一种荚膜缺失型马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗株及其制备方法
技术领域：
本发明涉及动物疫苗制备技术领域，具体涉及一种荚膜缺失型菌株马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗及其制备方法。
背景技术：
马链球菌兽疫亚种是与动物粘膜和皮肤共生的一种细菌，尤其在马身上较常见，对许多其他种动物可能引起败血症、心内膜炎和关节炎，如牛、猪、羊、狗。在中国，马链球菌兽疫亚种是引起猪链球菌疾病的一个重要的病原体，1975年，在四川爆发猪链球菌流行性疾病，致300000头猪死亡，导致巨大的经济损失。到目前为止，我国养猪行业仍然受到这种疾病困扰。马链球菌兽疫亚种对整个世界养猪行业构成严重威胁，但目前还没有有效的防治方法，因此研制有效疫苗预防马链球菌兽疫亚种感染是非常必要的。然而，关于这种病原的毒性因子研究太少，从而阻碍弱毒疫苗的研发，现有技术中研究较多的只有类M蛋白质(SzP)。最近，有研究者经过敲除编码SzP的基因成功构建了一个马链球菌弱毒疫苗株AATCC35246,并发现可以使得小鼠免受致死性攻击。这一研究成果给链球菌疫苗研究方向提供重要线索，为探索链球菌其他潜在的毒性因子作为弱毒疫苗靶标提供研究方向。马链球菌可以合成由操纵子编码的透明质酸荚膜，通过对链球菌C55138菌株的Aasi 基因经过等位基因置换而使该基因失活，这直接便于研究透明质酸荚膜在该菌的发病机制中扮演的角色，同时研发相关的弱毒疫苗。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种荚膜缺失型菌株马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗。本发明的另一目的是提供上述荚膜缺失型菌株马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗及其制备方法的制备方法。本发明通过以下技术方案实现上述目的
一种荚膜缺失型菌株马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗株，名称为马链球菌兽疫亚种Cbbl^AhasBiStreptococcus equi subsp. zooepi demi cus C55138」Aasi ),本发明中简称为突变菌055138」&^凡于2012年5月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2012164，保藏地址中国.武汉.武汉大学。该突变菌C55138」Aa^由于hasB基因功能缺失而不能正常合成荚膜，马链球菌可以合成由操纵子编码的透明质酸荚膜，而研究发现透明质酸荚膜在猪链球菌疾病的发病机制中扮演重要角色，因此这种荚膜缺失型突变菌会大大降低菌株本身的毒性。上述荚膜缺失型马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗株的制备方法，将hasB基因上下游各取部分基因连接到质粒pG+host5上，得到载体认AImsB,转化马链球菌兽疫亚种C55138，利用同源重组原理将马链球菌兽疫亚种C55138基因组中的hasB基因缺失，构建成荚膜缺失型突变菌C55138」Aa^。作为一种优选方案，上述荚膜缺失型马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗株的制备方法具体步骤如下
(1)以马链球菌兽疫亚种C55138的基因组DNA为模板，SEQID NO: Γ2所示核苷酸序列为引物，PCR扩增hasBL基因片段；
(2)以马链球菌兽疫亚种C55138的基因组DNA为模板，SEQID N0:3 4所示核苷酸序列为引物，PCR扩增hasBR基因片段；
(3)将所得的hasBL基因片段和hasBR基因片段连接入质粒pG+hoSt5中，转化马链球菌兽疫亚种C55138，构建成荚膜缺失型马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗株。
上述荚膜缺失型马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗株在制备疫苗中的应用。一种马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗的制备方法，具体步骤如下
Cl)马链球菌兽疫亚种C55138」Aa^复苏于TSB中，37°C摇床培养过夜；
(2)取培养过夜的菌种于新的TSB中，37°C摇床扩大培养6 8h；
