猪骨形成蛋白15基因多态性的pcr-rflp检测方法

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专利名称：猪骨形成蛋白15基因多态性的pcr-rflp检测方法
技术领域：
本发明属于猪的分子生物学技术领域，具体地说本发明涉及猪骨形成蛋白15基因多态性的PCR-RFLP检测技术。
背景技术：
产仔数是养猪生产中最重要的经济性状之一，提高每头母猪断奶仔猪将以最小的额外投入，增加养猪生产者的经济回报(Rothschild，1996)。一般来说，产仔数的多少取决于品种(遗传)，不同品种间产仔数(从2头到20头，平均9到10头)和胚胎存活率(15-40％)存在很大差异。产仔数表型标准差在2.5到3头之间，遗传力为0.10到0.15(Johnson等，Responses in ovulation rate，embryonal survival，and litter traits in swine to 14generations of selection to increase litter size.J Anim Sci.77(3)541-57)。中国梅山猪比欧洲和美国商品猪每窝多产4到5头仔猪，比大白猪多排卵7.1枚。梅山猪多产基因导入欧洲和美国猪种中已产生了明显的商业价值。据文献报道，只要将猪产仔数提高1～1.5头，英国养猪业每年可获得7亿英镑的额外利润，而整个欧盟每年获得的额外利润将至少是20亿英镑(Clutter，1995)。
猪产仔数是一个遗传力低的限性性状，采用传统选择方法，直接选择产仔数而获得遗传进展是非常困难的。法国用了30多年时间来改良这个性状，结果毫无进展；而丹麦用了50多年的时间才将每胎产仔数提高了1.0头。Johnson等(Ovulatory response，and plasmaconcentrations of luteinizing hormone and progesterone following administration of syntheticmammalian or chicken luteinizing hormone-releasing hormone relative to the first or secondovulation in the sequence of the domestic hen.Biol Reprod.1984，31(4)646-55.)、Bennett和Leymaster(Integration of ovulation rate，potential embryonic viability and uterine capacity into amodel of litter size in swine.J Anim Sci.1989，67(5)1230-41.)提出根据排卵率、胚胎存活率或子宫容量制定选择指数比直接选择产仔数，预计可获得较大选择反应。Johnson等人(1999)报道连续11代根据提高排卵率和胚胎存活率指数进行选择，接下来3个世代选择产仔数。经过14代的综合选择，与对照组(随机选择)相比，初生时总产仔数和活仔数分别提高3头和1.4头。也有文献报道，采用超多产选择法(hyperprolificacy selection)、BLUP(Best LinearUnbiased Prediction，最佳线性无偏估计)和繁殖激素水平的间接选择，能提高窝产仔数，但进展不大。
分子标记辅助选择(marker assisted selection，MAS)技术的建立和发展，给产仔数的遗传改良提供了新的方法。在公畜和母畜发育早期，同时直接选择影响产仔数表达的基因，将提高选择的准确性和选择反应。为了实施MAS，必须鉴别影响重要经济性状的单个候选基因和数量性状基因座位(quantitative trait loci，QTL)，并估计它们的遗传效应。
产仔数受母体排卵数和胚胎存活率直接影响，而排卵率又是一个复杂性状，受遗传和众多环境因子影响。目前许多研究直接集中卵泡生成调控，主要研究方向是鉴别卵巢产生的自分泌或旁分泌调控因子的生理功能。有些调控因子由卵母细胞合成和分泌，并扮演控制卵泡生长和分化的形态发生作用。大量证据显示卵母细胞派生因子调控卵巢功能。卵母细胞派生因子有生长分化因子-9(growth differentiation factor-9，GDF9)、骨形态发生蛋白6(bonemorphogenetic protein 6，BMP6)和骨形态发生蛋白15(BMP15)，它们都属于最大的胞外信号蛋白家族转移生长因子-β(transforming growth factor β，TGFβ)超家族成员。利用敲除GDF9基因鼠证实颗粒细胞生长和分化，以及卵母细胞减数分裂能力均需要GDF9直接参与，缺乏GDF9基因母鼠导致早期卵泡生成受阻，以致不能生育。
