一种作为a群链球菌四价疫苗保护性抗原的重组多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及DNA重组技术和疫苗药物领域，更具体讲，本发明涉及一种重组多肽， 该重组多肽可作为主要针对我国广东省流行的可引起风湿热的A群链球菌四个血清型的 四价疫苗的保护性抗原，编码该重组多肽的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿 主细胞，DNA重组技术制备该重组多肽的方法，以及该重组多肽在A群链球菌疫苗研制中的 应用。
背景技术：
A群链球菌是临床上最常见的致病性革蓝氏阳性菌之一。A群链球菌通过空气飞 沫、皮肤接触等方式传播可引起多种感染性的疾病。在所有A群链球菌引起的疾病中，以A 群链球菌上呼吸道感染导致的急性风湿热和由此诱发的风湿性心脏病的危害最为严重，研 究表明，约3%的未治疗的儿童咽炎可能发展为风湿热，并最终导致风湿性心脏病。导致该 病的原因是由于部分血清型的A群链球菌与人体心肌组织存在共同抗原，A群链球菌感染 后可引起自身免疫性疾病。根据世界卫生组织的报道，全球每年517000人死于因链球菌感 染所致的各种疾病，其中2/3死于链球菌 感染后所致的风湿热、风湿性心脏病、急性肾小球 肾炎等疾病。近年来，虽然抗菌素广泛使用，但A群链球菌感染在一些发展中国家仍然十分 严重。我国八五期间进行的A群链球菌的流行病学调查发现，我国学龄儿童A群链球菌上 呼吸道年平均感染率达50 %，部分农村地区A群链球菌感染率高达70 % 80 %。保守估 计，我国因A群链球菌感染导致的风湿性心脏病患者在250万以上，高额的手术和终身治疗 费用给患者家庭和社会造成了严重的经济负担。因此，研制一个主要针对A群链球菌多价 疫苗非常必要。A群链球菌血清型众多，根据其细胞壁M蛋白抗原的不同，可分为约150多个血清 型，并且各血清型之间缺乏交叉保护，因此很难研发一种针对所有流行毒株的疫苗。同时， 部分血清型的A群链球菌M蛋白抗原与人类组织蛋白存在交叉抗原。因此，传统的菌体疫 苗或亚单位疫苗可能导致人体的自身免疫反应。到目前为止，全世界仍然没有一个安全有 效的A群链球菌疫苗上市。M蛋白是A群链球菌菌体表面的主要毒力因子，有抗吞噬作用，机体感染A群链球 菌后产生的抗M蛋白的抗体是保护性抗体，自然感染后能持续存在30多年。近年来的研 究发现，M蛋白基因(emm)编码的多肽C末端为高度保守，N末端高度变异，是A群链球菌 型特异性的基础；N端由A、B、C三个重复片段组成，产生型特异性的保护性抗体的抗原决 定簇位于A区，产生与人体组织交叉反应的抗原决定簇位于B区、B-C区的侧翼、A-B区的 侧翼° (Alan L. Bison, Fran A. Rubin, P. Patrick Cleary and James B. Dale Clinical InfectiousDiseases 2005 ；41 11501156)因此，以M蛋白A区为基础设计针对A群链球 菌不同血清型的疫苗既避开了人体产生交叉反应的区域，又可使机体产生保护性抗体，是A 群链球菌疫苗研制的一个可行的方法。研究表明，A群链球菌的M蛋白是由两条完全为α-螺旋结构的多肽链构成的同源二聚体蛋白，空间结构为线性分子。因此，其抗原表位应为线性的抗原表位，不具有复杂的空间构象。将不同血清型A群链球菌M蛋白A区含有保护性表位，不含人体交叉反应表 位的氨基酸序列串联连接后形成的人工设计的多肽应和天然M蛋白具有相似的空间结构， 并且不会破坏原有的抗原表位。欧美发达国家经长期的研究已确认致风湿热原性的A群链球菌M分型主要集中在 皿1、3、5、6、14、18、19、24、27和29等10个血清型。2004年广东省心血管病研究所在国内首 次报道了在广东省和我国其他部分地区分离的104株A群链球菌的M蛋白emm基因分型的 结果,主导血清型是emml、18、12、69、110等型，其中emml型占29. 8%，emml8型占9. 6%。 这两个血清型均为风湿热原性的A群链球菌(陈志红，龚守芳，董太明等.应用emm基因序 列分析对104株链球菌分型.中华微生物学和免疫学杂志，2004，24 (6) :489_491.)。