(3)经扩大培养的菌液在8000rpm条件下离心3min,去上清；
(4)沉淀中的细菌与灭菌的20wt.%脱脂乳混合，冷冻干燥，制备成冻干活疫苗。该冻干活疫苗可以在_20°C低温冰箱中保存。上述TSB为大豆酪蛋白消化液培养基，可购买已有产品(0X0ID，CM0129)，配方为胰蛋白胨I. 5% (g/100mL)，大豆蛋白胨O. 5% (g/100mL)，氯化钠O. 5% (g/100mL)，加蒸馏水配制而成，调节PH值为7.2±0.2，经121°〇压力蒸汽灭菌后使用。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
该马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗具有以下优点一、制作工艺简单，疫苗菌株可大量培养，成本低，周期短，能在全世界推广使用；二、既表现细胞免疫又有体液免疫；三、用量小，安全性高，毒力小，使用方便。本发明采用基因工程技术构建荚膜缺失链球菌菌株C55138』AasA此菌株毒力减弱。实验已证明该突变株对小鼠是无毒性的，用其免疫小鼠，小鼠100%得到保护。
图I.基因在马链球菌兽疫亚种C55138菌株的位点和基因片段，箭头表示合成基因片段的长度和转录方向。图2.构建缺失型基因载体的方法和原理不意图。图3.用PCR和RT-PCR的方法鉴定突变菌C55138Mai的构建结果电泳图，WT为野生型，AhasB为突变菌。图4.透射电子显微镜观察野生菌株和突变菌株的结果图，WT为野生型菌株，荚膜厚而致密，AhasB为缺突变菌株C55138Mai，荚膜缺失。图5. BALB/c小鼠经过腹腔注射野生菌和突变菌C55138Mai之后的生存曲线。图6.使用C55138Mai突变菌、灭活的野生菌疫苗(阳性对照)、佐剂(阴性对照)、PBS (空白对照)分别免疫小鼠，然后使用野生菌对四组小鼠分别进行攻毒，攻毒的小鼠持续观察12天，每组小鼠存活率。
图7.使用突变菌C55138Mai免疫小鼠后通过定量PCR的方法检测到的免疫小鼠脾脏细胞IFN- Y和IL-4的mRNA水平。
具体实施例方式实施例I突变菌株C55138Mai的构建
I.材料马链球菌兽疫亚种C55138，购自中国兽药监察所。质粒pG+hoSt5购自Appligene 公司(Illkirch, France)。2.引物的设计合成
马链球菌兽疫亚种C55138 (简称菌株C55138)的基因组结构见附图I所示，以菌株C55138基因组DNA为模板，使用Primer Premier5. O设计扩增目的片段Aai基因的引物，其中hasBL引物对含有限制性内切酶fe7I和feMlI的酶切位点，hasBR引物对含有和&0RI的酶切位点。引物由上海生工合成。 hasBLl :5’ -ATTTCTGTCGACGGCTCAGGATA-3’ (SEQ ID NO:I)；hasBL2 :5’ -AATGGATCCTGACGCATTTAGGT-3’ (SEQ ID N0:2)；hasBRl :5’ -AACCATTACAATAACGGATCCTTTG-3’ (SEQ ID N0:3)；hasBR2 :5’ -ACAACCCTGTAGCGAATTCCCTC-3’ (SEQ ID N0:4)；
3. PCR扩增目的基因 hasBL基因片段扩增体系(30 μ L) ddH2017. 8μ L
IOXbuffer3. O μ L
Mg2+l.OyL
dNTP3· O μ L
hasBLlI. 5 μ L
hasBL2I. 5 μ L
DNA 模板2· O μ L
rTaq 酶O. 2 μ L
PCR 扩增反应条件95°C 5min，一次；94°C lmin,55°C 45s, 72°C 45s，共 30 个循环；72°C 5min，一次。得到hasBL基因片段扩增产物。hasBR基因片段的扩增体系(30 μ L) ddH2017. 8μ L IOXbuffer 3. O μ L
Mg2+l.OyL
dNTP3· O μ L
hasBRlI. 5 μ L
hasBR2I. 5 μ L
DNA 模板2· O μ L
rTaq 酶O. 2 μ L
条件95°C 5min，一次；94°C lmin,55°C 45s, 72°C 45s，共 30 个循环；72°C 5min，一次。得到hasBR基因片段扩增产物。
4.荚膜缺失菌的构建
