一种鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株筛选方法，具体涉及脉冲场凝胶电泳技术在鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株筛选中的应用。
背景技术：
链球菌病是目前对鱼类养殖危害最为严重的病害之一，每年给世界鱼类养殖业造成巨额经济损失。我国是水产养殖大国，每年因链球菌病给水产养殖造成的直接经济损失约在10亿美元。我国是罗非鱼养殖第一大国，年产量占世界总产量50%以上。2001年开始，中国罗非鱼养殖陆续出现了链球菌病的感染，并在个别养殖场造成了 30% 50%的高死亡率。2009 2011连续3年，链球菌病在中国罗非鱼养殖大面积暴发流行，发病区域逐年扩大、发病率和死亡率逐年递增，易感罗非鱼规格范围逐年扩大(陈明等，2012;卢迈新 等，2010 ;祝璟琳等，2010 ;周素明，2008)。按2010年我国罗非鱼产量计算，估计链球菌病给我国罗非鱼产业造成的直接经济损失就高达4亿美元。病害的暴发与随之带来的产品安全问题已成为制约罗非鱼产业发展的瓶颈。目前缺乏一套行之有效的方案预防和治疗该病，药物只能在早期起到控制病情的辅助性作用，但随着耐药和抗药性的产生和积累，该病的现状几乎是“无药可治可防”。疫苗免疫是预防和控制罗非鱼等鱼类链球菌病最具前景、安全和环保的方法之一。自1995年以色列学者Eldar A报道通过免疫接种预防罗非鱼链球菌病(S. difficile)开始，美国(Klesius 等，1999 ；Pridgeon 等，2011)、中国(Sun 等,2010)、日本(Dumrongphol等，2009)和韩国(Shin等，2007)等国家多个实验室先后开展了罗非鱼链球菌疫苗的研究，并在试验室均取得很好的免疫效果。由于疫苗的临床应用效果不理想，研制的疫苗至今未能实现在罗非鱼主要要养殖国家或地区使用。生产应用免疫失败的主要原因是对目前广泛存在的罗非鱼链球菌流行菌株的免疫原性不清楚，并且研究已证实罗非鱼链球菌病流行菌株的种间和型间不存在交叉免疫保护(Evans等，2004 ；Bachrach等，2001)。因此，对流行菌株的鉴定与分型研究，并通过对各型菌株免疫原性进行分析筛选疫苗候选菌株或菌株组合，成为罗非鱼等鱼类链球菌疫苗研发与生产应用的重要前提。目前常用的生化指标、血清型分析、16SrRNA(核糖体核糖核酸)序列分析和MLST (多位点序列分析)等技术方法均不能很好的对罗非鱼等鱼类链球菌流行菌株进行分型。血清型方法只能将罗非鱼无乳链球菌病流行菌株分为两个血清型(Ia和III)或两个分子血清型(Eldar 等，1994 ；Suanyuk 等，2008 ；Ye 等，2011)。同样，用 ISR-SSCP (间隔区-单链构象多态性)方法对科威特所有分离菌株分型只获得一个基因型，而利用APLP (随机扩增长度多态性)方法对科威特所有分离菌株分型也只获得两个基因型(Olivares-Fuster等，2008)。使用MLST对中国分离获得无乳链球菌菌株进行分型，只获得ST-7 (序列型-7)一个基因型(Ye等,2011)。脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,简称PFGE)基于菌株的DNA指纹原理对病原菌进行分型，具有分型能力强、结果易判断和重复性好等优点，在分子流行病学研究中被广泛应用。同时，研究证明PFGE分型方法对人源无乳链球菌分型比传统血清型分型方法更细，相同PFGE基因型为同一血清型，但同一血清型菌株可分为多个PFGE基因型(Skjaervold等，2004 ;Pillai等，2009)。但利用PFGE技术对罗非鱼等鱼类链球菌病流行菌株进行分型，并探索流行菌株PFGE基因型与其免疫原性的关系，进而筛选罗非鱼等鱼类无乳链球菌病疫苗候选菌株或菌株组合，目前尚未见报道。
发明内容
