杀灭和抑制组织培养中“黑胶虫”的特殊培养基的制备和使用方法
技术领域：
本发明属于特殊培养基的制备，具体涉及的技术为清除和抑制组织培养中“黑胶虫”污染的培养基制备和使用方法。
背景技术：
细胞培养技术自20世纪初创立发展至今，已广泛应用于病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学、临床医学和生物技术等各个领域，成为重要的生物研究工具。因此，一项与细胞培养有关的成功研究除了要有良好的实验设计和技术方法，关键因素之一是避免污染。
“黑胶虫”是近十几年才发现的一种细胞污染物，“黑胶虫”的分类目前尚无鉴定确认。
“黑胶虫”可寄生于动物细胞，也可以生存于培养基中，依靠细胞和培养基中的营养为生，并随细胞传代而传代。“黑胶虫”与细胞竞争性生长，开始时对细胞并没有什么影响，但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候，细胞生长就会受到影响直至死亡，严重影响了科研活动的开展和进行。所以“黑胶虫”的污染常在培养条件改变、细胞接种密度降低、细胞状态不佳时显现并使实验中断，尤其在冻存细胞复苏时可造成大量细胞死亡。“黑胶虫”的污染具有以下特点1.黑胶虫在高倍镜下呈现明显的自主运动，有丛集性。在400倍以上的高倍镜下可以清楚的看到胶虫有两种不同形态，一种较大，运动较慢，泛红光；另一种较小，红中带绿，运动较快。
2.可以通过0.22μm滤膜，常规换液或添加常用的抗菌素对其无效。
3.与其他生物体的污染相比，它不使培养液浑浊，也不改变其pH值。
4.能够还原四唑盐(MTT)形成蓝色结晶物，说明它具有线粒体。目前比较公认的观点认为“黑胶虫”是一种微生物，增殖缓慢但对细胞有损害，数量达到一定程度可引起细胞死亡，其来源可能是细胞本身的污染或从动物取材时污染造成的。该污染在全世界细胞实验室中普遍存在，解决该问题是一个世界性难题。
本发明所制备的特殊培养基，对“黑胶虫”具有很好的杀灭和抑制作用。通过使用此种特殊培养基2-3次，“黑胶虫”的污染可以得到有效的控制和预防。本发明为防止污染和抢救有价值的细胞提供了强有力的技术手段，是节约人力物力、减少不必要的经费支出和保证科研工作的顺利进行的重要手段。
发明内容
本发明的目的在于通过细胞生长所必要的营养物质和微生物生长抑制剂的结合使用，清除和控制细胞中“黑胶虫”的污染，以保障各项研究工作的顺利进行。
本发明通过如下步骤实现1.将通用组织培养基加入去离子水中，磁力搅拌直至完全溶解。
2.向上述溶液中加入如下物质(1)腐胺(2)转铁蛋白(3)谷胱甘肽(4)胸腺嘧啶(5)脲嘧啶(6)庆大霉素(7)四环素(8)罗氏芬(9)阿米卡星(10)两性霉素B(11)制霉菌素(12)脱氧胆酸钠(13)新生牛血清(14)碳酸氢钠3.0.22μm过滤除菌、分装。
4.去掉被污染细胞的培养上清，加入步骤3所得的特殊培养基，37℃、5％CO2培养。
5.如步骤4，间隔反复使用特殊培养基。
具体实施例方式
1.取通用组织培养基1包(1L/包)，加入到900ml去离子水中，磁力搅拌使之完全溶解。
2.加入腐胺，使其终浓度为5-36μg/ml。
3.加入转铁蛋白，使其终浓度为1-40μg/ml。
4.加入谷胱甘肽，使其终浓度为10-50mg/L。
5.加入胸腺嘧啶，使其终浓度为2-8.3mg/L。
6.加入脲嘧啶，使其终浓度为1-2.5mg/L。
7.加入庆大霉素，使其终浓度为20-300μg/ml。
8.加入四环素，使其终浓度为5-200μg/ml。
9.加入罗氏芬，使其终浓度为10-500μg/ml。
10.加入阿米卡星，使其终浓度为5-150μg/ml。
11.加入两性霉素使其终浓度为1-25μg/ml。
12.加入制霉菌素使其终浓度为2-50μg/ml。
13.加入脱氧胆酸钠使其终浓度为2-50μg/ml。
14.新生牛血清使其终浓度为12％。
15.碳酸氢钠使其终浓度为3g/L。
16.磁力搅拌使各物质完全溶解，调节PH到7.0-7.1，定容到1000ml。