2008 年广州市儿童医院陈兆鸿等报道的广州地区儿童感染A群链球菌87株的emm基因分型也 证实了以上结果(陈兆鸿，谢国强，邓秋连等.广州地区儿童感染A群链球菌87株的emm 基因分型.广东医学，2008，29 (4)583-584.)。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种主要针对我国广东省流行的风湿热原性的A群 链球菌的四价疫苗的保护性抗原，它是由广东省流行的风湿热原性的A群链球菌Ml、M3、 M6、M18四个血清型的M蛋白N端含保护性抗原表位，不含人体交叉反应表位的型特异性的 氨基酸序列以及这四个血清型M蛋白C端共有的一段保守氨基酸序列连接而成的一个重组 多肽。本发明的另一个目的是提供编码该重组多肽的DNA、该DNA序列的获得方法、含该 DNA序列的载体和含该载体的宿主细胞。本发明的第三个目的是提供获得该重组多肽的方法。在本发明的第一方面，提供了一种重组多肽，它包括A群链球菌Ml型M蛋白型特 异性氨基酸序列的1-50个氨基酸(SEQ ID NO 3) ；A群链球菌M3型M蛋白型特异性序列 的21-70个氨基酸(SEQ ID NO 4) ；A群链球菌M6型M蛋白型特异性序列的1_35个氨基酸 (SEQ ID NO 5) ；A群链球菌M18型M蛋白型特异序列的1-45个氨基酸(SEQ ID NO 6) ；A 群链球菌M1、M3、M6、M18四个血清型M蛋白C端共有的一个含14个氨基酸的序列(SEQ ID NO 7)。以上所述的构成本发明重组多肽的5段氨基酸序列的连接顺序，从左侧NH2端至 右侧COOH端依次为A群链球菌Ml型M蛋白型特异性氨基酸序列的1-50个氨基酸，A群链 球菌M3型M蛋白型特异性序列的21-70个氨基酸，A群链球菌M6型M蛋白型特异性序列 的1-35个氨基酸，A群链球菌M18型M蛋白型特异序列的1_45个氨基酸，A群链球菌Ml、 M3、M6、M18四个血清型M蛋白C端共有的一个含14个氨基酸的序列。见图1。本发明提供的重组多肽具有序列表中序列1所示的氨基酸序列。在本发明的第二方面，提供了一种分离的DNA分子以及该DNA分子的获得方法。它 编码SEQ ID NO :1所示的重组多肽，所述的DNA分子包括SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。获取上述DNA分子的方法包括根据本发明重组多肽氨基酸序列选择合适的遗传 密码子直接化学合成编码本发明重组多肽DNA分子；采用PCR的方法从A群链球菌基因组中扩增出各血清型的目的基因，再通过SOE-PCR的方法拼接，形成编码本发明重组多肽的 DNA分子；根据本发明重组蛋白氨基酸序列选择合适的遗传密码子，合成一系列寡核苷酸 片段，然后通过overlap-PCR合成编码本发明重组多肽的DNA分子。用这些方法得到的DNA 分子其遗传密码子可能不同，但最终翻译产物一定含有本发明重组多肽的氨基酸序列。
在本发明的第三方面，提供了一种载体，该载体的特征在于它含有按上述任何一 种方法获得的包含有编码本发明重组多肽的氨基酸序列的DNA分子。在本发明的第四个方面，提供了含有上述载体的宿主细胞，该宿主细胞在合适的 条件下诱导表达后，产生的重组蛋白一定含有本发明重组多肽的氨基酸序列。在本发明的第五个方面，提供了一种产生本发明重组多肽的一种方法。它包括步 骤在适合表达所述重组多肽条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达出重组多肽或含有重 组多肽氨基酸序列的重组蛋白，通过合适的方法分离纯化重组多肽或含有重组多肽氨基酸 序列的重组蛋白。在本发明的第六个方面，提供了一种预防A群链球菌Ml、M3、M6、M18型感染的疫 苗，本疫苗含有权利要求1所述重组多肽以及药学上可以接受的佐剂，也可含有一些免疫 增强剂。佐剂如氢氧化铝、磷酸铝、水包油乳剂、核酸类佐剂等，免疫增强剂包括已知的可 提高机体免疫的人体、植物或微生物的蛋白质、多糖、脂类或小分子化合物。定义如本文所用，术语“M蛋白的型特异性的氨基酸序列”是指目前已公开的可从美国 疾病和预防控制中心数据库下载的不同血清型A群链球菌M蛋白N末端高度变异的氨基酸 序列，该段序列的抗原特异性决定A群链球菌的血清分型。