一种降血清胆固醇马克斯克鲁维酵母冻干菌粉的制备方法
技术领域：
本发明涉及降血清胆固醇马克斯克鲁维酵母冻干菌粉的制备方法，适用于降血清胆固醇功能性益生菌制剂及发酵乳制品的生产。
背景技术：
益生菌是指一类通过肠道定殖作用改善宿主特定部位微生态平衡并兼有若干其他有益生理功能的微生物。它们通过改善肠道微生物生态平衡，控制肠道感染，降低血清胆固醇水平，提高乳糖不耐症者对乳糖的利用，并能刺激特异性或非特异性免疫反应，具有免疫增强的作用。益生菌制品的活菌应该代谢稳定，活性较强，通过消化道后大量存活，进入肠道后发挥益生菌作用。目前用于生产益生菌制剂的优良菌种有双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、酵母属、克鲁维酵母属等。酵母菌包括乳糖发酵性和乳糖非发酵性二类。其中乳糖发酵性酵母有克鲁维酵母属(如马克斯克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、保加利亚克鲁维酵母)、假丝酵母属(如乳酒假丝酵母)和酒香酵母属等，是制作发酵乳制品和益生菌制剂的良好菌种。早在1963年人们就证实摄取含有某种乳杆菌或者双歧杆菌发酵的酸奶具有降低血清胆固醇含量的功效。迄今为止，国内外学者对乳酸菌降胆固醇作用机理的研究尚存在不同观点，主要集中于以下三点1.乳酸菌菌体细胞直接吸收同化胆固醇；2.乳酸菌的胆盐水解酶活性使结合态胆盐降解为游离态胆盐，后者溶解度下降与胆固醇发生共同沉淀作用；3.其他理论，如吸收同化与共沉淀联合作用。有关酵母菌的益生性也有文献报道。酵母菌作为益生菌的应用起源于饲料，如 Saccharomyces boulardii被用于不同类型痢疾的治疗。Psomas等(2003年)研究了 Saccharomyces boulardii具有降低胆固醇的功效。本发明所用马克斯克鲁维酵母菌Kl和M3作为益生菌，可在生长代谢过程中产生大量高活力的胆盐水解酶，经过体外牛津杯试验和动物实验证明有降低机体血清胆固醇含量的功效，其降血清胆固醇的作用机理与乳酸菌有相似之处。目前，国内利用乳酸菌制备冻干菌粉专利较多，如中国农业大学李博等人申请的 “一种开菲尔冻干菌粉及其制备方法和应用” (CN1911118)是利用开菲尔粒中一系列未分离鉴定菌种制备冻干菌粉；内蒙古农业大学张和平等人申请的“干酪乳杆菌^iang高密度培养方法、使用它们制备冻干菌粉的方法与所得到的冻干菌粉及其用途”(CN101418270)是利用干酪乳杆菌^iang制备冻干菌粉；上海谱莱生物技术有限公司方曙光申请的“一种嗜酸乳杆菌冻干菌粉的制备方法”(CN101486986)是利用嗜酸乳杆菌制备冻干菌粉；上海谱莱生物技术有限公司方曙光申请的“一种双歧杆菌冻干菌粉的制备方法”(CN101486987)是利用双歧杆菌制备冻干菌粉。但关于利用降血清胆固醇马克斯克鲁维酵母制备冻干菌粉的方法未见国内外相关文献报道和专利报道
发明内容
本发明的目的在于提供降血清胆固醇马克斯克鲁维酵母菌Kl和M3冻干菌粉的制备方法。本发明是通过以下技术方案实现的所述方法中，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)Kl和M3菌株均分离筛选自吉林省普通家庭的藏灵菇，并已于2006年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 1812(菌株Kl)和CGMCC No. 1811(菌株 M3)。所述方法中，马克斯克鲁维酵母菌Kl和M3在含有抗生素的马铃薯乳糖选择性培养基上的菌落大小为3 4mm，表面光滑，边缘整齐，呈圆形，有光泽，微隆起，乳白色，不透明；个体形态呈卵圆形或短椭圆形(Kl菌株)、长椭圆形或圆柱形(M3菌株)，不形成假菌丝；无性繁殖为多边芽殖，在马铃薯乳糖培养基中生长出芽率较高，有性繁殖形成子囊孢子。