一种海豚链球菌dna疫苗及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及免疫学领域，具体的说是一种海豚链球菌DNA疫苗及其应用。海豚链球菌DNA疫苗为pCNSiE。本发明的疫苗对海豚链球菌的免疫保护效率达95％本发明的疫苗在免疫后两个月内的免疫保护效率没有明显减弱。
【专利说明】—种海豚链球菌DNA疫苗及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫学领域，具体的说是一种海豚链球菌DNA疫苗及其应用。
【背景技术】
[0002]海豚链球菌(Streptococcus iniae)为一种革兰氏阳性菌,属于链球菌属，是养殖鱼类主要病原菌之一。在我国，海豚链球菌危害的鱼类包括罗非鱼、牙鲆、美国红鱼、鲷类等。除了水生动物外，海豚链球菌还能够感染人类和其它动物，是一种典型的人畜共患病原，其感染人类后可造成各种软组织炎症以及败血症等。在我国，至今没有商业化海豚链球菌疫苗，对海豚链球菌相关病害的防治一直以抗生素和化学药物为主。
【发明内容】
[0003]本发明目的在于提供一种海豚链球菌DNA疫苗及其应用。
[0004]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0005]一种海豚链球菌DNA疫苗，疫苗为pCNSiE。
[0006]具体为:
[0007]以海豚链球菌G26为模板经 引物F1/R1进行PCR扩增，扩增产物与载体pCN3质粒连接转化后质粒pCNSiE，即为海豚链球菌DNA疫苗；
[0008]所述引物序列为:
[0009]Fl:5’ -CCCGGGATGATTTTTGGAAAAAGTAGTAATGGA-3 ；
[0010]Rl:5，-CCCGGGCCTTCTTACCTTTGACTGAT-3，。
[0011]所述质粒pCNSiE在PBS中稀释至终浓度为150 μ g/ml，作为疫苗制备液。所述疫苗为注射剂。
[0012]一种海豚链球菌DNA疫苗的制备方法，以海豚链球菌G26为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR产物纯化后与用Sma I酶切的质粒pCN3连接，连接液转化到大肠杆菌DH5 α后在含有氨苄青霉素的LB培养基上培养18 — 24小时，接转化后质粒为pCNSiE，即为海豚链球菌DNA疫苗质粒。
[0013]一种海豚链球菌DNA疫苗的应用，所述质粒pCNSiE用于制备海豚链球菌的免疫疫苗中的应用。
[0014]本发明具有如下优点:
[0015]1.高保护率。本发明的疫苗对海豚链球菌的免疫保护效率达95%。
[0016]2.长效。本发明的疫苗在免疫后两个月内的免疫保护效率没有明显减弱。
【具体实施方式】
[0017]下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
[0018]在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法:[0019]1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相
应试剂盒。
[0020]2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor LaboratoryPress 2001)；[0021]3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。
[0022]实施例1
[0023]DNA疫苗质粒pCNSiE的构建:
[0024]以海豚链球菌G26为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR条件为:94 V 60s预变性模板DNA，然后94 °C 40s, 52 V 60s, 72 V 60s, 5个循环后改为940C 40s, 63°C 60s, 72°C 60s, 25个循环后再在72°C延伸反应10min。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化。将质粒pCN3 (pCN3构建过程参见Jiao XD, Zhang M，Hu YH, SunL.Construction and evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiella tardaantigens.Vaccine 2009; 27:5195 202.)用 Sma I 酶切，回收 5.4kb 片段，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶于室温连接2 — 4小时，连接液转化大肠杆菌DH5 α后在含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB固体培养基上培养18 — 24小时，筛选转化子提取质粒，即为pCNSiE。