下载地址:http://www. cdc. gov/ncidod/biotech/strep/strepindex. htm。如本文所用，术语“Ml、M3、M6、M18等”表示A群链球菌以M蛋白抗原性不同进行 的分型；术语“emml、emm3、emm6、emmlS等”表示A群链球菌以M蛋白基因的不同进行的分 型。两者之间的关系为Ml型等同于emml型，M3型等同于emm3型，依此类推。如本文所用，术语“含保护性抗原表位，不含人体交叉反应表位的型特异性的氨基 酸序列是指A群链球菌M蛋白N末端的型特异性的氨基酸序列中可诱导机体产生保护性抗 体，同时又不会引起自身免疫反应的区段。如本文所用，术语“C端共有的一段保守氨基酸序列，，是指文献已公开的A群链球 菌M蛋白大多数血清型C端保守区都有的一段与人体组织蛋白无交叉抗原的区段(Hayman WA, Brandt ER, Relf WA, et al. Int Immunol,1997,9(11) 1723-1733)。如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体等。在本发明中可 选用本领域已知的各种载体如市售载体，然后将编码本发明重组蛋白的核苷酸序列克隆进 载体提供的表达调控序列之后，可形成蛋白表达载体。如本文所用，术语“宿主细胞”主要指原核细胞，包括大肠杆菌、枯草杆菌等。在本发明的一个实例中，将编码重组多肽的基因Strep4克隆入原核表达载体 PQE30质粒，并将重组质粒转入大肠杆菌M15，获得了可可溶性表达重组多肽的大肠杆菌重 组菌 M15/PQE30-Str印4。本发明的重组多肽免疫家兔后可产生针对A群链球菌Ml型、M3型、M6型的型特异 性的杀菌抗体。在一个实例中，将重组多肽免疫后的家兔血清分别与A群链球菌Ml型、M3型、M6型、M5型的菌体进行间接免疫荧光实验，结果发现，家兔免疫血清只和重组多肽上包 含血清型的A群链球菌Ml型、M3型、M6型反应，不和无关的M5型A群链球菌反应。这表 明，由重组多肽免疫后产生的抗体是型特异性抗体。在另一个实例中，将灭活补体后的重组 多肽免疫家兔血清分别与A群链球菌Ml型、M3型、M6型、M5型以及不含针对这些血清型A 群链球菌抗体的健康成年人抗凝血混合，进行体外杀菌实验，结果发现，免疫血清仅对重组 多肽上包含血清型的A群链球菌Ml型、M3型、M6型有较高的杀菌率，而对无关的M5型A群 链球菌无杀菌作用。这表明，由重组多肽免疫后产生的抗体是型特异性的杀菌抗体。综上所述，本发明通过基因重组技术，构建了一个含可引起风湿热的A群链球菌 Ml型、M3型、M6型、M18型四个血清型M蛋白N端含保护性抗原表位，不含人体交叉反应表 位的型特异性氨基酸序列的重组多肽。实验表明，该重组多肽可诱导产生针对A群链球菌 Ml型、M3型、M6型的特异性的杀菌抗体，因而可作为预防我国广东省主要流行的风湿热原 性的A群链球菌四价疫苗的保护性抗原。
图1为本发明重组多肽结构示意图。
图2为overlap-PCR扩增的重组多肽基因的电泳图谱，图中1为overlap-PCR第 一轮反应后的产物；2，3为overlap-PCR第二轮反应后的产物(重组多肽基因)；4为空白； 5 :DL2000markero图3为含重组多肽基因的大肠杆菌克隆载体PUClS-Str印4。图4为含重组多肽基因的大肠杆菌表达载体PQE30_Str印4。图5为M15/PQE30-Str印4工程菌诱导表达后SDS-PAGE电泳图谱，图中1为 蛋白质分子量标准；2，4，6为M15/PQE30-Str印4工程菌IPTG诱导表达；3，5，7为M15/ PQE30-Str印4工程菌未诱导表达；8为带有PQE30质粒的大肠杆菌M15经IPTG诱导表达； 9为带有PQE30质粒的大肠杆菌M15未诱导表达。图6为重组多肽表达纯化的SDS-PAGE电泳图谱，图中1为蛋白质分子量标准；2为 M15/PQE30-Strep4工程菌未诱导表达；3为M15/PQE30_Str印4工程菌诱导表达；4为M15/ PQE30-Strep4工程菌诱导表达后超声裂解上清；5为用Ni-NTA凝胶吸附后上清；6为用洗 脱缓冲液1洗脱后上清；7为用洗脱缓冲液2洗脱后上清(纯化重组多肽)。