】
[0004] 本发明关于一种制备具有特定功能之细胞之方法，特别系关于一种制备免疫调节 细胞（immunomodulatory cells)之方法。
[0005] 自体免疫疾病系由不正常的免疫反应所致，此种免疫反应会针对正常存在于人体 中之物质或组织；换言之，免疫系统将身体某部分误认为病原体并因而攻击自身细胞。移植 物排斥则是不欲之免疫反应所造成的另一个问题，所谓移植，系将细胞、组织或器官由一处 移往另一处之行为。虽然移植已成为一种例行的医疗手段，但免疫系统仍然是最难以克服 的障碍。
[0006] 免疫抑制药物可降低免疫反应，通常可用于治疗/预防自体免疫疾病及移植物排 斥。免疫抑制药物会伴随不同的副作用，包括抑制整体免疫系统、造成患者易受感染等。生 物制剂亦可用于该治疗，包括例如抗细胞因子疗法（anti-cytokine therapy)、T细胞清除 疗法、B细胞清除疗法、及耐受性诱发疗法。近来，细胞疗法（例如被动给予T细胞（adoptive T-cell)或干细胞）成为治疗或预防自体免疫疾病及移植物排斥之新选择，但此疗法仍在 发展中。
[0007] 人类间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC)为一种多元性前体细 胞（multilineage progenitor cells)之细胞群，具有分化成多种间充质细胞系之能 力。间充质干细胞可由骨髓及其它几种器官，例如脂肪组织、胎盘、羊水、及胎儿组织， 如胎儿的肺及血液，分离出。由于间充质干细胞易于分离、且已报导可分化成中胚层 之外（extra-mesodermal)的细胞类型，因此使得此种出生后前体细胞（post-natal progenitors)成为多种疾病之细胞疗法之热门选择。
[0008] 除了多元性分化能力以外，骨髓及胎儿之间充质干细胞已被报导具有免疫调节效 果。此项功能牵涉到调控T细胞、B细胞、单核细胞衍生之树突细胞（DC)、及天然杀伤淋巴 细胞（NK)之增殖能力及效应功能。人类间充质干细胞对免疫细胞的效用，主要经由非细胞 接触过程而进行调控，但确切机制仍为未知。
[0009] 日渐增多的研宄显示了免疫调节性免疫细胞的重要性。直到最近才知道有许多 白细胞亚群可产生免疫抑制效果，包括调节性T淋巴细胞、II型巨噬细胞、及未成熟树突细 胞。然而，几乎没有针对调节性单核细胞之资料。
[0010] 肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，以下有时简称HGF)已知为有丝分 裂促进剂，且为发展上重要的分子。亦已知为细胞扩散因子（scatter factor)，HGF不仅提 供强力生长讯号，亦可诱导细胞迀移，因此，HGF在癌细胞生长及扩散的角色已被充分研宄； 但关于HGF在非有丝分裂之功效上则所知不多。HGF由中叶细胞分泌，并主要作用于上皮细 胞及内皮细胞，但亦可作用于造血性前体细胞。HGF已被显示在胚胎器官发展、成人器官再 生、及伤口愈合上扮演重要角色。HGF及TGF-0已被报导可于混合淋巴细胞反应中作为抑 制T细胞增殖之调控者，此可藉由给予针对HGF及TGF-0之中和性抗体后，T细胞增殖作用 会重新恢复而证明Nicola et al.，Blood 2002;99:3838-3843)。然而，也有报告显示 了不同结论，该等因子系与间充质干细胞对于T细胞受有丝分裂促进剂刺激之抑制作用无 关，因而提出与前述不同的刺激物依赖性机制（Le Blanc et al.，Scand J Immunol 2004; 60:307-315 ;Rasmusson I et al.，Exp Cell Res 2005;305:33-41)。综上述，HGF 与免疫 系统间的功能及交互作用仍为未知。
【发明内容】
[0011] 本发明系提供一种产生免疫调节细胞之方法，包括：以肝细胞生长因子（HGF)处 理外周单个核细胞（peripheral mononuclear cell)，以诱发该外周单个核细胞分化成免 疫调节性白细胞（immunomodulatory leukocyte)。
[0012] 本发明亦提供一种以前述方法所制备之免疫调节细胞。
[0013] 本发明另提供一种治疗由异常免疫反应所致疾病之方法，包括：对患有该疾病之 患者施用肝细胞生长因子（HGF);诱发该患者之外周单个核细胞分化成免疫调节性白细 胞；及调节该异常免疫反应。
【附图说明】
[0014] 第1图显示骨髓间充质干细胞（BM-MSC)及胎盘衍生间充质干细胞（P-MSC)之 特征，第1A图：表面标记；第1B图：BM-MSC及P-MSC之三谱系分化表型，Osteo :成骨系、 Chondro :成软骨系、Adipo :成脂系；比例尺：200mm。
