聚-γ-谷氨酸产生菌及生产聚-γ-谷氨酸的方法
技术领域：
本发明属于应用微生物技术领域，具体地说涉及到选育到一株聚-γ-谷氨酸产生菌及其利用该菌株生产聚-γ-谷氨酸的方法。
背景技术：
聚-γ-谷氨酸(poly-γ-glutamic acid)是由D型和L型谷氨酸通过肽键连接而成的生物可降解型高分子聚合物，平均分子量从10,000到2,000,000道尔顿(Matsukawa等.1997 Hydrophilic surface treating aqueous solution and hydrophilic surfacetreating method，U.S.Patents 5.616,585.Ito，Y.，Tamaka等，1996.Glutamic acidIndependent Production of poly(glutamic acid)by Bacillus subtilis TAM-4，Biosci.Biotechnol.Biochen.601239-1242；Cromwick等，Effect of magnese(II)on Bacilluslicheniformis ATCC9945A physiology and poly-(glutamic acid)formation.Int.J.Biol.Macromol.17259-267；Cromwick等，1995 b.Investigation by NMR of metabolicroutes to bacterial poly-(glutamic acid)using C13 labeled citrate and glutamateas media carbon sources，An，J.Microbiol.41902-909；Birrer等，1994 γ-poly(glutamic acid)formation of Bacillus lecheniformis 9945APhysiology andbiochemical studies.Int.J.Biol.Micromol.16265-275.)。经纯化的聚-γ-谷氨酸在不同的pH条件下，物化特性差异显著，在弱酸性、中性或碱性条件下，聚-γ-谷氨酸的侧链带负电荷，呈伸展状；在酸性条件下则带正电，构象呈紧密的球状(He，L.M等，2000.Bacillus lichenformis γ-glutamyl exopolymerphysiochemicalcharacterization and U(VI)interaction，JP Patent 11240827)。在有Ca2+存在的条件下，聚-γ-谷氨酸在中性环境中也可呈紧密的球状构相。聚-γ-谷氨酸及其衍生物作为一种环保型生物高分子，因其具有良好的水溶性，能彻底被生物降解，对人无毒害甚至可以食用等优点，在农业、食品、医药、化妆品、纤维轻化工等领域具有广阔的应用前景。
聚-γ-谷氨酸具有极其优良的吸水性，可用于吸水剂的研制。目前，很多单位开发出吸水性的高分子化合物作为植物的吸水保湿剂。但是这些人工合成的高分子化合物在自然界不能够被降解，在吸水的同时又造成了环境污染。在这方面，聚-γ-谷氨酸具有得天独厚的优势吸水性强，可自然降解。
在动植物养殖方面，聚-γ-谷氨酸含有大量游离α-羧基对二价金属离子、农药、氨基酸等物质具有螯合作用，能够富集这些离子，并有效供给动植物利用。Kinnersley等报道，施用经聚-γ-谷氨酸富集的Ca2+、Mg2+等二价阳离子，植物可以更有效利用(Kinnersley等，1994，Compisition and method for enhanced fertilizer uptake by plants，pateneWO9409628)。另一方面，饲料中添加0.1～3.0％的聚-γ-谷氨酸，可以降低家禽和家畜的脂肪积累，可用于饲养瘦肉型家禽、家畜以及蛋鸡等(Tanimot等，2000，Feed compositioncontaining poly-γ-glutamic acid.JP Patent WO9635339)。