17.0.22μm过滤除菌、分装，100ml/瓶，2-8℃冷藏。
18.去掉被污染细胞上清，加入如上所得的特殊培养基，每只25cm2培养瓶加入5-8ml特殊培养基。37℃、5％CO2培养后去掉上清，加入常规培养基。
19.间隔反复重复步骤18。
测定结果 上述所得的特殊培养基，经细胞生长曲线测定表明，对细胞的营养支持与普通培养基相同，完全满足细胞生长增殖的需要；“黑胶虫”污染的细胞，经过特殊培养基的处理，“黑胶虫”被杀灭和抑制，在培养上清中消失，细胞可以继续培养，用于各项实验研究工作；稳定性实验表明，该产品2-8℃冷藏保存时间为6个月。
权利要求
1.杀灭和抑制组织培养中“黑胶虫”的特殊培养基的制备和使用方法，其特征是1.1通用组织培养基中加入“黑胶虫”杀灭药物(1)腐胺 (2)转铁蛋白 (3)谷胱甘肽 (4)胸腺嘧啶 (5)脲嘧啶 (6)庆大霉素(7)四环素 (8)罗氏芬 (9)阿米卡星 (10)两性霉素B (11)制霉菌素 (12)脱氧胆酸钠 (13)新生牛血清 (14)碳酸氢钠1.2 0.22μm过滤除菌，分装2-8℃保存。1.3去掉被污染细胞的培养基，加入步骤2所得特殊培养基，37℃、5％ CO2培养。1.4不能完全杀灭可重复步骤1.3。
2.如权利要求书所述杀灭和抑制“黑胶虫”的特殊培养基的制备方法，其特征是步骤1.1中(5)加入的物质为脲嘧啶，终浓度为2.5mg/L。
3.如权利要求书所述杀灭和抑制“黑胶虫”的特殊培养基的制备方法，其特征是步骤1.1中(6)加入的物质为庆大霉素，终浓度为20-300μg/ml。
4.如权利要求书所述杀灭和抑制“黑胶虫”的特殊培养基的制备方法，其特征是步骤1.1中(7)加入的物质为四环素，终浓度为5-200μg/ml。
5.如权利要求书所述杀灭和抑制“黑胶虫”的特殊培养基的制备方法，其特征是步骤1.1中(8)加入的物质为罗氏芬，终浓度为10-500μg/ml。
6.如权利要求书所述杀灭和抑制“黑胶虫”的特殊培养基的制备方法，其特征是步骤1.1中(9)加入的物质为阿米卡星，终浓度为5-150μg/ml。
7.如权利要求书所述杀灭和抑制“黑胶虫”的特殊培养基的制备方法，其特征是步骤1.1中(10)加入的物质为两性霉素B，终浓度为1-25μg/ml。
8.如权利要求书所述杀灭和抑制“黑胶虫”的特殊培养基的制备方法，其特征是步骤1.1中(11)加入的物质为制霉菌素，终浓度为2-50μg/ml。
9.如权利要求书所述杀灭和抑制“黑胶虫”的特殊培养基的制备方法，其特征是步骤1.1中(12)加入的物质为脱氧胆酸钠，终浓度为2-50μg/ml。
10.如权利要求书所述杀灭和抑制“黑胶虫”的特殊培养基的制备方法，其特征是步骤1.3中37℃、5％CO2培养时间为24小时。
11.如权利要求书所述杀灭和抑制“黑胶虫”的特殊培养基的制备方法，其特征是步骤1.4中使用特殊培养的间隔时间为24-48小时，反复使用的次数为2-3次。
全文摘要
本发明首次公开了一种特殊培养基的制备和使用方法。它在通用组织培养基的基础上，添加腐胺、转铁蛋白、胸腺嘧啶、脲嘧啶、庆大霉素、四环素、罗氏芬、阿米卡星、两性霉素B、制霉菌素、脱氧胆酸钠等物质，经0.22μm过滤除菌制得此特殊培养基。该培养基对细胞污染物“黑胶虫”具有杀灭和抑制作用。该特殊培养基的使用可以挽救被污染细胞，使科学研究得以顺利进行，节约大量的人力并降低成本。
文档编号C12N1/36GK1900266SQ20051008546
公开日2007年1月24日 申请日期2005年7月21日 优先权日2005年7月21日
发明者田海梅, 张伟 申请人:张伟, 田海梅
文档序号 :
【 554045 】
技术研发人员：田海梅,张伟
技术所有人：张伟,田海梅
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：田海梅,张伟
技术所有人：张伟,田海梅
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除