图7为家兔免疫后血清中抗重组多肽的IgG抗体滴度变化曲线；图8免疫血清和免疫前血清分别与A群链球菌Ml、M3、M6、M5型的间接免疫荧光 反应结果，其中A为免疫血清和Ml型A群链球菌的免疫荧光反应；B为免疫前血清和Ml型 A群链球菌的免疫荧光反应；C为免疫血清和M3型A群链球菌的免疫荧光反应；D为免疫前 血清和M3型A群链球菌的免疫荧光反应；E为免疫血清和M6型A群链球菌的免疫荧光反 应；F为免疫前血清和M6型A群链球菌的免疫荧光反应；G为免疫血清和M5型A群链球菌 的免疫荧光反应；H为免疫前血清和M5型A群链球菌的免疫荧光反应。图9为免疫血清针对不同血清型A群链球菌杀菌率的条形示意图。
具体实施例方式下面结合具体实例进一步阐述本发明。这些实例仅用于说明本发明，而不是限制本发明的范围，下列实例中未注明具体具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 sanbrook等人的分子克隆实验手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1重组多肽基因序列的合成以及大肠杆菌克隆载体的构建从美国疾病和预防控制中心数据库下载A群链球菌emml、emm3、emm6、emml8四 个型别M蛋白N端型特异性序列，获得在重组多肽中这四个型别对应的氨基酸序列；从 报道文献中获取这四个型别M蛋白C端的共有序列。将5段氨基酸序列按从N端到C端 1-3-6-18-共有保守序列的顺序，串联拼接全部的氨基酸序列(SEQ ID NO :1)。将氨基酸序列输入DNAW0RK 2. 0在线软件，运行后获取一个带有大肠杆菌偏嗜性 密码子的编码重组多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO 2)，以及采用overlap-PCR方法合成该 核苷酸序列的一套寡核苷酸序列(SEQ ID NO 8-17)和相应的技术参数。在第一条和最后 一条寡核苷酸序列的5’端分别引入了 BamHI和HindIII的酶切位点。合成该套寡核苷酸序列，通过两轮PCR反应扩增目的基因序列。表1.第一轮PCR反应体系 反应条件为95°C 5分钟预变性，95°C，1分钟，64°C退火1分钟，72°C延伸1分钟， 共15个循环后再72°C延伸2分钟。表2.第二轮PCR反应体系
反应体系μ
寡核苷酸序列 ο2
5XPCRbuffer10
dNTP Mix(10 μ M)4
primeSTAR HS DNA polymerase(2. 5U/ml) θ7δ ddH2029 5
反应总体积50 反应条件为95°C 5分钟预变性，95°C，1分钟，64°C退火1分钟，72°C延伸1分钟， 共30个循环后再72°C延伸2分钟。通过两步PCR，成功扩增出一个600bp左右的DNA片段，和设计预期相同。(图2)PCR产物经纯化和BamH I和HindIII双酶切后后克隆到大肠杆菌克隆载体PUC18 中，构建重组克隆质粒，命名为PUClS-Str印4(图3)。蓝白斑法筛选阳性克隆，经测序分析 插入的核苷酸序列和SEQ ID NO :3中的序列完全一致。实施例2重组多肽表达载体的构建BamH I和HindIII分别双酶切重组克隆质粒PUC18_Str印4，以及大肠杆菌原核表 达质粒PQE30。琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，回收纯化编码重组多肽疫苗的DNA片段和 PQE30质粒的酶切片段，连接构建重组表达质粒，命名为PQE30-Strep4(图4)。转化大肠杆 菌M15，氨苄青霉素、卡那霉素双抗性筛选阳性克隆，经测序分析插入的核苷酸序列和SEQ ID NO 3中的序列完全一致。获得的表达重组多肽的工程菌命名为M15/PQE30-Str印4。实施例3重组多肽的表达将实例2获得的工程菌M15/PQE30-Str印4接种于20ml含100μ g/ml氨苄青霉素， 25μ g/ml卡那霉素的LB培养基中，37°C剧烈振荡培养过夜。第二天将20ml隔夜培养的菌 液接种于IL含100 μ g/ml氨苄青霉素，25 μ g/ml卡那霉素的LB培养基中，37°C剧烈振荡培 养，至菌液OD6tltl达到0. 6后加入IPTG至终浓度为ImM。继续培养4个小时后，4000 X g，20 分钟离心收菌。菌体沉淀经SDS-PAGE电泳分析在分子量约24KD处有蛋白质高表达的条带 (图5)。这和预测的表达产物的分子量是一致的。预测的表达产物包括重组多肽的194个 氨基酸、PQE 30质粒上含6个组氨酸标签在内的10个氨基酸以及BamH I酶切位点编码的 2个氨基酸，分子量为23. 8KD。实施例4