在食品应用方面，Konno等发现，聚-γ-谷氨酸可以增加面包的弹性，使面包，蛋糕的颗粒更加细致(Konno等，1989，Bakery products and noodles containing polyglutamicacid.U.S.Patents.4，8888，193.)。聚-γ-谷氨酸还可以增强面条的韧性，防止面条中的固体物质溶解在沸水中。Mitsuikzi等在1998年发现分子量低于20万的聚-γ-谷氨酸具有比葡萄糖更好的抗冻性，因此聚-γ-谷氨酸的抗冻性，可食用性使聚-γ-谷氨酸可被广泛的应用于食品加工领域和对深度冷冻敏感的酶或培养物的冷冻保藏(Mitsuiki等，1998，Relationship between the antifreeze activities and the chemical structures ofoligo-and poly(glutamic acid)s.J.Agric.Food.Chem.46891-895)；聚-γ-谷氨酸还可以作为矿质吸收促进剂，有助于人体对矿质元素的吸收。与酪蛋白磷酸肽(CPP)相比，因其具有优良的水溶性，吸收效果更佳；而且聚-γ-谷氨酸可以掩盖高浓度矿质元素所带来的刺激性、收敛性和粗糙感等适口性问题，尤其适用于补钙和补铁的保健品。
由于聚-γ-谷氨酸具有良好的水溶性，对人无毒害，其自身无抗原性，因而在药物的输送及缓释方面的应用倍受瞩目。Sakurai研制了一种可用于包埋药物的复合聚合物，聚-γ-谷氨酸是其中主要的水溶性物质(Sakurai等，1995，Water soluble high molecularweight polymerized drug preparation，U.S.Patent，5,693,751.)。聚-γ-谷氨酸的大量游离α-羧基能够亲和抗原呈递细胞，并可吸附多种药物。以聚-γ-谷氨酸骨架为桥梁，抗原呈递细胞和特定药物结合形成共轭体，将药物输送至靶位点，可大幅度降低药物的使用量，这样不仅降低了药物的使用成本，同时降低药物对人体的毒害。该方案主要用于治疗红斑狼疮、风湿性关节炎和I型糖尿病等。
聚-γ-谷氨酸还被作为药物直接用于某些疾病的治疗，如Kato等早在1984年就报道l-beta-D-arabinofuranosylcyutosine与聚-γ-谷氨酸结合后具有抗肿瘤的活性。此外，Otani等于1998年报道由明胶和聚-γ-谷氨酸组成的水凝胶与水溶性的carbodimides交联后可做为软组织的生物胶，这种物质比传统的fibrin glue更加有效(Markland等，1999.Modified polypeptides containing γ-benzyl glutamic acid asdrug delivery platforms.Int.J.Pharm.178，183-192；Otani Y等，1998，Effectof additives on gelatin and tissue adhesion of gelatin-poly(L-glutamicacid)mixture，Biomaterials，19，2167-2173.)]。
目前，聚-γ-谷氨酸的生物合成主要通过芽胞杆菌属的地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)和枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)发酵来获得产物。据报道Bacilluslicheniformis 9945a菌株，在含有E培养基的摇瓶发酵中，聚-γ-谷氨酸的产量可达17g/L，分子量在3000kDa以下(Cromwick，等，1995a.Effect of magnese(II)on Bacilluslicheniformis ATCC9945A physiology and γ-poly(glutamic acid)formation.Int.J.Biol.Macromol.17259-267.)。