1998年，Dube等人克隆了鼠和人BMP15基因，与GDF9基因非常类似，在卵母细胞中惟一表达，缺乏7个半胱氨酸残基中第4个(The bone morphogenetic protein 15 gene isX-linked and expressed in oocytes.Mol Endocrinol.12(12)1809-17.)。而7个半胱氨酸残基是40多个TGFβ超家族成员的典型保守区。由于第4个半胱氨酸能形成链间二硫键骨架，因此，BMP15和GDF9也许可能是单体或者以非共价键连接的异源或同源二聚体，并推测在卵巢中具有互补作用。鼠和人BMP15编码区序列全长1176bp，含有2个外显子，分别被3.5kb和4.2kb内含子隔开；编码392个氨基酸前肽原(其中信号肽17个氨基酸，前肽250个氨基酸和成熟肽125个氨基酸)。鼠和人前肽原、前肽和成熟肽氨基酸同源性分别为63％、60％和77％，核苷酸同源性分别为76％、74％和81％。人BMP15基因被定位于X染色体P11.2，证实与鼠BMP15基因所在X染色体上位置为保守同线性区域。绵羊BMP15基因已被克隆(Galloway等，2000，Mutations in an oocyte-derived growth factor gene(BMP15)cause increased ovulationrate and infertility in a dosage-sensitive manner.Nat Genet.25(3)279-83.)。编码区全长1179bp，含有2个外显子，被5.4kb内含子隔开，编码393个氨基酸。编码区序列与鼠和人同源性分别为78.8％和82.9％。绵羊BMP15基因被定位在X染色体10cM区域，与FecXI(多产X基因)为同一区域。在78个共信息母羊减数分裂中未发现BMP15和FecXI的表型重组。在携带多产X基因突变Inverdale羊(FecXI)和Hanna羊(FecXH)中，BMP15成熟肽序列发生了突变。BMP15基因突变杂合子绵羊排卵率增加，导致较多双胞胎或三胞胎。而BMP15基因纯合子绵羊阻碍卵泡生成，不能生育，类似敲除GDF9基因鼠表型。因此，BMP15基因也是母畜生育所必需的，自然突变即能增加排卵率(突变杂合子携带者)，也能导致不育表型(突变纯合子携带者)，可以作为排卵率或产仔数的候选基因进行深入研究。

发明内容
本发明的目的之一在于克隆猪BMP15基因编码区序列，通过序列比较分析获得单核苷酸多态性；本发明的目的之二是基于发现的单核苷酸多态性，建立BMP15基因单核苷酸多态性的PCR-RFLP检测方法，为猪排卵率或产仔数的标记辅助选择提供有用的分子标记。
本发明通过以下技术方案实现猪骨形成蛋白15(bone morphogenetic protein 15，BMP15)基因，其编码区核苷酸序列如猪序列表SEQ ID No.1和序列表SEQ IDNo.2所示。
扩增和测序编码区核苷酸序列的10种引物分别如序列表SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、序列表SEQ ID No.11、序列表SEQ ID No.12所示。
序列表SEQ ID No.3F1-15’-CTGCCTTTCACTGTTTCCTG-3’序列表SEQ ID No.4R1-15’-CTCATTTTTCTCCCCTCCAG-3’序列表SEQ ID No.5F2-15’-ACATCACAGCTCACAGCAAC-3’序列表SEQ ID No.6R2-15’-ACATGAAGCGGAGTCGTAGA-3’序列表SEQ ID No.7F2-25’-GTAGCGTCTGCCACCTACAT-3’序列表SEQ ID No.8R2-25’-CCGGAACTCAAGAATCTCAC-3’序列表SEQ ID No.9F2-35’-AGAGCCACTGTGGTTTATCG-3’序列表SEQ ID No.10R2-35’-GAAAGGATGGAGGGAACACT-3’序列表SEQ ID No.11F2-45’-TAACCAGTGTTCCCTCCATC-3’序列表SEQ ID No.12R2-45’-CCTGGGAAACCTGATCTAGC-3’如上所述的基因序列，其单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)的特征在于BMP15基因编码区的核苷酸390位。
一种克隆或和测序猪BMP15基因编码区核苷酸序列的方法，按照以下步骤猪血液基因组DNA提取、设计特异引物、聚合酶链式反应(PCR)扩增、PCR产物纯化和直接测序，通过序列比较分析获得如序列表SEQ ID No.1和序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
其中所述的引物如序列表SEQ ID No.7和SEQ ID No.8，能扩增出含有多态性位点的基因片段。
所述的方法还包括建立了BMP15基因多态性的PCR—限制性片段长度多态性(RFLP)检测方法，所述的限制性内切酶是Spe I。
所述的方法，PCR反应是在含有50ng基因组DNA、15mmol/L Tris-HCl、50mmol/L KCl(pH8.0)、2mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTPs、10μmol/L引物、4％二甲亚砜和0.5U TaqDNA聚合酶的25μl反应体系中进行，反应条件是95℃ 5min、35循环(94℃ 45S、58℃ 45S和72℃ 1min 30S)、72℃延长5min。17μl PCR产物，加入0.5μl(10U/μl)的限制性内切酶Spe I酶37℃消化过夜，消化产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳。