重组多肽的Ni2+亲和层析纯化将实例3获得的菌体沉淀，用裂解缓冲液重悬，洗涤两次，最后将菌体用20ml裂解缓冲液重悬于2支50ml离心管中，冰浴中超声裂解菌体(200-300W，超声30秒，停30秒，10 个循环)。，4000 Xg,4°C 20分钟离心，收集超声上清，0. 45um滤膜过滤。每5ml —管超声上 清加入0. 5ml预先处理好的Ni-NTA凝胶，在IOml离心管中室温振荡混合1小时，500rpm， 5分钟离心，去上清。加入IOml洗脱缓冲液1，室温振荡混合10分钟，500rpm, 5分钟离心， 重复洗涤一次，去上清，重复该步骤一次。加入3ml洗脱缓冲液2，室温振荡混合30分钟， 500rpm, 5分钟离心，收集含有纯化重组多肽的洗脱缓冲液，重复洗脱一次。将纯化的重组多 肽收集于3. 5KD孔径的透析袋中，用PH7. 4的磷酸盐缓冲液作为透析外液进行透析，以去除 纯化蛋白中残留的咪唑和Ni2+。共换透析外液10次，4小时/次。将透析后的纯化重组多 肽除菌过滤，冻存。纯化后的重组多肽经SDS-PAGE电泳鉴定后表明，纯度较高，见图6。实施例5重组多肽免疫原性的检测将实例4获得的纯化的重组多肽疫苗与等体积的弗氏完全佐剂充分混合乳化后， 皮下多点注射2Kg左右的健康雄性家兔3只，2ml/只。初次免疫4周和8周后，以同样剂量 抗原，采用不完全弗氏佐剂，皮下多点注射加强两次。在初次免疫前和第一次免疫后每两周 家兔耳静脉采血，获得免疫血清，以检测免疫后抗体滴度的变化，于免疫后12周将免疫家 兔颈总动脉放血处死，大量制备免疫血清。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测免疫的不同时 间点，家兔血清中抗重组多肽疫苗I gG抗体的滴度变化情况。滴度判断为以OD值大于每 只家兔免疫前血清OD值2倍的最高稀释度作为待测血清的滴度。检测结果如表3 表3重组多肽免疫后家兔血清抗重组多肽IgG抗体滴度
时间(周)I #1家兔#2家兔#3家兔
~1 1024001 256001 204800
~~61 2048001 512001 819200
~~81 4096001 204800 1 409600
~101 409600 1 204800 1 409600
~121 409600 1 204800 1 409600滴度变化曲线见图7。从检测结果可以看出，三只家兔经重组多肽免疫后均产生了高滴度的针对重组多 肽的抗体，说明重组多肽有较好的免疫原性。实施例6重组多肽免疫后抗体特异性检测用实例5获得的3只家兔的免疫血清和免疫前血清分别与从中国医学菌种库购买 的A群链球菌Ml型、M3型、M6型、M18型以及M5型(菌种编号分别为32171、32172、32175、 32180、32174)进行间接免疫荧光实验，其中M5型作为阴性对照血清型。将血清从1 50开始对倍稀释至1 6400，将不同稀释度的血清作为一抗分别与5个血清型的A群链球菌进 行反应，37°C，1小时，PH7. 4的磷酸盐缓冲液洗三次；滴加FITC标记的羊抗兔IgG，37°C 30 分钟，PH7. 4的磷酸盐缓冲液洗三次；干燥后，滴加缓冲甘油一滴，加盖玻片封片，荧光显微 镜下，分别用400 X，1000X油镜观察。以每份血清样品与细菌反应后肉眼可见荧光的最高 稀释度作为该血清样品针对该血清型A群链球菌的免疫荧光滴度。从检测结果如表4和图 8所示。表4免疫血清和免疫前血清和不同血清型A群链球菌间接免疫荧光反应的滴度 “_”为间接免疫荧光反应阴性。从检测结果可以看出，三只家兔经重组多肽免疫后均产生了针对A群链球菌Ml、 M3、M6型M蛋白的型特异性抗体。