Ko和Gross于1997年(Ko，等，1998.Effects of glucoseand glycerol on gamma-poly(glutamic acid)formation by Bacillus licheniformis ATCC9945a.Biotechnology and Bioengineering.57(4)430-436.)发现利用葡萄糖和甘油的混合碳源，可以提高聚-γ-谷氨酸的产量。他们认为对于Bacillus licheniformisATCC9945a来说，葡萄糖是比甘油更有利于细胞生长的碳源，同时菌体细胞对葡萄糖的利用也比甘油、柠檬酸、谷氨酸快。但是，发酵培养基中缺乏甘油将会导致聚-γ-谷氨酸产率的急剧下降。把培养基中甘油的含量从40克/升降至0，经96小时的培养，聚-γ-谷氨酸的浓度从对照的20.5克/升降至5.7克/升。对于甘油的这种增效作用现在还没有很好的解释。此外，高浓度的葡萄糖会使地衣芽胞杆菌会产生多糖类的副产物。Ito等在1996年发现葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖比乳糖、半乳糖和甘油更适合Bacillus subtilis TAM-4合成聚-γ-谷氨酸，在适合条件下，该菌株最高可产生22.1克/升聚-γ-谷氨酸。枯草芽胞杆菌IFO3335需要L-谷氨酸，柠檬酸和硫酸铵作为碳源来合成聚-γ-谷氨酸，产量达到20克/升。枯草芽胞杆菌(natto)在含麦芽糖、豆油和甘油的MSG培养基中可产生35克/升聚-γ-谷氨酸(Ogawa等，1991 Purification and properties of γ-glutamyltranspeptidasefrom Bacillus subtilis(natto).Agric.Biol.Chem.55(12)2971-2977.)。
在目前普遍使用的菌种Bacillus licheniformis ATCC 9945a、Bacillussubtilis(natto)合成聚-γ-谷氨酸的过程中，存在菌株合成聚-γ-谷氨酸性状不稳定的现象，在保藏或转接之后，大部分的菌落丢失了合成聚-γ-谷氨酸的性能(Ashiuchi等，2001，Isolation of Bacillus subtilis(chungkookjang)，a poly-γ-glutamate producer withhigh genetic competence.Appl.Microbiol.Biotechnol.，57764-769.)，这种情况要求实验过程中反复纯化菌种；同时，采用Bacillus licheniformis ATCC 9945a合成聚-γ-谷氨酸，培养基中需要添加高浓度的甘油(至80g/L)，从而导致发酵成本过高，此外还存在发酵周期较长(2天至5天)等问题(Soon等，2000，Biotech.Lett.，22585-588.；Borbely，2001，Polymeric product，United States Patent 6,326,511)；以上这些问题严重制约了聚-γ-谷氨酸产业化进程。此外，Bacillus licheniformis ATCC 9945a和Bacillus subtilis(natto)等菌株生物合成的聚-γ-谷氨酸的分子量在3000KD以下((Cromwick，等，1995a.Effect of magnese(II)on Bacillus licheniformis ATCC9945Aphysiology and γ-poly(glutamic acid)formation.Int.J.Biol.Macromol.17259-267.))，在利用聚-γ-谷氨酸合成高分子生物材料时，在性能上和应用范围上受到了很大的限制。目前，仅报道Bacillus subtilis(chungkookjang)生物合成的聚-γ-谷氨酸的分子量可达10000KD，是否能够筛选到产生聚-γ-谷氨酸分子量更高的菌株，迫切有待开发。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，选育一株产聚-γ-谷氨酸能力强，合成聚-γ-谷氨酸的特性稳定；适应液体发酵条件，能够合成高分子量聚-γ-谷氨酸的产生菌及其生产聚-γ-谷氨酸的方法。
