筛选多能干细胞生长促进因子的方法
[0118] 作为碱性磷酸酶染色的结果，发现iPS细胞是碱性磷酸酶（ALP)-阳性的，并且其 在任意培养条件下的培养过程中均保持非分化状态。
[0119] 在培养后对iPS细胞进行流式细胞术分析。其结果是，发现iPS细胞对非分化标 记物SSEA3、SSEA4、Tral-60和Tral-81是阳性的（图4)。这表明在上述实施例中描述的 在条件化的无血清培养基中培养的显示出生长能力增强的iPS细胞上的非分化标记物的 表达状态与在非条件化的无血清培养基、饲养培养或在MEF-CM中培养的情况下相比不存 在差异。因此，即使在条件无血清培养基中也没有观察到细胞性状的改变。
[0120] 而且，进行了RT-qPCR分析并且也观察到了非分化标记物基因0ct4、NAN0G和S0X2 的表达。
[0121] 因此，结果显示在MEF-条件无血清培养基中的培养能够增强iPS细胞的生长效 率，同时保持其非分化状态。
[0122] [实施例5]
[0123] 通过二维凝胶电泳对实施例1中由添加了ITS和生长因子的培养基制备的条件培 养基（图1A)和比较实施例1中由不含ITS和生长因子的培养基制备的条件培养基（图 1D)中的分泌的蛋白进行了分析，使用未条件化培养基作为对照。首先，通过丙酮沉淀从 lml各培养基中回收蛋白。将回收得到的蛋白混悬于溶胀缓冲液中，加入固相pH梯度凝胶 中，ReadyStripIPG胶条（pH3-10, 11cm;Bi〇-Rad)，并使其溶胀12小时，然后在等电聚焦装 置ProteanIEF室（Bio-Rad)中于50V和20°C下进行等电聚焦电泳。随后，将ReadyStrip IPG胶条在SDS-PAGE平衡缓冲液（含2 %DTT)中振荡10分钟，然后在SDS-PAGE平衡缓冲 液（含2. 5%碘乙酰胺）中振荡10分钟。随后，通过SDS-PAGE将蛋白显色。在实施例1中 由添加了ITS和生长因子的培养基制备的条件培养基中和在比较实施例1中由不含ITS和 生长因子的培养基制备的条件培养基中，分别检测到了 40个和12个MEF来源的分泌蛋白 的点。这表明在实施例1中由添加了ITS和生长因子的培养基制备的条件培养基（图1A) 中含有促进生长的蛋白。
[0124] [实施例6]
[0125] 1.使用MEF条件培养基的无饲养培养
[0126] 根据实施例2中标题为"1.人iPS细胞的制备"的部分，在经丝裂霉素处理灭活的 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF;饲养细胞）上培养人iPS细胞（即饲养培养），回收细胞，然后 除去其中的MEF。
[0127] 将这样制备的人iPS细胞转移至不含饲养细胞的包被了Matrigel的培养皿的孔 中，然后使用不同培养基培养（无饲养培养）。使用了下述培养基。
[0128] 无血清培养基A+ITS+FGF+TGF(DMEM，2mML-谷氨酰胺、0.ImMNEAA、1 %ITS和 0·ΙπιΜβ-巯基乙醇，添加了 100yg/L人FGF2 和 2yg/LTGF-β1)(图 5 中的E8)。
[0129] 来自无血清培养基A+ITS+FGF+TGF的MEF-条件培养基，根据实施例2中标题为 "2.条件培养基的制备"的部分制备（图5中的E8-CM)。
[0130] 根据实施例4制备的MEF-CM。
[0131] mTeSR? 1 培养基（改良的Tenneille血清替代物 1)(STEMCELLTechnologies)。
[0132] 将通过向DMEM/F12 培养基中加入终浓度 20% 的KN0CK0UTTMSR、0.ImMNEAA、2mM L_谷氨酰胺、5ng/ml人FGF2和0.ImM2-巯基乙醇制备的培养基作为对照，并且通过在所 制备的培养基中进行饲养培养实施另一项实验（图5中的KSR)。根据实施例2中标题为 "3.包被基质的培养皿的制备"的部分使用Matrigel包被培养皿。
[0133] 根据实施例2中标题为"4.无饲养细胞的iPS细胞培养"的部分描述的程序进行 培养和碱性磷酸酶染色，除了培养持续时间为4天以外。
[0134] 结果如图5A至E所示。在由饲养培养转变为无饲养培养后，在来自无血清培养基 A+ITS+FGF+TGF的MEF-条件培养基（E8-CM)中观察到了生长，而在其他培养基中观察到几 乎无生长。
[0135] 2.由饲养培养转变为在含有给定成分的培养基中的无饲养培养
[0136] 根据实施例2中标题为"1.人iPS细胞的制备"的部分，在经过丝裂霉素处理灭 活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF;饲养细胞）上培养人iPS细胞（即饲养培养）、回收并除去 MEF，除了使用无血清培养基A+ITS+FGF+TGF作为培养基代替向DMEM/F12培养基中加入终 浓度 20% 的KN0CK0UTTMSR、0.ImMNEAA、2mML-谷氨酰胺、5ng/ml人FGF2 和 0.ImM2-巯 基乙醇制备的培养基以外。
[0137] 在这部分中，将这样制备得到的人iPS细胞转移至不含饲养细胞的包被了 Matrigel的培养皿的孔中，然后使用在该实施例第1部分中使用的不同培养基无饲养培 养，随后进行碱性磷酸酶染色。
[0138] 其结果是，与在该实施例第1部分中所示的结果相比，在使用任意培养基的无饲 养培养中均观察到明显更高的生长能力。
[0139] 这表明通过使用上述无血清培养基进行饲养培养，然后再将其转变成无饲养培养 能够进一步增强多能干细胞的生长能力。
[0140] [实施例7]