[0025]PCR 引物为 Fl:5’ -CCCGGGATGATTTTTGGAAAAAGTAGTAATGGA-3’和 Rl:5’ -CCCGGGCCTTCTTACCTTTGACTGAT-3’。
[0026]所述菌株G26保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为:CGMCC N0.1984，分类命名为海豚链球菌(Sti^ptococcus iniae)，保藏日期为2007年3月22日，保藏单位地址为北京市海淀区中关村北一条13号。
[0027]所述LB组成成分按重量百分比计:1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠，97.5%蒸馏水.[0028]实施例2
[0029]疫苗pCNSiE的应用
[0030]步骤I)疫苗制备液的制备。将上述DNA疫苗pCNSiE质粒在PBS中稀释至终浓度为150 μ g/ml,即为疫苗制备液。
[0031]所述PBS 组成成分按重量百分比计:0.8%NaCl, 0.02%KC1, 0.358%Na2HP04.12H20, 0.024%NaH2P04,余量为水。
[0032]步骤2)疫苗的接种。将100条牙鲆(每条重约11.2g)随机分为4组，每组25条。将这4组分别命名为A、B、C和D。将A和C组的每条鱼腹腔注射IOOul上述步骤I)的疫苗制备液，将B和D组(对照组)的每条鱼腹腔注射IOOul PBS0
[0033]步骤3)海豚链球菌悬液的制备。在LB培养基中培养海豚链球菌G26至0D_为
0.8，然后离心(5000g，4°C，IOmin),收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为lxl08cfu/ml，即为G26悬液。
[0034]步骤4)疫苗的免疫保护效应检测。在步骤2)免疫注射后一个月，用上述步骤3)的G26悬液腹腔注A和B组鱼，每条鱼的注射量为IOOul。在步骤2)免疫注射后两个月，用上述步骤3)的G26悬液腹腔注射C和D组鱼，每条鱼的注射量为lOOul。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目:A组，I条；B组，19条；C组，2条；D组，17条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS):
[0035]RPS=100x(l 一免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)
[0036]由此得出疫苗pCNSiE免疫一个月和两个月时对海豚链球菌的免疫保护率分别为95%和88%。因此，pCNSiE是一种非常`高效的DNA疫苗。
【权利要求】
1.一种海豚链球菌DNA疫苗，其特征在于:疫苗为pCNSiE。
2.按权利要求1所述的海豚链球菌DNA疫苗，其特征在于: 以海豚链球菌G26为模板经引物F1/R1进行PCR扩增，扩增产物与载体pCN3质粒连接转化后质粒pCNSiE，即为海豚链球菌DNA疫苗； 所述引物序列为:
Fl:5’ -CCCGGGATGATTTTTGGAAAAAGTAGTAATGGA-3 ；
Rl:5’ -CCCGGGCCTTCTTACCTTTGACTGAT-3’。
3.按权利要求1或2所述的海豚链球菌DNA疫苗，其特征在于:所述质粒pCNSiE在PBS中稀释至终浓度为150 μ g/ml，作为疫苗制备液。
4.按权利要求1或2所述的海豚链球菌DNA疫苗，其特征在于:所述疫苗为注射剂。
5.一种权利要求1所述的海豚链球菌DNA疫苗的制备方法，其特征在于: 以海豚链球菌G26为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR产物纯化后与用SmaI酶切的质粒PCN3连接，连接液转化到大肠杆菌DH5 α后在含有氨苄青霉素的LB培养基上培养18 - 24小时，接转化后质粒为pCNSiE，即为海豚链球菌DNA疫苗质粒。
6.一种权利要求1所述的海豚链球菌DNA疫苗的应用，其特征在于:所述质粒pCNSiE用于制备海豚链球菌的免疫疫 苗中的应用。
【文档编号】C12R1/46GK103550765SQ201310557674
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月11日 优先权日:2013年11月11日
【发明者】孙黎, 孙云, 孙铂光 申请人:中国科学院海洋研究所
文档序号 :
【 524326 】
技术研发人员：孙黎,孙云,孙铂光
技术所有人：中国科学院海洋研究所
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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