本发明是这样实现的一种能产生聚-γ-谷氨酸的菌株，其特征在于，所述菌株为X-003，一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏在中国典型物保藏中心(CCTCC)，保藏时间2002年12月25日，保藏编号NOM202048。
菌种的分离与筛选取中国湖北省武汉市华中农业大学实验农场水稻田土壤表层以下5cm的土壤，加入适量的无菌水，摇匀，梯度稀释100倍。将悬液在80℃热处理15分钟，涂LB固体平板，经过夜培养，挑取粘性菌落于5毫升聚-γ-谷氨酸筛选培养基(E培养基见文献Cromwick等，Effect of magnese(II)on Bacillus licheniformis ATCC9945A physiology andpoly-(glutamic acid)formation.Int.J.Biol.Macromol.17259-267)培养2～3天。将培养液离心取上清，用3倍体积的乙醇沉淀，收集沉淀物，冰冻干燥，加适量双蒸水溶解，利用HPLC检测产物。将筛选到的菌株按规定的方法进行菌株鉴定。
聚-γ-谷氨酸产生菌Bacillus subtilis，X-003的生物学及其遗传特性生物学特性菌体直杆状，革兰氏染色阳性，芽胞近似圆形，偏端生。在LB固体培养基上菌落圆形，边缘平滑，菌苔丰满，粘稠。最适生长温度30-37℃，适宜pH6.8-7.2。接触酶实验阴性，吲哚阴性，硝酸盐利用阳性，柠檬酸盐利用阳性，明胶液化实验阳性。
遗传特性该菌株含有两条质粒(如
图1所示)，聚-γ-谷氨酸合成酶基因位于染色体上。该菌株合成聚-γ-谷氨酸的性能稳定，连续传代20次以上，该菌株合成聚-γ-谷氨酸的能力不变。
菌种培养、传代和保藏在LB培养基(培养基配方如前所述)固体斜面上于37℃培养，可于4℃短期保藏，以冷冻甘油管长期保藏，作为原始菌种；生产菌种需从原始菌种中转接。
2、利用所述菌株为X-003，一种枯草芽孢杆菌X-003，Bacillus subtilis，CCTCC，NOM202048生产聚-γ-谷氨酸的方法，按照下列步骤生产本发明的菌株(菌株为X-003，一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，CCTCC，NOM202048)保藏按下列步骤A、Bacillus subtilis X-003在LB(培养基配方如前所述)固体平板上划线，37℃培养；B、括取菌苔至无菌的20％甘油保藏管中，65℃水浴处理15分钟；C、-70℃冷冻保藏。
种子液制备A、将冷冻保藏的菌种接种于含有蛋白胨10克/升、NaCl 10克/升、酵母抽提物5克/升、琼脂20克/升、pH7.0的LB固体培养基的斜面上，37℃培养24～48小时，使其活化；B、将上述活化的种子转入含有蛋白胨10克/升、NaCl 10克/升、酵母抽提物5克/升、pH7.0的LB三角瓶液体种子培养基中，37℃ 200rpm培养5～6小时至对数生长中期；C、按照每1升培养基的加入量配制种子培养基谷氨酸15克；葡萄糖40克；柠檬酸10克，氯化铵7克；K2HPO40.5克；MgSO4·7H2O 0.5克；FeCl3·6H2O 0.04克；CaCl2·2H2O0.5克；MnSO4·H2O 0.104克，蛋白胨10克；补充蒸馏水至1000ml，pH6.5～6.8；D、按种子罐容积的60～80％投入C步骤制备的培养基，以0.1Mpa高压蒸汽灭菌，维持30分钟，冷却至37℃接入B步骤制备的种子液；发酵生产A、按照每1升培养基的加入量配制发酵培养基谷氨酸15克；葡萄糖40～100克；柠檬酸10克，氯化铵7克；K2HPO40.5克；MgSO4·7H2O 0.5克；FeCl3·6H2O 0.04克；CaCl2·2H2O 0.5克；MnSO4·H2O 0.104克，蛋白胨10克；泡敌0.5～2ml，补充蒸馏水至1000ml，pH6.5～6.8；