实施例7重组多肽免疫兔血清的体外杀菌抗体实验将实例6中所用的Ml型、M3型、M6型、M18型A群链球菌分别培养于3ml THB培 养基中，37°C静止过夜。取各血清型A群链球菌的隔夜培养菌液0. Iml连续10倍稀释至 10_5，将50ul稀释后的菌液，IOOul实例5获得的3只家兔的免疫血清或免疫前血清(灭活 补体)以及350ul健康成年人抗凝全血(预实验确定该血不含针对实验用血清型A群链 球菌杀菌抗体)充分混合，37°C振荡孵育3小时，每次实验设免疫前血清对照，孵育3小时 后，取50ul孵育混合物涂布兔血琼脂平板，37°C孵育过夜，次日统计每个平板上菌落个数， 若平板上菌落数超过1000个不便准确计数，按1000个计算。计算免疫血清对不同血清型 A群链球菌的杀菌率。按下列公式计算杀菌率杀菌率=(免疫前血清平板菌落数-免疫血清平板菌落数)/免疫前平板菌落 数X 100%检测结果如表5所示表5重组多肽免疫兔血清体外杀菌抗体实验抗体杀菌率 从检测结果可以看出，三只家兔经重组多肽免疫后均产生了针对A群链球菌Ml、 M3、M6型的杀菌抗体。免疫血清杀菌率的条形示意图见图9。以下为本发明专利申请涉及的氨基酸和核苷酸序列表，序列表中各序列依次为序列1 本发明重组多肽的氨基酸序列序列2 本发明重组多肽编码基因序列序列3 =A群链球菌Ml型M蛋白型特异性氨基酸序列的1_50个氨基酸序列4 =A群链球菌M3型M蛋白型特异性氨基酸序列的21_70个氨基酸序列5 =A群链球菌M6型M蛋白型特异性氨基酸序列的1_35个氨基酸序列6 =A群链球菌M18型M蛋白型特异性氨基酸序列的1_45个氨基酸序列7 :A群链球菌Ml型、M3、M6、M18型M蛋白C端共有的一段保守序列序列8 =Overlap-PCR合成重组多肽基因所用寡核苷酸序列1序列9 =Overlap-PCR合成重组多肽基因所用寡核苷酸序列2序列10 =Overlap-PCR合成重组多肽基因所用寡核苷酸序列3序列11 =Overlap-PCR合成重组多肽基因所用寡核苷酸序列4序列12 =Overlap-PCR合成重组多肽基因所用寡核苷酸序列5序列13 =Overlap-PCR合成重组多肽基因所用寡核苷酸序列6序列14 =Overlap-PCR合成重组多肽基因所用寡核苷酸序列7序列15 =Overlap-PCR合成重组多肽基因所用寡核苷酸序列8序列16 =Overlap-PCR合成重组多肽基因所用寡核苷酸序列9序列17 =Overlap-PCR合成重组多肽基因所用寡核苷酸序列10序列表SEQUENCE LISTING<110>武汉生物制品研究所<120> 一种作为A群链球菌四价疫苗保护性抗原的重组多肽<130>/<160>17<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>194<212>PRT
<213> 人工<400>1Asn Gly Asp Gly Asn Pro Arg Glu Val lie Glu Asp Leu Ala Ala Asn151015Asn Pro Ala lie Gln Asn lie Arg Leu Arg His Glu Asn Lys Asp Leu202530Lys Ala Arg Leu Glu Asn Ala Met Glu Val Ala Gly Arg Asp Phe Lys354045Arg Ala Asn Leu Leu Asp Gln Val Thr Gln Leu Tyr Asn Lys His Asn505560Ser Asn Tyr Gln Gln Tyr Ser Ala Gln Ala Gly Arg Leu Asp Leu Arg65707580Gln Lys Ala Glu Tyr Leu Lys Gly Leu Asn Asp Trp Ala Glu Arg Leu859095Leu Gln Glu Leu Arg Val Phe Pro Arg Gly Thr Val Glu Asn Pro Asp100105110Lys Ala Arg Glu Leu Leu Asn Lys Tyr Asp Val Glu Asn Ser Met Leu115120125Gln Ala Asn Asn Asp Lys Leu Ala Pro Leu Thr