使用菌株C55138基因组作为模板，步骤3方法扩增得到的hasBL基因片段扩增产物以及质粒pG+host5用限制性内切酶fe7I和消化，消化产物用T4连接酶连接，得到中间重组质粒，该质粒与hasBR基因片段扩增产物再使用限制性内切酶和&0RI消化，消化产物用T4连接酶连接，得到的终产物即为重组质粒pGMai (见附图2)。沐MasB经过电转化进入马链球菌兽疫亚种C55138，28°C红霉素平板上筛选阳性克隆(抗红霉素的克隆，因为pG+host5有红霉素抗性)。阳性克隆转接TSB培养基后生长到对数期时用不含有红霉素的TSB培养基稀释后在28°C生长到对数初期。把培养瓶转移至37°C孵育4h。随后，把细菌均匀涂布在TSA平板上37°C生长，挑选红霉素敏感克隆用PCR鉴定。鉴定正确的重组克隆标记为突变菌Mai，于TSB中37°C摇床培养，得到一定浓度菌液后，_80°C冰箱保存。5.荚膜缺失型突变菌的鉴定
分别以野生型马链球菌兽疫亚种C55138 (用WT表示)和步骤4构建的突变菌ShasB(用 AAai 表示)为模板，AhasBl、AhasB2 为引物(AhasBl :ATACGATAACCTTTACCCAAGTCG，SEQID NO: 5 ；AhasB2: AGGTATTCGCAAATAGCTTGACC, SEQ ID NO: 6)，常规 RT-PCR 的方法获得目的片段，电泳结果(见附图3)。WT泳道扩增出200bp左右的目的片段，而突变菌Mai和阴性对照的泳道未扩增出目的片段。然后，分别以野生菌C55138与突变菌tshasB的基因组DNA为模板，hasBLl、hasBR2为引物进行PCR扩增，扩增产物的电泳结果见(见附图3)。WT泳道扩增出1200bp左右的目的片段，突变菌MiasB的泳道扩增出800bp左右的目的片段。综合RT-PCR与PCR的实验结果，可以表明突变菌株Mai的Aai基因缺失了400bp左右的基因片段，突变菌株Mai构建成功，命名为C55138Mai，保藏于中国典型培养物保藏中心。6.透射电子显微镜观察菌株胞外荚膜
菌株C55138及突变菌株ShasB样品经过负染，通过透射电镜，放大15500 X，加速电压为80kV观察细菌荚膜。观察结果(见附图4):与野生菌相比，突变菌C55138」Aa^的荚膜缺失。实施例2小鼠毒力实验
20只4 6周龄BALB/c小鼠，随机分为2组，一组注射野生菌C55138，另一组注射突变菌C55138Ma·^,用于对比两种菌株的毒力大小。细菌使用PBS重悬后，菌液适当稀释到I X IO5 CFU/mL,小鼠腹腔注射500 μ L，观察小鼠存活状态，记录小鼠的死亡时间，并对结果进行分析，小鼠持续观察12天。实验结果见图5 :野生菌一组的小鼠9天内死亡率达80%，并表现严重的临床症状，突变菌C55138」fei —组小鼠12天内100%存活，且没有任何临床症状。实验结果表明突变菌的毒力显著下降。实施例3突变菌ZlAasS主动免疫保护实验
把40只4飞周龄雌性BALB/c小鼠随机分为4组，每组10只。第I组小鼠，第一次腹腔注射500 μ L突变菌C55138」fei进行免疫，菌液浓度为2X 106CFU/mL，14天后以同样的剂量再次免疫；第2组小鼠作为阳性对照以同样的方法注射甲醛灭活的疫苗进行免疫，该灭活苗是灭活野生菌与弗氏佐剂乳化的灭活疫苗，第一次腹腔注射500 μ L，后续免疫为每2周I次。第3组小鼠使用相同的弗氏佐剂乳化的PBS以同样的方法注射小鼠作为阴性对照，第4组小鼠使用PBS以同样的方法注射小鼠作为空白对照。四组小鼠全部免疫完成后，每组小鼠腹腔注射致死剂量的野生菌C55138，观察每组小鼠的存活率，并记录结果。
实验结果见图6 :由于没有疫苗的免疫保护，第3组与第4组小鼠在接入致死剂量的野生菌后，5天内全部死亡。第2组小鼠在野生菌灭活疫苗的免疫保护下，存活率达80%。第I组小鼠得到突变菌株C55138」Aa^的免疫保护，直到研究结束小鼠存活率为100%。除此之外，所有阴性对照和空白对照的小鼠都表现出明显的临床症状，例如被毛粗糙零乱，刺激反应迟缓等现象，然而使用突变菌C55138」Aa^免疫的小鼠没有表现任何临床症状。实验结果表明突变菌C55138」Aa^的免疫效果比野生菌灭活疫苗的免疫效果好，经过突变菌055138/1如^免疫过的小鼠抵抗力强，再次受到野毒感染后保护率达到
100% ο实施例4诱导免疫反应类型
T细胞群由两个亚群组成，分别是Thl亚群和Th2亚群。Thl亚群表达IFN-Y，能够激活K细胞的细胞毒作用，引起迟发型超敏反应，介导细胞免疫反应。Th2亚群表达IL-4，促进抗体的产生，引起体液免疫。小鼠经突变菌C55138」Aa^免疫后，可以通过检测小鼠脾脏细胞内IFN-Y和IL-4的mRNA水平间接评价这两个细胞亚群的活性。6只BALB/c小鼠随机分为两组，一组腹腔注射I X IO6 CFU/mL突变菌ChhUSAhasB,另一组注射PBS，剂量都为O. 5mL。注射96h后，对每只小鼠的脾脏细胞分别提取RNA。使用定量PCR的方法鉴定IFN-Y和IL-4的转录水平。实验结果定量PCR分析结果显示免疫后96小时的小鼠脾脏细胞中的IL-4和IFN-y mRNA水平显著增加。除此之外，IFN-Y的mRNA水平显著高于IL-4的mRNA水平(见附图7)。实验结果表明突变菌株Zlfei可以激活小鼠体内Thl和Th2两个细胞群的免疫反应，同时表现细胞免疫和体液免疫，并且细胞免疫水平显著高于体液免疫水平。