马克斯克鲁维酵母菌Kl和M3作为益生菌，均可降低机体血清胆固醇含量。所述方法中，马克斯克鲁维酵母菌Kl和M3的活化培养基为马铃薯乳糖液体培养基，其成分为马铃薯200g，乳糖20g，蒸馏水1000mL。其制法为将马铃薯去皮切块，称取 200g加入IOOOmL蒸馏水，煮沸15 20min，双层纱布过滤，补加蒸馏水至IOOOmL,加入乳糖，搅拌溶化，分装，于115°C灭菌20min。所述方法中，马克斯克鲁维酵母菌Kl和M3的发酵培养基为改良马铃薯乳糖液体培养基，其成分为马铃薯200g，乳糖20g，酵母浸粉10g，蒸馏水1000mL。其制法为将马铃薯去皮切块，称取200g加入IOOOmL蒸馏水，煮沸15 20min，双层纱布过滤，补加蒸馏水至IOOOmL,冷却至室温，调节pH6.0，加入乳糖和酵母浸粉，搅拌溶化，分装，于115°C灭菌 20mino所述方法中，利用活化培养基，将保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的马克斯克鲁维酵母菌Kl和M3分别于接种量1 % (V/V)，培养温度，培养时间21h的条件下进行活化，并在相同条件下进行扩大培养，得到扩大培养液。所述方法中，在上述试验结果基础上，利用发酵培养基，将菌株Kl和M3扩大培养液分别于接种量2% 3% (V/V)，发酵温度32°C，发酵时间21 Mh的条件下进行发酵， 得到发酵液。所述方法中，在上述试验结果基础上，利用离心机，将菌株Kl和M3发酵液分别于 4°C、8000r/min条件下离心lOmin，弃掉上清液，收集得到菌泥。所述方法中，在上述试验结果基础上，利用九阳牌食物料理机，将新鲜去皮马铃薯直接打浆成为马铃薯泥，于115°C灭菌15min ；按上述离心前发酵液1/10体积的量，取灭菌马铃薯泥作为冻干基质，并分装于600mL的冻干瓶中，每个冻干瓶装量为100mL。所述方法中，采用单因素多水平试验，确定马克斯克鲁维酵母菌Kl和M3冻干菌粉的冻干保护剂组合(W/ν) 谷氨酸钠和3%脱脂奶粉。所述方法中，在上述试验结果基础上，将Kl和M3离心所得菌泥分别置于冻干基质中，并按比例加入冻干保护剂，混合均勻后，于-30°C条件下，预冻1 至冻结状态，得到预冻物。所述方法中，在上述试验结果基础上，利用6L LABC0NC0真空冷冻干燥机(美国) 将预冻物于冻干温度_55°C、真空度0. 16mBar的条件下，冻干4 至完全干燥状态，得到冻干菌粉。所述方法中，马克斯克鲁维酵母Kl和M3冻干菌粉具有降低血清胆固醇、提高机体抗氧化能力、促进肠道菌群平衡等诸多益生功效。上述方法得到的降血清胆固醇马克斯克鲁维酵母Kl和M3冻干菌粉的制备方法属于本发明保护范围。
具体实施例方式下述实施例对本发明作进一步说明而不限制本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量对体积的百分含量。实施例1、降血清胆固醇马克斯克鲁维酵母Kl和M3冻干菌粉的制备方法1、活化将保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的马克斯克鲁维酵母菌Kl和M3分别接种于IOmL马铃薯乳糖液体培养基中，于条件下，培养21h。如此传代培养3次得到活化后的菌种培养液，其活菌数可达IO7CfuAiL以上。2、扩大培养将上述0. 5mL活化后的菌株Kl和M3培养液分别接种于50mL马铃薯乳糖液体培养基中，在条件下，培养21h，得到扩大培养液。3、发酵将上述20 30mL菌株Kl和M3扩大培养液分别接种于IOOOmL改良马铃薯乳糖液体培养基中，在32°C条件下，发酵21 Mh，得到发酵液，采用平板菌落计数法测定活菌数，结果见表2。4、离心浓缩与加入保护剂利用九阳牌食物料理机，将新鲜去皮马铃薯直接打浆成为马铃薯泥，115°C灭菌 15min ；按上述离心前发酵液1/10体积的量，取灭菌马铃薯泥作为冻干基质，分装于600mL 的冻干瓶中，每个冻干瓶装量为IOOmL ；将上述IOOOmL菌株Kl和M3发酵液于4°C、8000r/ min条件下离心lOmin，弃掉上清液，收集得到Kl和M3菌泥，分别加入冻干基质中；按表1 配方加入冻干保护剂，混合均勻后，得到浓缩物，采用平板菌落计数法测定活菌数，结果见表2。表1冻干保护剂组合试验结果