其中所述的多态性是226bp和277bp限制性片段长度多态性。
所述的猪BMP15基因序列，其单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)的特征在于BMP15基因编码区的核苷酸390位。
比较序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2 DNA序列(如

图1所示)，发现BMP15基因编码区核苷酸390位T→A的SNP位点。所述的用于猪BMP15基因SNP分型的检测技术是PCR-RFLP。PCR扩增的引物如序列表SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。PCR反应是在含有50ng基因组DNA、15mmol/L Tris-HCl、50mmol/L KCl(pH8.0)、2mmol/L MgCl2，200μmol/LdNTPs、10μmol/L引物、4％二甲亚砜和0.5U Taq DNA聚合酶的25μl反应体系中进行，反应条件是95℃ 5min、35循环(94℃ 45S、58℃ 45S和72℃ 1min 30S)、72℃延长5min 。17μl PCR产物，加入0.5μl(10U/μl)的限制性内切酶Spe I酶37℃消化过夜，消化产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳。所述的多态性是226bp和277bp限制性片段长度多态性。
序列表及其说明1、序列表SEQ ID No.1是来源于欧洲血统的“大白猪”克隆的核苷酸序列；2、序列表SEQ ID No.2是来源于中国地方猪种血统“梅山猪”克隆的核苷酸序列；3、序列表SEQ ID No.3是实施BMP15基因克隆所用特异引物的核苷酸序列；4、序列表SEQ ID No.4是实施BMP15基因克隆所用特异引物核苷酸序列；5、序列表SEQ ID No.5是实施BMP15基因克隆所用特异引物核苷酸序列；6、序列表SEQ ID No.6是实施BMP15基因克隆所用特异引物核苷酸序列；7、序列表SEQ ID No.7是实施BMP15基因克隆和PCR-RFLP分析所用特异引物核苷酸序列；8、序列表SEQ ID No.8是实施BMP15基因克隆和PCR-RFLP分析所用特异引物核苷酸序列；9、序列表SEQ ID No.9是实施BMP15基因克隆所用特异引物核苷酸序列；10、序列表SEQ ID No.10是实施BMP15基因克隆所用特异引物核苷酸序列；
11、序列表SEQ ID No.11是实施BMP15基因克隆所用特异引物核苷酸序列；12、序列表SEQ ID No.12是实施BMP15基因克隆所用特异引物核苷酸序列；附图及其说明图1大白猪和梅山猪BMP15基因编码区核苷酸序列比较本发明具有以下效果本发明的基因标记和SNP的PCR-RFLP检测技术可用于不同猪品种的BMP15基因多态性分析，以及研究基因与猪繁殖性能的关系。
具体实施例方式
实施例1 BMP15基因编码区DNA的测序选择中国地方品种梅山猪(中国猪血统)和外来品种大白猪(欧洲猪血统)作为典型试验材料，根据猪和人BMP15基因DNA序列设计5对引物扩增含有BMP15基因外显子1和外显子2区域。
F1-15’-CTGCCTTTCACTGTTTCCTG-3’R1-15’-CTCATTTTTCTCCCCTCCAG-3’F2-15’-ACATCACAGCTCACAGCAAC-3’R2-15’-ACATGAAGCGGAGTCGTAGA-3’F2-25’-GTAGCGTCTGCCACCTACAT-3’R2-25’-CCGGAACTCAAGAATCTCAC-3’F2-35’-AGAGCCACTGTGGTTTATCG-3’R2-35’-GAAAGGATGGAGGGAACACT-3’F2-45’-TAACCAGTGTTCCCTCCATC-3’R2-45’-CCTGGGAAACCTGATCTAGC-3’聚合酶链式反应(PCR)是在含有50ng基因组DNA、15mmol/L Tris-HCl、50mmol/L KCl(pH8.0)、2mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTPs、10μmol/L引物、4％二甲亚砜和0.5U TaqDNA聚合酶的25μl反应体系中进行，反应条件是95℃ 5min、35循环(94C 45S、58℃ 45S和72℃ 1min 30S)、72℃延长5min，4℃保存。扩增的PCR产物被纯化后用正向引物和反向引物直接进行序列测定。DNA序列用Blast软件(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行排列和比较大白猪和梅山猪BMP15基因编码区DNA序列见序列表SEQ ID No.1和序列表SEQ ID No.2所示。