权利要求
1.一种荚膜缺失型马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗株，名称为马链球菌兽疫亚种C55138」Aasi {.Streptococcus equi subsp. zooepidemicus C55138」Aasi ), 2012 年 5 月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2012164。
2.权利要求I所述荚膜缺失型马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗株的制备方法，其特征在于^hasB基因上下游各取部分基因连接到质粒pG+hoSt5上，得到载体揭asB，转化马链球菌兽疫亚种C55138，利用同源重组原理将马链球菌兽疫亚种C55138基因组中的hasB基因缺失，构建成荚膜缺失型突变菌C55138zlAa^。
3.根据权利要求2所述荚膜缺失型马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗株的制备方法，其特征在于步骤如下 Cl)以马链球菌兽疫亚种C55138的基因组DNA为模板，SEQ ID ΝΟ:1 2所示核苷酸序列为引物，PCR扩增hasBL基因片段； (2)以马链球菌兽疫亚种C55138的基因组DNA为模板，SEQID NO:3 4所示核苷酸序列为引物，PCR扩增hasBR基因片段； (3)将所得的hasBL基因片段和hasBR基因片段连接入质粒pG+hoSt5中，转化马链球菌兽疫亚种C55138，构建成荚膜缺失型马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗株。
4.权利要求I所述荚膜缺失型马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗株在制备疫苗中的应用。
5.一种马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗的制备方法，其特征在于步骤如下 Cl)马链球菌兽疫亚种C55138」Aa^复苏于TSB中，37°C摇床培养过夜； (2)取培养过夜的菌种于新的TSB中，37°C摇床扩大培养6 8h； (3)经扩大培养的菌液在8000rpm条件下离心3min,去上清； (4)沉淀中的细菌与灭菌的20wt.%脱脂乳混合，冷冻干燥，制备成冻干活疫苗。
全文摘要
本发明公开了一种荚膜缺失型马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗株及其制备方法，属于动物疫苗制备技术领域。本发明的荚膜缺失型马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗株命名为马链球菌兽疫亚种C55138 hasB(Streptococcusequisubsp.zooepidemicusC55138 hasB)，于2012年5月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2012164。该菌株是通过等位基因置换导致hasB基因失活构建而成，毒力减弱，可用于制备马链球菌疾病的疫苗。疫苗制作工艺简单，疫苗菌株可大量培养，成本低，周期短；既表现细胞免疫又有体液免疫；用量小，安全性高，毒力小，使用方便，能在全世界推广使用。
文档编号C12N1/21GK102719389SQ20121017308
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月30日 优先权日2012年5月30日
发明者付强, 刘小红, 莫德林, 陈瑶生, 魏子贡 申请人:中山大学
文档序号 :
【 410935 】
技术研发人员：陈瑶生,魏子贡,付强,刘小红,莫德林
技术所有人：中山大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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技术研发人员：陈瑶生,魏子贡,付强,刘小红,莫德林
技术所有人：中山大学
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