B、按发酵罐容积的60～80％投入上述发酵培养基，以0.07～0.1Mpa高压蒸汽灭菌维持30分钟，冷却至37℃接入种子液；在37℃条件下培养，罐压0.3～0.5Kg/cm2，通气量1∶0.6～1.2(v/v)；提取与精制将所述的菌株进行液体深层发酵，28～36小时结束发酵；然后离心去除菌体，收集上清液，超滤浓缩上清液，并用95％乙醇沉淀聚-γ-谷氨酸，回收得到聚-γ-谷氨酸。
本发明的效果与国外所采用的聚-γ-谷氨酸产生菌相比，本发明的聚-γ-谷氨酸产生菌Bacillussubtilis X-003具有以下特点(1)菌株生长速度快本发明的菌株在10升发酵罐中，发酵时间为28小时；其它枯草芽胞杆菌为36小时以上；地衣芽胞杆菌需48小时以上。
(2)所合成的聚-γ-谷氨酸分子量高(分子量10000KD以上，见附图2，3，4)。聚-γ-谷氨酸产量高采用液体三角瓶摇瓶培养方法(250ml三角瓶摇瓶发酵48小时)，发酵液中聚-γ-谷氨酸的浓度达10mg/ml，聚-γ-谷氨酸的分子量分布范围1000～20,000kDa。
(3)发酵培养基中不需要甘油，因而可降低生产成本。
(4)在高浓度的葡萄糖下也不合成多糖等副产物。
(5)本发明的菌株的遗传性状稳定，保藏、转接之后都没有发生合成聚-γ-谷氨酸的能力降低的现象；发酵接种前不需要重新划线分离。
附图及其说明图1是本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，X-003菌株的质粒图谱(1、是Bacillus subtilis X-003的质粒，2、是λ/HindIII)图2是聚-γ-谷氨酸纯品的HPLC分析(保留时间为14min的色谱峰为发酵产物，分子量200KD)。
图3是Bacillus subtilis，X-003菌株的聚-γ-谷氨酸发酵液的HPLC分析(保留时间为10min的色谱峰为发酵产物，分子量10000KD以上)。
图4是聚-γ-谷氨酸发酵液的HPLC分析(保留时间为10min的色谱峰为发酵产物，分子量10000KD)具体实施方式
实施例1聚-γ-谷氨酸产生菌X-003的分离、鉴定取华中农业大学实验农场水稻田土壤表层以下5cm的土壤，加入适量的无菌水，摇匀，梯度稀释100倍。将悬液在80℃热处理15分钟，涂LB(LB培养基按每1升蒸馏水中应加入的量其配方如下蛋白胨10克/升、NaCl 10克/升、酵母抽提物5克/升、琼脂20克/升、pH7.0)固体平板，经过夜培养，挑取粘性菌落于5毫升聚-γ-谷氨酸筛选培养基E(E培养基配方及制作见文献Cromwick等，Effect ofmagnese(II)on Bacillus licheniformis ATCC9945A physiology and poly-(glutamicacid)formation.Int.J.Biol.Macromol.17259-267)培养2-3天。将培养液离心取上清，用3倍体积的乙醇沉淀，收集沉淀物，冰冻干燥，加适量双蒸水溶解，利用HPLC(高效液相色谱)检测产物。将筛选到的菌株按规定的方法进行菌株鉴定，确定该菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
将该菌株做摇瓶发酵试验，产物经提纯用HPLC检测，检测其分子量在10000KD以上。目前国内外报道的分子量在10000KD以上的菌株只有Bacillus subtilis chungkookjang，在相同的HPLC分析条件下，其保留时间为11min，说明其产物的分子量小于Bacillussubtilis，X-003的聚-γ-谷氨酸分子量；而且Bacillus subtilis chungkookjang菌株没有任何质粒存在；其产物聚-γ-谷氨酸的产生需要甘油。所以本发明分离得到的菌株经鉴定为Bacillus subtilis X-003属于一株新菌种。
实施例2聚-γ-谷氨酸的HPLC分析方法聚-γ-谷氨酸的定量分析及分子量的测定由HPLC完成，色谱柱G6000PWXL，流动相为25mM Na2SO4溶液与乙腈按4∶1比例的混合液。经提纯的聚-γ-谷氨酸作为定量的标准物，分子量的标准物为TSK standard Poly(ETHYLENE OXIDE)。
