筛选多能干细胞生长促进因子的方法
[0044] 本发明涉及一种通过使用饲养细胞条件化无血清培养基制备适于多能干细胞在 无饲养培养中生长的培养基的方法。
[0045] 在本发明上下文中使用的术语"多能干细胞"指具有多能性（多能性）的细胞， 其通过体外培养能够分化成构成生命体的任意类型的细胞和能够无限增殖（生长）但同 时保持多能性。在本发明中生长的多能干细胞的特定示例包括但不限于胚胎干细胞（ES 细胞）、胎儿原始生殖细胞来源的多能干细胞（EG细胞；ShamblottM.J.等，Proc.Natl. Acad.Sci.，U.S.A.，（1998)95,ρρ· 13726-13731)、睾丸来源的多能干细胞（GS细胞；Conrad S.，Nature, (2008) 456,pp. 344-349)和体细胞来源的诱导型多能干细胞（iPS细胞）。在 本发明中生长的多能干细胞特别优选ES细胞或iPS细胞。ES细胞是来源于从在称为囊 胚的早期胚胎中的内细胞团获得的未分化细胞的培养细胞。iPS细胞是通过将重编程因 子引入体细胞以便将体细胞重编程为非分化状态从而赋予其多能性制备的培养细胞。可 以使用Oct家族基因（例如0ct3/4)、Klf家族基因（例如Klf4)、Myc家族基因（例如 c-Myc)和/或Sox家族基因（例如Sox2)作为重编程因子。多能干细胞可以来源于任意 动物物种。例如多能干细胞可以来源于哺乳动物细胞，包括啮齿动物如小鼠、大鼠和仓鼠， 灵长类如人、大猩猩和黑猩猩，以及家畜或宠物如犬、猫、家兔、牛、马、绵羊或山羊；并且特 别优选来源于人的多能干细胞。多能干细胞，包括ES细胞和iPS细胞，可以是商购获得 或提供的细胞，或者是新建立的细胞。或者，可以将刺激触发采集的多能（STAP)细胞作为 多能干细胞。STAP细胞是通过向动物细胞施加强烈的外部刺激（应激）制备的多能细胞 (Nature, 505, 641-647,（2014))〇
[0046] 在本发明中，对含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠但不含血清 和血清替代物的无血清培养基进行条件化。在本发明中使用的术语"血清"指来源于任 意动物（例如人、牛、马或山羊）的血清。术语"血清替代物"指在ES或iPS细胞培养中 作为血清（例如FBS)的替代用于维持细胞的非分化状态和其培养的试剂。血清替代物 的示例包括KNOCKOUT?SR(KnockOut?血清替代物或KSR;Gibco)、StemSure血清替代 物（SSR;WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)和N-2 添加物（WakoPureChemical Industries，Ltd.)。可以使用不含血清和血清替代物的用于动物细胞培养的任意液体培养 基作为基础培养基制备无血清培养基。可以使用的基础培养基的示例包括，但不特别地限 于BME培养基、BGJb培养基、CMRL1066培养基、GlasgowMEM培养基、改良的MEM锌选择培养 基、Iscove改良的Dulbecco培养基（n?M)、培养基199、EagleMEM培养基、αMEM培养基、 Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM)、HamF10培养基、HamF12培养基、RPMI1640培养 基、Fischer培养基以及这些培养基任意组合的混合物（例如DMEM/F12培养基（Dulbecco 改良的Eagle培养基/营养混合物F-12Ham))。当使用此类基础培养基制备无血清培养基 时，可以在所述基础培养基中添加L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠。
[0047] 或者，可以使用不含有血清或血清替代物的液体培养基制备无血清培养基，其中 已事先添加了L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠中的至少一种。在这种情况 下，可以将不包含在L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠中的在制备得到的培养 基中不含的成分加入所述培养基中以制备无血清培养基。或者，可以将L-抗坏血酸、胰岛 素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠（但是其还包含在上述制备得到的培养基中含有的成分）加 入所述培养基中以制备无血清培养基。例如，可以使用无血清来源的成分并且添加了胰岛 素和转铁蛋白的培养基，包括CHO-S-SFMII(GibcoBRL)、杂交瘤-SFM(GibcoBRL)、eRDF 干粉培养基（GibcoBRL)、UltraCULTURE?(BioWhittaker)、UltraDOMA?(BioWhittaker)、 UltraCHO?(BioWhittaker)和UltraMDCK?(BioWhittaker)。而且，优选地可以使用 STEMPRO*hESCSFM(LifeTechnologies)、mTeSRl(Veritas)和TeSR2 (Veritas)。优选地 可以使用具有非常有限的蛋白成分的基础8?培养基（LifeTechnologies)。
[0048] 上文所述的无血清培养基的优选示例是具有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒 和碳酸氢钠的DMEM/F12培养基。
[0049] 在本发明中用于制备无血清培养基的培养基可以含有脂肪酸、胶原前体、微量元 素、2-巯基乙醇、3'-硫醇甘油或其任意等效物。然而，生长因子之外的蛋白成分的含量优 选地要尽可能的低。在本发明的一个实施方式中，所述无血清培养基优选地不含白蛋白。这 是因为尽管在无血清培养基中通常加入白蛋白，但是其能够导致批与批之间显著的质量差 异，因而是不利的。在本发明的一个实施方式中，用于制备无血清培养基的培养基组分优选 地是已知的。当从条件培养基中筛选多能干细胞的生长促进因子时，例如所述培养基组分 是已知的是优选的。