实施例2 BMP15基因SNP的PCR-RFLP检测技术用Blast软件比较大白猪和梅山猪BMP15基因编码区DNA序列，在核苷酸390位发现了1个碱基改变(T→A)，即SNP(见附图1)梅山猪是A，而大白猪是T，并且导致了限制性内切酶Spe I(A↓CTAGT)酶切位点的改变。据此，建立了基于限制性内切酶Spe I的PCR-RFLP检测方法检测SNP。PCR反应在含有50ng基因组DNA、15mmol/L Tris-HCl、50mmol/L KCl(pH8.0)、2mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTPs、引物F2-2和R2-210μmol/L、4％二甲亚砜和0.5U Taq DNA聚合酶的25μl反应体系中进行，反应条件是95℃ 5min、35循环(94℃ 60S、58℃ 45S和72℃ 90S)、72℃延长10min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测等位基因A(BMP15基因编码区核苷酸390位为A)限制性片段长度为226bp和277bp，等位基因B(BMP15基因编码区核苷酸390位为T)限制性片段长度为503bp；杂合基因型AB限制性片段长度为503bp、277bp和226bp。对中国猪地方品种二花脸、梅山猪、采用中国血统的湖北省通城猪培育品种中国瘦肉猪新品系(DIV)与欧洲血统的外来品种大白猪、长白猪和杜洛克猪BMP15基因多态性进行了检测分析，其基因型和基因频率见表1所示。从表1结果可以看出，不同品种BMP15基因型不同，外来品种猪均为BB型，二花脸猪均为AA型，梅山猪中出现AA型和AB型，而培育品种DIV只有BB型。下一步将扩大样本含量，研究BMP15基因型与排卵率或产仔数的关系。
表1 不同品种猪的BMP15基因型和基因频率检测结果基因型频率(％) 基因频率(％)品种样品数AA AB BB AB二花脸 37 100 --100梅山猪 12 33.3 66.7 -66.7 33.3DIV 47 --100 -100大白猪 37 --100 -100长白猪 12 --100 -100杜洛克猪 13 --100 -100
SEQUENCE LISTING<110>华中农业大学<120>猪骨形成蛋白15基因多态性的PCR-RFLP检测方法<130>
<141>2003-04-17<160>14<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1185<212>DNA<213>猪(Sus scrofa)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1185)<223>
<400>1atg gtc ctc ctc agc atc att aga acc ctt ctt ctt tgg gga ctg gtg48Met Val Leu Leu Ser Ile Ile Arg Thr Leu Leu Leu Trp Gly Leu Val1 5 10 15ctt ttt atg gaa cac agg gtc caa atg acc cag gta ggg caa ccc tct96Leu Phe Met Glu His Arg Val Gln Met Thr Gln Val Gly Gln Pro Ser20 25 30gtg gcc ctc ctg cct gag gcc tgt acc ttg ccc ctg att agg gag ctg144Val Ala Leu Leu Pro Glu Ala Cys Thr Leu Pro Leu Ile Arg Glu Leu35 40 45cta gag gaa gcc cct ggc aaa cag cag agg aag cca cag gtc ctg ggg192Leu Glu Glu Ala Pro Gly Lys Gln Gln Arg Lys Pro Gln Val Leu Gly50 55 60cat ccc ttg cga tat atg ctg gag ttg tac cag cgt tca gcc gac gca240His Pro Leu Arg Tyr Met Leu Glu Leu Tyr Gln Arg Ser Ala Asp Ala65 70 75 80
cgt ggg cac cct agg gag aac cgc acc att ggg gcc acc atg gtg agg 288Arg Gly His Pro Arg Glu Asn Arg Thr Ile Gly Ala Thr Met Val Arg85 90 95ctg gtg agg cca ttg gtt aat gga gca agg cct ctc aga ggg ccc tgg 336Leu Val Arg Pro Leu Val Asn Gly Ala Arg Pro Leu Arg Gly Pro Trp100 105 110cat ata cag acc ttg gac ttt cct ctg aga cca aac cgg gta gcc tac 384His Ile Gln Thr Leu Asp Phe Pro Leu Arg Pro Asn Arg Val Ala Tyr115 120 125caa ctt gtc aga gcc act gtg gtt tat cgc cat caa ctt cac cta gct 