聚-γ-谷氨酸的产量及分子量的测定步骤如下发酵液经定量稀释后，调节pH值至3.0，10000rpm，30分钟离心，收集上清。经稀释后的发酵液用来检测浓度及分子量。发酵产物聚-γ-谷氨酸的保留时间为10min，分子量在10000KD以上(见图2、3)所示。
实施例3聚-γ-谷氨酸产生菌的液体分批发酵生产1.用冷冻管保藏的菌种作为原始菌种。
2.斜面菌种将冷冻管保藏的菌种Bacillus subtilis x-003用接种环接种到LB固体斜面(在每1升蒸馏水量的培养基中加入蛋白胨10克/升、NaCl 10克/升、酵母抽提物5克/升、琼脂20克/升、pH7.0.)，37℃培养。
3.种子液培养将LB(培养基成分同上所述)固体斜面上活化的菌落，接种于在按1升蒸馏水量的培养基中加入蛋白胨10克/升、NaCl 10克/升、酵母抽提物5克/升、pH7.0的250毫升三角瓶中，每瓶培养液的装液量为20～40毫升，37℃200rpm培养5～6小时至对数生长中期。
4.发酵罐培养将560g葡萄糖与3.5g MnSO4·7H2O混合，配成1.5L母液，115℃灭菌20分钟。其余成分(配方谷氨酸15克；柠檬酸10克，氯化铵7克；K2HPO40.5克；FeCl3·6H2O 0.04克；CaCl2·2H2O 0.5克；MnSO4·H2O 0.104克，蛋白胨10克；泡敌0.5～2ml，水1000ml，pH6.5～6.8)直接加入10L发酵罐中，加水至培养基体积为5.5L，调节培养基pH值为6.5～6.8，121℃灭菌30分钟。灭菌结束后，将葡萄糖母液加入发酵罐中，并以1％接种量接种，发酵搅拌转速300～800rpm，通气量1∶0.6～1.2(v/v)，发酵温度37±2℃。发酵至28小时结束，检测、分析所得到的聚-γ-谷氨酸(分子量在10000KD以上)的浓度为12g/L。
5、聚-γ-谷氨酸发酵液后处理取上述发酵液5升，直接调节发酵液pH值至3.0，在10000rpm下，离心30分钟，收集上清液；超滤除去小分子量物质，并浓缩至1升；向浓缩液中加入3升95％乙醇，沉淀过夜。在10000rpm下，30分钟离心收集沉淀，真空干燥，得到52克干燥产品。在本实施例中聚-γ-谷氨酸提取回收率为86.7％。
实施例4聚-γ-谷氨酸产生菌的液体补料发酵生产1.用冷冻管保藏的菌种作为原始菌种。
2.斜面菌种将冷冻管保藏的菌种Bacillus subtilis x-003用接种环接种到LB固体斜面(在每1升蒸馏水量的培养基中加入蛋白胨10克/升、NaCl 10克/升、酵母抽提物5克/升、琼脂20克/升、pH7.0)，37℃培养。
3.种子液培养将LB(培养基成分同上所述)固体斜面上活化的菌落，接种于在按1升蒸馏水量的培养基中加入蛋白胨10克/升、NaCl 10克/升、酵母抽提物5克/升、pH7.0的250毫升三角瓶中，每瓶培养液的装液量为20～40毫升，37℃200rpm培养5～6小时至对数生长中期。
4.发酵罐培养将1120g葡萄糖与28g MgSO4·7H2O混合，配成3L母液，115℃灭菌20分钟；另取4480g葡萄糖，配成15L葡萄糖母液，115℃灭菌20分钟。其余成分(配方谷氨酸15克；柠檬酸10克，氯化铵7克；K2HPO40.5克；FeCl3·6H2O 0.04克；CaCl2·2H2O 0.5克；MnSO4·H2O 0.104克，蛋白胨10克；泡敌0.5～2ml，水1000ml，pH6.5～6.8)直接加入80L发酵罐中，加水至培养基体积为38L，调节培养基pH值为6.5～6.8，121℃灭菌30分钟。灭菌结束后，将3L葡萄糖盐母液加入发酵罐中，并以1％接种量接种，发酵搅拌转速200～400rpm，通气量1∶0.6～1.2(v/v)，发酵温度37±2℃。发酵过程中，流加葡萄糖母液。发酵至36小时结束，检测、分析所得到的聚-γ-谷氨酸(分子量在10000KD以上)的浓度为30g/L。