Arg Ala Thr Ala Asp130135140Asn Lys Asp Glu Leu lie Lys Arg Ala Asn Asp Tyr Glu lie Gln Asn145150155160His Gln Leu Thr Val Glu Asn Lys Lys Leu Lys Thr Asp Lys Glu Gln165170175Leu Thr Lys Glu Ala Ser Arg Glu Ala Lys Lys Gln Val Glu Lys Ala180185190Leu Glu<210>2<211>582<212>DNA<213> 人工<400>2aacggcgatg gtaacccacg cgaagtcatc gaagacctgg ccgccaataa tccggccatc 60cagaacattc gtttacgcca cgaaaacaaa gatctgaaag cacgtctgga aaatgcaatg 120gaggtcgcgg gtcgcgattt caaacgcgca aatttactgg atcaagtgac gcaactgtac 180aacaaacaca atagcaatta tcagcagtac agcgcccagg ccggtcgttt agacctgcgc 240caaaaagcag aatacctgaa aggcctgaat gactgggcgg agcgcttatt acaggagtta 300cgcgtgtttc cacgcggcac ggtcgaaaat ccggacaaag cgcgcgagtt actgaataag 360
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权利要求
一种重组多肽，其特征在于，它具有序列表中序列1所示的氨基酸序列。
2.一种分离的DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的重组多肽。
3.根据权利要求2所述的分离的DNA分子，其特征在于，它具有序列表中序列2所示的 核苷酸序列。
4.将权利要求1所述多肽作为抗原在制备针对A群链球菌疫苗中的应用。
5.一种产生权利要求2或3所述的DNA分子的方法，其特征在于，所有可以得到该DNA 分子的化学合成或各种PCR扩增的方法，用这些方法得到的DNA分子其遗传密码子可以不 同，但最终翻译产物一定含有权利要求1所述的重组多肽的氨基酸序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2或3所述的DNA分子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求8所述的载体。
8.权利要求1所述重组多肽的制备方法，其特征在于，在适合表达所述重组多肽条件 下，培养权利要求8所述的宿主细胞，分离和纯化所述的重组多肽。
9.一种疫苗，其特征在于，它含有权利要求1所述重组多肽以及药学上可以接受的佐剂。
10.根据权利要求9所述的疫苗，其特征在于，它还含有免疫增强剂。
全文摘要
本发明提供了一种通过基因重组技术制备的重组多肽，该重组多肽由我国广东省流行的风湿热原性A群链球菌M1、M3、M6、M18四个血清型的M蛋白N端含保护性抗原表位，不含人体交叉反应表位的型特异性氨基酸序列以及这四个血清型M蛋白C端共有的一段保守氨基酸序列拼接而成的。实验证明，该重组多肽可诱导产生针对A群链球菌M1、M3、M6型的型特异性的杀菌抗体，因而该重组多肽可用于制备针对A群链球菌的重组多肽疫苗。
文档编号C12P19/34GK101845084SQ20091006128
公开日2010年9月29日 申请日期2009年3月27日 优先权日2009年3月27日
发明者全家妩, 喻刚, 杨京生 申请人:武汉生物制品研究所
文档序号 :
【 573029 】
技术研发人员：喻刚,杨京生,全家妩
技术所有人：武汉生物制品研究所
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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