[0050] 当制备无血清培养基时，可以将L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠以 溶液、衍生物、盐、试剂混合物等的任意形式加入用于动物细胞培养的培养基中。例如，可以 将L-抗坏血酸以衍生物如抗坏血酸基-2-磷酸镁的形式加入培养基。可以以硒盐（例如 硒酸钠）的形式将硒加入培养基中。胰岛素和转铁蛋白可以分离自动物（优选地人、小鼠、 大鼠、牛、马或山羊）的组织、血清等并且因此是天然存在的，或者胰岛素和转铁蛋白可以 是基因工程重组蛋白。可以将胰岛素、转铁蛋白和硒以试剂ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒） 的形式加入培养基中。ITS是用于细胞生长促进的含有胰岛素、转铁蛋白和硒酸钠的添加 剂。
[0051] 在本发明中待条件化的无血清培养基可以含有脂肪酸或脂质、氨基酸（例如非 必需氨基酸）、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧剂、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂、无机盐 等。例如，当所述无血清培养基含有2-巯基乙醇时，其浓度是不限的，只要所述培养基在 此浓度下适于干细胞培养即可，但是例如其可以是约0. 05至1.OmM，并且优选地约0. 1至 0. 5mM〇
[0052] 在本发明中，所述培养基是通过在上述无血清培养基中培养饲养细胞条件化的。 优选地，首先使用丝裂霉素或γ-射线照射处理饲养细胞以灭活有丝分裂，然后用于条件 化。在本发明中使用的饲养细胞是能够在饲养细胞层上（饲养培养）进行多能干细胞培养 的细胞。饲养细胞可以是来源于哺乳动物如人、小鼠、大鼠或牛胚胎或组织的成纤维细胞、 胎盘细胞、骨髓细胞、子宫内膜细胞或其他细胞。饲养细胞的特定示例包括但不限于小鼠胚 胎成纤维细胞（即MEF和ST0细胞系）和ST0细胞的衍生细胞系（例如稳定地引入新霉素 抗性基因表达载体和LIF表达载体的SNL细胞）。
[0053] 使用饲养细胞条件化的无血清培养基可以含有或不含生长因子。无论所述无血清 培养基中是否含有生长因子，在条件化过程中不是必需向所述无血清培养基中加入生长因 子。然而，当所述无血清培养基中不含生长因子时，优选添加了生长因子的无血清培养基是 优选的并且用于条件化。所述无血清培养基优选地含有但不限于选自下组的至少一种作为 生长因子：FGF2(碱性成纤维生长因子）、TGF-0 1(转化生长因子-β 1)、MCP-1、IL-6、PAI、PEDF、IGFBP-2、LIF和IGFBP-7;以及例如FGF2和 / 或TGF- β 1。FGF2和TGF- β 1是特别 优选的生长因子。
[0054] 可以通过培养用于生长的饲养细胞，使用上文所述的无血清培养基更换培养瓶中 的培养基并且培养其中的饲养细胞实现使用饲养细胞使培养基条件化。可以通过常规技术 实现饲养细胞的培养。在所述无血清培养基中的条件化培养可以在4°C至45°C下（例如 25°C至40°C)进行1至72小时（例如8至36小时）实现。所述培养还优选地在4%至 10%C02下实现（例如5%C02)。
[0055] 对培养容器没有特别地限制，只要其能够用于细胞培养即可。其示例包括瓶、组织 培养瓶、皿、皮氏皿、培养皿、多重皿、微量板、微孔板、多重板、多孔板、分室玻片、板、试管、 托盘、培养袋、摇瓶和中空纤维培养容器。
[0056] 在上文所述的方法中，可以在无血清培养基中培养饲养细胞以使得饲养细胞将生 长促进因子等分泌至所述培养基中，从而使所述无血清培养基条件化。可以采用常规技术 从饲养细胞中分离和回收所得到的条件培养基。可以通过过滤和/或离心例如1，OOOrpm 离心5分钟并且回收所分离的液体培养基将液体培养基与饲养细胞分离进行条件培养基 的回收。在所述条件培养基回收后，可以在无血清培养基中重复进行条件培养（例如2至 10 次）。
[0057] 作为所述条件培养基制备程序的特定示例，可以通过培养单层MEF至融合，使用 10 μ g/ml丝裂霉素C处理培养的细胞，使用细胞分离液如胰酶-EDTA分离所述细胞，以3至 5x 105个细胞每60-_平皿的细胞密度将回收的MEF接种于培养皿中，培养1至2天，使用 上文所述的无血清培养基更换培养皿中的培养基并且在此后每24小时回收一次液体培养 基制备条件培养基。
[0058] 所得到的条件培养基可能适用于作为多能干细胞培养的培养基，并且特别优选地 用于无饲养、无血清和无血清替代物培养。在本发明中，"无饲养、无血清和无血清替代物培 养"的表达指在无饲养细胞层条件下（即无饲养培养）和在不含血清和不含血清替代物的 培养基条件下进行的培养。当在培养基中使用的生长因子或培养基成分不含用于多能干细 胞的外源性成分时，此类培养基可以特别优选地作为无外源性成分培养基（即无外源性培 养基）。本发明还涉及制备用于多能干细胞培养的条件培养基的此类方法和通过此类方法 获得的用于多能干细胞培养的条件培养基。
[0059] 根据本发明，这样制备的条件培养基可以用于进行多能干细胞的无饲养培养。使 用所述条件培养基，多能干细胞在无饲养培养中的生长能力能够显著改善。即，本发明涉及 一种使多能干细胞生长的方法，所述方法包括在上述条件培养基中对多能干细
文档序号 :
【 9602122 】
技术研发人员：加藤智久,金村米博,正札智子,福角勇人
技术所有人：株式会社钟化,独立行政法人国立病院机构
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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