[0141] 制备使用包含2_(二乙基氨基）丙烯酸乙酯作为骨架的温度敏感性水凝胶包被的 培养皿（Zhang等，NatureCommunications, (2013) 4,Articlenumber: 1335)。具体地，将 N-丙烯酰基-Ν' -丙基哌嗪、2, 2' -(乙撑二氧基）双（乙胺基）单丙烯酰胺、交联剂和光 聚合引发剂在N-甲基-2-吡咯烷酮中的混合物加入事先用3-(三甲氧基硅烷）甲基丙烯 酸丙酯处理过的塑料培养皿中，对其施加365nm的UV光30分钟，然后将平皿在50°C下放置 过夜。此后，先后使用乙醇和丙酮洗涤平皿，随后进行空气干燥。
[0142] 使用这样制备的水凝胶包被的培养皿代替Matrigel包被的培养皿，将人iPS细胞 饲养培养，然后使用根据实施例6第2部分中的不同培养基无饲养培养。其结果是，发现 iPS细胞在任何培养基中均显示出较高的生长能力。
[0143] 工业实用性
[0144] 本发明能够适用于无饲养、无血清培养多能干细胞。此外，本发明能够用于制备培 养人多能干细胞的包含促进多能干细胞生长并且具有较高安全性的生长促进因子的无血 清培养基，如无血清的、完全合成培养基。使用此类培养基，可以稳定、高效的实现人多能干 细胞无饲养培养。根据本发明，还能够获得能够分离由饲养细胞如MEF分泌的生长促进因 子的培养基。此类培养基可以用于筛选对人多能干细胞生长有用的因子。
[0145] 本申请中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用整体并入本申请。
【主权项】
1. 一种筛选多能干细胞的生长促进因子的方法，所述方法包括： a) 在含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠并且不含血清或血清替代物 的无血清培养基中培养饲养细胞以产生条件培养基并且回收所述条件培养基；和 b) 在所回收的条件培养基中检测多能干细胞的生长促进因子。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述无血清培养基是含有L-抗坏血酸、胰岛素、转 铁蛋白、硒和碳酸氢钠的DMEM/F12培养基。3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述饲养细胞的培养通过将生长因子加入无血清 培养基来进行。4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述生长因子是FGF2和/或TGF-β1。5. 根据权利要求1至4中任意一项所述的方法，其中所述饲养细胞是小鼠胚胎成纤维 细胞。6. 根据权利要求1至5中任意一项所述的方法，其中所述多能干细胞是ES细胞或iPS 细胞。7. -种多能干细胞的生长方法，所述方法包括在条件培养基中进行多能干细胞的无饲 养培养，所述条件培养基是通过在含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠并且 不含血清或血清替代物的无血清培养基中培养饲养细胞产生。8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述无血清培养基是含有L-抗坏血酸、胰岛素、转 铁蛋白、硒和碳酸氢钠的DMEM/F12培养基。9. 根据权利要求7或8所述的方法，其中所述饲养细胞的培养通过将生长因子加入无 血清培养基来进行。10. 根据权利要求7或8所述的方法，其中通过不向所述无血清培养基中加入生长因子 来进行所述饲养细胞的培养和通过向所述条件培养基中加入生长因子来进行多能干细胞 的无饲养培养。11. 根据权利要求9或10所述的方法，其中所述生长因子是FGF2和/或TGF-β1。12. 根据权利要求7至11中任意一项所述的方法，其中所述饲养细胞是小鼠胚胎成纤 维细胞。13. 根据权利要求7至12中任意一项所述的方法，其中所述多能干细胞是ES细胞或 iPS细胞。14. 一种多能干细胞的生长方法，所述方法包括将使用含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁 蛋白、硒和碳酸氢钠并且不含血清或血清替代物的无血清培养基在饲养细胞上培养的多能 干细胞转移到无饲养细胞的培养物中，并且进行所述多能干细胞的无饲养培养。15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述无血清培养基不含白蛋白。
【专利摘要】本发明涉及一种使用条件培养基筛选多能干细胞生长促进因子的方法，所述条件培养基由在含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠并且不含血清或血清替代物的无血清培养基中培养饲养细胞产生；一种通过使用条件培养基的无饲养培养使多能干细胞生长的方法；和一种通过在预先培养过饲养细胞的无血清培养基中实现多能干细胞的无饲养培养的使多能干细胞生长的方法。
【IPC分类】C12Q1/02, C12N5/10, C12N5/0735
【公开号】CN105358707
【申请号】CN201480036983
【发明人】加藤智久, 金村米博, 正札智子, 福角勇人
【申请人】株式会社钟化, 独立行政法人国立病院机构
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2014年6月3日
【公告号】EP3015551A1, US20160177272, WO2014208295A1
文档序号 :
【 9602122 】
技术研发人员：加藤智久,金村米博,正札智子,福角勇人
技术所有人：株式会社钟化,独立行政法人国立病院机构
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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