432Gln Leu Val Arg Ala Thr Val Val Tyr Arg His Gln Leu His Leu Ala130 135 140ccc ttc cac ctc tcc tgc cat gtg gag ccc tgg atc cag aaa agc aca 480Pro Phe His Leu Ser Cys His Val Glu Pro Trp Ile Gln Lys Ser Thr145 150 155 160acc agt cac ttt cct tcc tca gga aga ggc tcc tta aag cct tcc ctg 528Thr Ser His Phe Pro Ser Ser Gly Arg Gly Ser Leu Lys Pro Ser Leu165 170 175ctg ccc caa gct tgg acg gag atg gat gtc acg caa cat gtt gga caa 576Leu Pro Gln Ala Trp Thr Glu Met Asp Val Thr Gln His Val Gly Gln180 185 190aag ctc tgg aat cac aag ggg cgc agg gtt cta cga ctc cgc ttc atg 624Lys Leu Trp Asn His Lys Gly Arg Arg Val Leu Arg Leu Arg Phe Met195 200 205tgt cag cag caa aat ggt agt gag att ctt gag ttc cgg ggg cgt ggc 672Cys Gln Gln Gln Asn Gly Ser Glu Ile Leu Glu Phe Arg Gly Arg Gly210 215 220att tca tcc ctg gac act gcc ttc ttg tta ctc tat ttc aat gac act 720Ile Ser Ser Leu Asp Thr Ala Phe Leu Leu Leu Tyr Phe Asn Asp Thr225 230 235 240cgg agt gtt cag aag gcc aaa ctt ctt ccc aga ggc ctg gaa gag ttt 768Arg Ser Val Gln Lys Ala Lys Leu Leu Pro Arg Gly Leu Glu Glu Phe245 250 255
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Met Val Leu Leu Ser Ile Ile Arg Thr Leu Leu Leu Trp Gly Leu Val1 5 10 15Leu Phe Met Glu His Arg Val Gln Met Thr Gln Val Gly Gln Pro Ser20 25 30Val Ala Leu Leu Pro Glu Ala Cys Thr Leu Pro Leu Ile Arg Glu Leu35 40 45Leu Glu Glu Ala Pro Gly Lys Gln Gln Arg Lys Pro Gln Val Leu Gly50 55 60His Pro Leu Arg Tyr Met Leu Glu Leu Tyr Gln Arg Ser Ala Asp Ala65 70 75 80Arg Gly His Pro Arg Glu Asn Arg Thr Ile Gly Ala Thr Met Val Arg85 90 95Leu Val Arg Pro Leu Val Asn Gly Ala Arg Pro Leu Arg Gly Pro Trp100 105 110His Ile Gln Thr Leu Asp Phe Pro Leu Arg Pro Asn Arg Val Ala Tyr115 120 125Gln Leu Val Arg Ala Thr Val Val Tyr Arg His Gln Leu His Leu Ala130 135 140Pro Phe His Leu Ser Cys His Val Glu Pro Trp Ile Gln Lys Ser Thr145 150 155 160Thr Ser His Phe Pro Ser Ser Gly Arg Gly Ser Leu Lys Pro Ser Leu165 170 175