5、聚-γ-谷氨酸发酵液后处理取上述发酵液30升，经稀释后调节发酵液pH值至3.0，在10000rpm下，离心30分钟，收集上清液；超滤除去小分子量物质，并浓缩至15升；向浓缩液中加入45升95％乙醇，沉淀过夜。在10000rpm下，30分钟离心收集沉淀，真空干燥，得到819克干燥产品。在本实施例中聚-γ-谷氨酸提取回收率为91％。
权利要求
1.一种能产生聚-γ-谷氨酸的菌株，其特征在于，所述菌株为X-003，一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，CCTCC，NOM202048。
2.一种实现权利要求1的生产聚-γ-谷氨酸的方法，其特征按照下列步骤；(1)种子液制备A、将冷冻保藏的菌种接种于含有蛋白胨10克/升、NaCl 10克/升、酵母抽提物5克/升、琼脂20克/升、pH7.0的LB固体培养基的斜面上，37℃培养24～48小时，使其活化；B、将上述活化的种子转入含有蛋白胨10克/升、NaCl 10克/升、酵母抽提物5克/升、pH7.0的LB三角瓶液体种子培养基中，37℃200rpm培养5～6小时至对数生长中期；C、按照每1升培养基的加入量配制种子培养基谷氨酸15克；葡萄糖40克；柠檬酸10克，氯化铵7克；K2HPO40.5克；MgSO4·7H2O 0.5克；FeCl3·6H2O 0.04克；CaCl2·2H2O 0.5克；MnSO4·H2O 0.104克，蛋白胨10克；补充蒸馏水至1000ml，pH6.5～6.8；D、按种子罐容积的60～80％投入C步骤制备的培养基，以0.1Mpa高压蒸汽灭菌，维持30分钟，冷却至37℃接入B步骤制备的种子液；(2)发酵生产A、按照每1升培养基的加入量配制发酵培养基谷氨酸15克；葡萄糖40～100克；柠檬酸10克，氯化铵7克；K2HPO40.5克；MgSO4·7H2O 0.5克；FeCl3·6H2O 0.04克；CaCl2·2H2O 0.5克；MnSO4·H2O 0.104克，蛋白胨10克；泡敌0.5～2ml，补充蒸馏水至1000ml，pH6.5～6.8；B、按发酵罐容积的60～80％投入上述发酵培养基，以0.07～0.1Mpa高压蒸汽灭菌维持30分钟，冷却至37℃接入种子液；在37℃条件下培养，罐压0.3～0.5Kg/cm2，通气量1∶0.6～1.2(v/v)；(3)提取与精制将所述的菌株进行液体深层发酵，28～36小时结束发酵；然后离心去除菌体，收集上清液，超滤浓缩上清液，并用95％乙醇沉淀聚-γ-谷氨酸，回收得到聚-γ-谷氨酸。
全文摘要
本发明公开了一种能产生聚－γ－谷氨酸的菌株以及利用该菌株生产聚－γ－谷氨酸的方法。其特征在于，所述菌株为X－003，一种枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis，CCTCC，NOM202048。采用种子液制备、液体深层发酵工艺生产获得聚－γ－谷氨酸产品。所述的菌株遗传性状稳定，合成聚－γ－谷氨酸的能力强，所合成的聚－γ－谷氨酸分子量达10000KD以上。利用本发明的菌株及其发酵方法聚－γ－谷氨酸的摇瓶发酵水平达到10mg/ml，80升发酵罐发酵水平为30mg/ml。
文档编号C12P13/14GK1536071SQ03118908
公开日2004年10月13日 申请日期2003年4月10日 优先权日2003年4月10日
发明者陈守文, 喻子牛, 江昊, 孙明, 何进, 蔡皓, 李林 申请人:华中农业大学
文档序号 :
【 416922 】
技术研发人员：陈守文,喻子牛,江昊,孙明,何进,蔡皓,李林
技术所有人：华中农业大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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技术研发人员：陈守文,喻子牛,江昊,孙明,何进,蔡皓,李林
技术所有人：华中农业大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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