一种嵌合抗原受体脂肪干细胞及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及肿瘤治疗领域，尤其涉及一种嵌合抗原受体脂肪干细胞及其制备方法。
【背景技术】
[0002]肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病之一。在我国，肿瘤极大地威胁着人民的生命健康，极大地降低了肿瘤患者的生活质量，同时肿瘤也给家庭和社会造成了巨大的负担。因此，寻找有效的肿瘤治疗方法，彻底攻克肿瘤是世界医学界的重要研究课题。
[0003]肿瘤免疫疗法是当前肿瘤治疗领域最具前景研究方向之一，是近年来一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗新型方法。初步的临床试验结果表明其治疗效率非常高，各大药企纷纷寻求与其他公司合作研发肿瘤免疫相关治疗方法。而传统的三大主要治疗手段即手术治疗、化疗、放疗虽然是全球肿瘤治疗的基本手段方法，然而其治疗效果有限。手术治疗虽然可以切除较大体积的肿瘤，然而对于体积较小以及肿瘤转移之后的小型病灶无法达到切除的目的。化疗是利用化学药物杀死肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞的生长繁殖的一种治疗方式，然而，对大多数肿瘤的治疗的有效性较低，特别对中晚期肿瘤患者，治疗效果有限，并且化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，也将正常细胞和免疫细胞一同杀灭，导致病患者免疫能力和身体机能下降，生活质量降低。放疗是用放射线照射癌组织，以抑制和杀灭癌细胞的一种治疗方法，然而，放疗对癌细胞和正常细胞没有分辨能力，多次放疗后，患者会产生一系列毒副作用和反应，对治疗肿瘤效果非常有限。因此，随着肿瘤免疫学理论和技术的发展，免疫细胞治疗在肿瘤治疗中的作用日益受到重视。肿瘤生物治疗是继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术，具有极其光明的应用前景。
[0004]目前，免疫肿瘤疗法最热门、最有效果的疗法是基于嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cells, CART)疗法。CART免疫疗法的基本原理是首先分离患者的T细胞，然后利用基因工程改造这种T细胞，即通过逆转录病毒和慢病毒载体给T细胞加入一个能识别肿瘤细胞，并且同时激活T细胞杀死肿瘤细胞的嵌合抗体。然后将这些T细胞进行体外扩增后回输到患者体内，使免疫细胞具有特异性识别和杀伤肿瘤的能力。
[0005]嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)主要由三部分组成，位于细胞外的抗原结合区scFv，跨膜区以及胞内信号转导结构域组成。其中，根据胞内信号转导结构域的研究发展，CAR从第一代发展到目前第三代。第一代CART仅含有一个信号单元，大多来自于⑶3ζ。第二代CART是在第一代CART的胞内信号转导结构域基础之上增加了一个共刺激结构域，比如CD28、0X40或者4-1ΒΒ。第三代CART是在第二代CART的胞内信号转导结构域基础之上再增加一个共刺激结构域，因此具有两个共刺激结构域，能够进一步提高CART的扩增倍数以及在体内存活的时间，提升肿瘤治疗效果。
[0006]尽管目前嵌合抗原受体结合T细胞在治疗一些肿瘤方面取得了非常重大的突破，然而，也存在一些致命缺陷。比如“免疫风暴”反应，这主要是由于T细胞被过度激活，从而引起全身性的激烈的免疫反应，会造成输入CART的患者死亡。另外，逆转录病毒或者慢病毒也不容易感染T细胞，这会造成表达目的嵌合抗原受体的T细胞数量较少，达不到治疗肿瘤的良好效果。并且，T细胞具有个体特异性，每个患者只能够扩增自己的T细胞，而不能够异体移植T细胞，因为会产生免疫排斥，然而肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者免疫系统已经遭到巨大的破坏，分离的T细胞活性不高，不容易在短时间内大规模扩增，因而最终CART的治疗效果大打折扣。
[0007]因此，现有技术还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0008]鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种嵌合抗原受体脂肪干细胞及其制备方法，旨在解决现有嵌合抗原受体T细胞治疗肿瘤容易产生“免疫风暴”、病毒感染效率低以及异体移植产生免疫排斥的问题。
[0009]本发明的技术方案如下:
一种嵌合抗原受体脂肪干细胞，其中，所述嵌合抗原受体脂肪干细胞由嵌合抗原受体、脂肪干细胞和肿瘤杀伤因子组成。
[0010]所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其中，所述嵌合抗原受体由SCFv抗原结合序列、跨膜序列及胞内信号转导序列组成。
[0011]所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其中，所述SCFv抗原结合序列包括轻链可变区序列和重链可变区序列。
[0012]所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其中，所述scFv抗原结合序列包括轻链可变区序列、重链可变区序列、连接轻链可变区序列和重链可变区序列的优化联结区序列及位于轻链可变区序列之前的可溶信号肽序列。
[0013]所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其中，所述scFv抗原结合序列为CEA、cMet、EGFRvII1、FAP、Her2、GD2、PSMA、Mesothelin 和 NCAM 中的一种。