[0015] 第2图系显示在异体外周血白细胞（PBLs)中，间充质干细胞扩增了功能性 ⑶14XD1 lb+⑶33+骨髓衍生的抑制细胞（MDSC)数量。第2A图：藉由间充质干细胞， CD14XDllb+CD33+细胞自外周血白细胞中增加，同种异体之外周血白细胞（30位提供者） 单独培养或与间充质干细胞共培养（BM-间充质干细胞及P-间充质干细胞各有三位提 供者）。第2B图：外周血白细胞之⑶llb+或⑶14TDllb+CD33+细胞与间充质干细胞共 培养后之定量百分比，与外周血白细胞单独培养相比较之P〈〇. 05。第2C图：间充质干 细胞诱发之骨髓衍生的抑制细胞之抑制功能，同种异体外周血白细胞（T，标的细胞）以 CFSE(carboxyfluorescein succinimidyl ester)染色以评估细胞分裂，并在添加或不添 加间充质干细胞扩增之骨髓衍生的抑制细胞（E，作用细胞）下，以抗-CD3/28(a-CD3/28)刺 激，其中该添加以不同E:T比例进行。以流式细胞分析评估PBL细胞分裂，右图为量化结果， p〈0. 05。第2D图：诱导型一氧化氮合酶（iNOS)之表达，第2E图：MSC-扩增之骨髓衍生的 抑制细胞之精氨酸酶-1 (ARG1)之表达，由PBL负面选择CDlf细胞，单独培养或与间充质 干细胞共培养，进一步以⑶11b、⑶33、及iNOS(第2D图）或ARG1(第2E图）染色。第2F 图：藉由MSC-扩增之骨髓衍生的抑制细胞而增加⑶4+⑶25 mgh调控性T细胞（T ,egs)，将表现 ⑶14_CDllb+⑶33+之MSC-扩增之骨髓衍生的抑制细胞分出（FACS)，并与经抗-⑶3/28刺 激之异体PBL以不同比例共培养，并评估高表现CD4+CD25之T细胞之诱导作用，右图为量 化结果，与PBL/a-CD3/28相较之p〈0. 05。
[0016] 第3图显示骨髓衍生的抑制细胞之间充质干细胞扩增作用系经由分泌之肝细胞 生长因子（HGF)所调控。第3A图：骨髓衍生的抑制细胞受间充质干细胞诱发之扩增作用系 经分泌因子所调控。异体PBL与间充质干细胞共培养，无论是直接接触（MSC)或由培养盘 分隔（TW)者，均产生⑶14TDllb+⑶33+骨髓衍生的抑制细胞之扩增作用；*，p〈0.05与PBL 单独培养者比较；n. s.:不显著。第3B图：以细胞因子定量阵列分析间充质干细胞之高量分 泌因子；IL :间白素、LAP :潜伏型胜肽、SDF :基质衍生因子。第3C图：添加外源性重组HGF 至PBL可增加骨髓衍生的抑制细胞数量（*，p〈0. 05线性趋势）。第3D图：经HGF-扩增之 骨髓衍生的抑制细胞中iNOS (上行）及ARG1 (下行）表达之测试。第3E图：经HGF-扩增 之骨髓衍生的抑制细胞对于经抗-CD3/28刺激之PBL增殖之抑制作用，以CFSE对细胞分裂 进行染色，并以流式细胞仪分析。第3F图：以HGF专一性小片段干扰RNA(siRNA)抑制间充 质干细胞之HGF分泌，会使骨髓衍生的抑制细胞扩增作用消失。异体外周血白细胞与间充 质干细胞（来自3位提供者）共培养，并经无标的小片段干扰RNA (siRNA Ctrl)或HGF专 一性siRNA(siHGF)转染，并进行⑶14TDllb+CD33+细胞之评估；*，p〈0. 05与间充质干细胞 (左图）或PBL单独培养（右图）相较。
[0017] 第4图显示癌细胞分泌之HGF及小鼠体内施用HGF可增加骨髓衍生的抑制细胞之 数量。第4A图：间充质干细胞所分泌之HGF之量，MG63 (骨肉瘤细胞系）、胚胎干细胞衍生 之间充质前体细胞（EMP)、及JEG-3(绒毛膜癌细胞系）；第4B图：四种细胞类型及PBL共培 养后之骨髓衍生的抑制细胞之倍数增生；*，P〈〇. 05线性趋势。第4C图：将重组HGF(lOOng) 以尾静脉注射至C57BL/6小鼠，并于注射后一天及三天评估其外周血、脾脏及骨髓中之 CDllb+Grl+细胞；*，p〈0. 05 与 PBS 相较。
[0018] 第5图显示由HGF扩增之骨髓衍生的抑制细胞经其受体c-met及增加STAT3磷酸 化所调控。第5A图：以流式细胞仪分析骨髓衍生的抑制细胞上之c-met表达（12位提供 者），并提供量化之平均荧光强度（MFI)之图表；*，p〈0. 05与同型免疫球蛋白对照组相较 (Ctrl)。第5B图：c-met与HGF调控之骨髓衍生的抑制细胞扩增之关联。以同型免疫球蛋 白（IsoAb)或c-met阻断抗体（anti-c-Met)阻断外周血白细胞，以重组HGF(20ng/ml)处 理，并评估CD14TDllb+CD33+细胞之增加。第5C图：STAT3与HGF调控之骨髓衍生的抑制细 胞扩增之关联。将重组HGF (20ng/ml)添加至⑶14_白细胞中，并对⑶1 lb、⑶33、及经磷酸化 之STAT3 (pSTAT3)进行染色，以流式细胞仪评估（右上角数值为MFI)，一并提供量化之MFI 之图表；*，p〈0. 05线性趋势。第?图：将重组HGF(20ng/ml)及不同剂量之cpdl88(STAT3 抑制剂）添加至PBL中，并对⑶11b、⑶33、及经磷酸化之STAT3 (pSTAT3)进行染色，以流式 细胞仪评估，一并提供量化之⑶14TD1 lb+CD33+pSTAT3+细胞所占比例；a，p〈0. 05与PBL单 独培养相较；b，p〈0. 05线性趋势。
[0019] 第6图显示HGF所调控之骨髓衍生的抑制细胞扩增之机制。
[0020] 第7图显示胎盘衍生之间充质干细胞所分泌之HGF对于经抗-⑶3/28-活化之同 种异体外周血白细胞增殖之抑制作用。第7A图：外周血白细胞，单独培养（
文档序号 :
【 8460339 】
技术研发人员：颜伶汝,刘柯俊,司徒惠康
技术所有人：财团法人卫生研究院
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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