Leu Pro Gln Ala Trp Thr Glu Met Asp Val Thr Gln His Val Gly Gln180 185 190Lys Leu Trp Asn His Lys Gly Arg Arg Val Leu Arg Leu Arg Phe Met195 200 205Cys Gln Gln Gln Asn Gly Ser Glu Ile Leu Glu Phe Arg Gly Arg Gly210 215 220Ile Ser Ser Leu Asp Thr Ala Phe Leu Leu Leu Tyr Phe Asn Asp Thr225 230 235 240Arg Ser Val Gln Lys Ala Lys Leu Leu Pro Arg Gly Leu Glu Glu Phe245 250 255Met Ala Arg Asp Pro Ser Leu Leu Leu Arg Lys Ala Arg Gln Ala Gly260 265 270Ser Ile Ala Ser Glu Val Leu Gly Pro Ser Arg Glu His Asp Gly Pro275 280 285Glu Ser Asn Gln Cys Ser Leu His Pro Phe Gln Val Ser Phe His Gln290 295 300Leu Gly Trp Asp His Trp Ile Ile Ala Pro His Phe Tyr Thr Pro Asn305 310 315 320Tyr Cys Lys Gly Val Cys Pro Arg Val Leu His Tyr Gly Leu Asn Ser325 330 335Pro Asn His Ala Ile Ile Gln Asn Leu Val Asn Glu Leu Val Asp Gln340 345 350
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权利要求
1.猪骨形成蛋白15(bone morphogenetic protein 15，BMP15)基因，其编码区核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1和序列表SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述的基因序列，其特征在于扩增和测序编码区核苷酸序列的10种引物分别如序列表SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、序列表SEQ ID No.11、序列表SEQ ID No.12所示。
3.权利要求1所述的基因序列，其单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)的特征在于序列表1所述基因编码区的核苷酸390位。
4.一种克隆或和测序猪BMP15基因编码区核苷酸序列的方法，按照以下步骤猪血液基因组DNA提取、设计特异引物、聚合酶链式反应(PCR)扩增、PCR产物纯化和直接测序，通过序列比较分析获得如序列表SEQ ID No.1和序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
5.权利要求3所述的方法，其中所述的引物如序列表SEQ ID No.7和SEQ ID No.8，能扩增出含有多态性位点的基因片段。
6.权利要求3或5所述的方法，其特征在于建立了BMP15基因多态性的PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)检测方法，所述的限制性内切酶是Spe I。
7.权利要求4或6所述的方法，PCR反应是在含有50ng基因组DNA、15mmol/L Tris-HCl、50mmol/L KCl(pH8.0)、2mmol/L MgCl2，200μmol/LdNTPs、10μmol/L引物、4％二甲亚砜和0.5U Taq DNA聚合酶的25μl反应体系中进行，反应条件是95℃ 5min、35循环(94℃ 45S、58℃ 45S和72℃ 1min 30S)、72℃延长5min。17μl PCR产物，加入0.5μl(10U/μl)的限制性内切酶Spe I酶37℃消化过夜，消化产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳。
8.权利要求6或7所述的方法，其中所述的多态性是226bp和277bp限制性片段长度多态性。
全文摘要
本发明属于猪分子生物学技术领域，具体涉及猪骨形成蛋白15(bone morphogenetic protein 15，BMP15)基因及其单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)检测技术领域。其步骤包括猪血液基因组DNA提取，根据人和猪BMP15基因设计引物，PCR扩增，PCR产物直接测序，序列比较分析，SNP检测。本发明公开了猪BMP15基因基于限制性内切酶Spe I的SNP的PCR－RFLP检测方法，为猪排卵率或产仔数的标记辅助育种提供了新的标记。
文档编号C12Q1/68GK1537942SQ03118960
公开日2004年10月20日申请日期2003年4月16日优先权日2003年4月16日
发明者蒋思文, 侯振平, 彭健, 熊远著, 郑嵘申请人:华中农业大学

文档序号 : 【 416923 】

技术研发人员：蒋思文,侯振平,彭健,熊远著,郑嵘
技术所有人：华中农业大学

备注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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蒋思文丨侯振平丨彭健丨熊远著丨郑嵘丨华中农业大学

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