[0014]所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其中，所述scFv抗原结合序列和跨膜序列之间包含一段Hinge序列。
[0015]所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其中，所述跨膜序列为CD8。
[0016]所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其中，所述胞内信号转导序列包括CD28胞内结构域序列、4-1BB胞内结构域序列和CD3G胞内结构域序列。
[0017]所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其中，所述肿瘤杀伤因子为TRAIL基因、TNF-α基因及TNF家族具有肿瘤杀伤作用的基因、具有肿瘤杀伤作用的microRNA分子以及具有肿瘤杀伤作用的蛋白因子中的一种。
[0018]—种如上任一所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞的制备方法，其中，包括步骤:
A、首先合成针对脂肪干细胞的嵌合抗原受体序列，并合成能够分泌到胞外的肿瘤杀伤因子序列；
B、然后将上述嵌合抗原受体序列和肿瘤杀伤因子序列分别构建到慢病毒载体上，得到表达嵌合抗原受体或者肿瘤杀伤因子的慢病毒；
C、将表达嵌合抗原受体或者肿瘤杀伤因子的慢病毒感染脂肪干细胞，慢病毒感染完成之后，得到分泌表达肿瘤杀伤因子的嵌合抗原受体脂肪干细胞。
[0019]有益效果:本发明结合了嵌合抗原受体特异性地结合特异肿瘤类型的高靶向性特点，以及脂肪干细胞免疫原性低、容易被病毒感染、能在短时间内大规模扩增以及肿瘤杀伤因子的抗肿瘤作用，能够解决当前CART治疗肿瘤的多个包括“免疫风暴”、嵌合抗原表达效率低以及异体移植免疫排斥等难以解决的问题，进而提高了治疗肿瘤的效果。
【附图说明】
[0020]图1为本发明的第三代CAR的组成示意图。
[0021 ] 图2为本发明的CAR-Trunc-FGFRl的组成示意图。
[0022]图3为本发明实施例1中第三代CAR、脂肪干细胞以及TRAIL共表达及体外大规模扩增之后输入人体治疗肿瘤的流程示意图。
[0023 ]图4为本发明实施例2中CAR-Trunc-FGFRl、脂肪干细胞以及TRAIL共表达及体外大规模扩增之后输入人体治疗肿瘤的流程示意图。
[0024]图5为本发明实施例3中第三代CAR、脂肪干细胞以及TNF-α共表达及体外大规模扩增之后输入人体治疗肿瘤的流程示意图。
[0025]图6为本发明实施例4中CAR-Trunc-FGFRl、脂肪干细胞以及TNF-a共表达及体外大规模扩增之后输入人体治疗肿瘤的流程示意图。
[0026]图7为本发明实施例5中第三代CAR、脂肪干细胞以及microRNA-ΙΟ?共表达及体外大规模扩增之后输入人体治疗肿瘤的流程示意图。
[0027]图8为本发明实施例6中CAR-Trunc-FGFRl、脂肪干细胞以及microRNA_101共表达及体外大规模扩增之后输入人体治疗肿瘤的流程示意图。
【具体实施方式】
[0028]本发明提供一种嵌合抗原受体脂肪干细胞及其制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0029]本发明提供一种嵌合抗原受体脂肪干细胞，其中，所述嵌合抗原受体脂肪干细胞由嵌合抗原受体、脂肪干细胞和肿瘤杀伤因子组成。
[0030]本发明选择脂肪干细胞来作为承载嵌合抗原受体靶向治疗肿瘤的载体，其比T细胞作为嵌合抗原受体的载体治疗肿瘤更加具有优势，这是因为脂肪干细胞来源广泛、易于分离、取材方便、给患者带来的痛苦较小、免疫原性极低并且不涉及道德伦理问题等优点而日益受到研究者的重视，在临床上治疗疾病有着广泛的应用前景。
[0031]本发明中采用的脂肪干细胞在临床治疗疾病方面已经有比较成熟、广泛的应用。例如，脂肪干细胞可以作为种子细胞;脂肪干细胞分泌多种因子可支持造血;脂肪干细胞可以调节免疫系统。尤其重要的是，脂肪干细胞还可以作为基因工程载体。带有目的基因的病毒直接用于基因治疗时，因体内的抗病毒效应以及病毒的整合性，往往达不到理想的基因治疗效果，用脂肪干细胞作为基因治疗载体后可以大大降低病毒感染对体内细胞组织的直接损伤，而且脂肪干细胞本身可以分泌一些营养因子，从而更加有助于组织缺陷的康复。
[0032]本发明所述嵌合抗原受体脂肪干细胞还包括肿瘤杀伤因子，所述肿瘤杀伤因子为TRAIL基因(又名TNFSF10)、TNF-a基因及TNF家族具有肿瘤杀伤作用的基因、microRNA-101等具有肿瘤杀伤作用的microRNA分子以及其他具有肿瘤杀伤作用的蛋白因子中的一种，上述肿瘤杀伤因子均能够在肿瘤部位高效杀伤肿瘤，进而达到治疗肿瘤的目的。
[0033]本发明结合了嵌合抗原受体特异性地结合特异肿瘤类型的高靶向性特点，以及脂肪干细胞免疫原性低、容易被病毒感染、能在短时间内大规模扩增以及肿瘤杀伤因子的抗肿瘤作用，能够解决当前CART治疗肿瘤的多个包括“免疫风暴”、嵌合抗原表达效率低以及异体移植免疫排斥等难以解决的问题，进而提高了治疗肿瘤的效果。经过本发明改造的脂肪干细胞，既具有了非常特异的迀移至特定肿瘤部位的高效靶向性，同时又避免了过度激活免疫系统从而进一步产生免疫排斥的风险，并且其携带的肿瘤杀伤因子又能够在肿瘤部位高效杀伤肿瘤，进而达到治疗肿瘤的目
文档序号 :
【 9804447 】
技术研发人员：陈光风,史秀娟,刘小青
技术所有人：苏州佰通生物科技有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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