权利要求
1.一种利用菌株K1CGMCC No. 1812为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus) 制备降血清胆固醇马克斯克鲁维酵母冻干菌粉的方法，其特征在于将菌株Kl于接种量 1 % (V/V)，培养温度，培养时间21h的条件下进行活化和扩大培养，得到扩大培养液； 将扩大培养液于接种量2% 3%，发酵温度32°C，发酵时间21 Mh的条件下进行发酵， 得到发酵液；将发酵液于4°C、8000r/min条件下离心lOmin，弃掉上清液，收集得到菌泥；取发酵液体积1/10量的灭菌马铃薯泥作为冻干基质，分装于600mL的冻干瓶中，每个冻干瓶装量为IOOmL ；将离心收集后的菌泥置于冻干基质中，加入谷氨酸钠(W/V)和3%脱脂奶粉(W/V)的冻干保护剂，均勻混合后，于_30°C温度下预冻1 至冻结状态，得到预冻物； 利用美国产6L LABCONCO真空冷冻干燥机将预冻物于冻干温度_55°C、真空度0. 16mBar的条件下，冻干4 至完全干燥状态，得到冻干菌粉。
2.一种利用菌株M3CGMCC No. 1811为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus) 制备降血清胆固醇马克斯克鲁维酵母冻干菌粉的方法，其特征在于将菌株M3于接种量 1 % (V/V)，培养温度，培养时间21h的条件下进行活化和扩大培养，得到扩大培养液； 将扩大培养液于接种量2% 3%，发酵温度32°C，发酵时间21 Mh的条件下进行发酵， 得到发酵液；将发酵液于4°C、8000r/min条件下离心lOmin，弃掉上清液，收集得到菌泥；取发酵液体积1/10量的灭菌马铃薯泥作为冻干基质，分装于600mL的冻干瓶中，每个冻干瓶装量为IOOmL ；将离心收集后的菌泥置于冻干基质中，加入谷氨酸钠(W/V)和3%脱脂奶粉(W/V)的冻干保护剂，均勻混合后，于_30°C温度下预冻1 至冻结状态，得到预冻物； 利用美国产6L LABCONCO真空冷冻干燥机将预冻物于冻干温度_55°C、真空度0. 16mBar的条件下，冻干4 至完全干燥状态，得到冻干菌粉。
全文摘要
本发明涉及一种降血清胆固醇马克斯克鲁维酵母冻干菌粉的制备方法，适用于降血清胆固醇功能性益生菌制剂及发酵乳制品的生产。本发明利用筛选自藏灵菇的马克斯克鲁维酵母K1和M3两株降血清胆固醇的菌种，经过活化和扩大培养、发酵、离心浓缩和加入冻干保护剂、预冻和冻干，制备冻干菌粉。本发明优化冻干保护剂组合配方，使菌种存活率达到65％以上，且冻干菌粉活菌数达到109cfu/g以上。本发明制备降血清胆固醇马克斯克鲁维酵母冻干菌粉，具有降低血清胆固醇、提高机体抗氧化能力、促进肠道菌群平衡等诸多益生功效。
文档编号A23C9/12GK102524794SQ201210005579
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者刘慧 , 张红星, 熊利霞, 谢远红, 贾慧, 钟思琼, 高秀芝 申请人:北京农学院
文档序号 :
【 601799 】
技术研发人员：刘慧,谢远红,张红星,贾慧,钟思琼,熊利霞,高秀芝
技术所有人：北京农学院
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：刘慧,谢远红,张红星,贾慧,钟思琼,熊利霞,高秀芝
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