针对鱼类无乳链球菌疫苗研发和生产应用存在的困难，本发明主要解决的问题是提供一种鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株筛选方法，用于指导疫苗的研发与生产应用。本发明采取的技术方案是鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株的筛选方法，包括(I)鱼类链球菌病流行菌株分离与保种；(2)鱼类无乳链球菌病流行菌株鉴定与病原库建立；(3)鱼类无乳链球菌病流行菌株PFGE基因型分析；(4)各PFGE基因型代表菌株毒力测定；(5)各PFGE基因型代表菌株免疫原性和保护范围测定。应用PFGE技术对鱼类无乳链球菌流行菌株进行基因型分析，根据分型结果比较不同PFGE基因型流行菌株免疫原性和保护范围获得鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株或菌株组合。采用PFGE技术对鱼类无乳链球菌流行菌株进行基因型分析，通过比较菌株PFGE基因型与其免疫原性对应关系，证实PFGE分型技术可用于指导鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株的筛选及疫苗生产应用。(一 )鱼类链球菌病流行菌株分离与保种采用现场分离和实验室分离获得病鱼链球菌病流行菌株。现场分离直接在发病养殖场对疑似链球菌病鱼或病死鱼进行细菌分离。实验室分离通过氧气袋充氧运输疑似链球菌病鱼或冷冻运输疑似链球菌病死鱼至实验室，在洁净操作台进行细菌分离。接种部位或组织脑、肝、肾、脾、心脏、血液、鳍部等。鱼体规格满足接种条件的鱼体均可进行接种(大于10克)。接种与保存方法对病鱼或者病死鱼进行解剖，按常规方法划线接种于血平板上，28°C培养24h ;细菌生长至一定程度挑取单菌落于TSB(胰胨大豆蛋白胨)液体培养基中扩大培养24h，菌液革兰氏染色显微观察确定无污染；取0. 8ml菌液，加入0. 2ml甘油后充分混匀，于_80°C冷冻保存。(二)鱼类无乳链球菌病流行菌株鉴定与病原库建立I、鱼类无乳链球菌病流行菌株鉴定采用肉眼及显微观察、生化鉴定、二重PCR(聚合酶链式反应)等方法对分离的临床菌株进行鉴定。肉眼及显微观察肉眼观察细菌在血平板上的溶血特征、轮廓形状；菌液状态及颜色变化；染色后通过油镜观察细菌形状、排列特点、染色特征等；进而对临床菌株进行初步鉴定。生化鉴定利用法国生物梅里埃公司API鉴定系统进行细菌鉴定。二重PCR=PCR引物参考黎炯(2010)和Zlotkin等(1998)公开发表论文。无 乳链球菌(S. agalactiae)特异性引物为 Hl 5，-AAGCGTGTATTCCAGATTTCCT-3，和 H25’ -CAGTAATCAAGCCCAGCAA-3’，特异性扩增片段大小为474bp ;海豚链球菌(S. iniae)特异性引物为 P15' -CTAGAGTACACATGTACTTAAG-3'和 P2 5’ -GGAITTTCCACTCCCATTAC-3'，特异性扩增片段大小为474bp。DNA抽提试剂盒和PCR反应试验盒均为中国大连TaKaRa公司产品，按试剂盒说明书进行PCR特性性扩增。PCR体系如下10XEx TaqBuffer (Mg2+) 5. O u L, dNTP 2. O u L,H1,H2,P1 and P2 引物各 2. O y L，2. O y I DNA 模板(大约 50ng) ,l.OuL Takara Ex Taq (5U/ u L), 32. 0 u L ddH20,总体积 50 u L ；PCR 反应在在美国ABI公司的GeneAmp PCR system9700进行；PCR反应程序第一步,94°C, 5min ;第二步，94 °C，30sec, 58 V，30sec, 72 °C，45sec, 35 个循环；第三步，72 V，IOmin ；1. 2% 琼脂糖凝胶电泳，GeneGreen(核酸染料)染色，凝胶成像系统拍照。每次PCR设阳性和空白对照。2、鱼无乳类链球菌病原库建立通过对各地疑似链球菌病发病鱼进行细菌分离鉴定，并对鉴定为无乳链球菌的菌株进行整理归档，记录每株细菌的相关信息(时间、地点、采样组织及鉴定结果等)，建立鱼类无乳链球菌病病原库。(三)鱼类无乳链球菌病流行菌株PFGE基因型分析 胶块制备将实验菌株在5%血平板上培养24h后，刮取培养基上新鲜培养物，制备细胞悬浮液；加入30ii L溶菌酶(10mg/mL)37°C水浴lOmin，再加入15 y L蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀，然后加入150 ii L已经溶化的56°C 1% SeaKem Gold (低熔点琼脂糖)(含I % SDS十二烷基硫酸钠)，制成胶块。细胞裂解将胶块放入5mL细胞裂解液中(含25yL蛋白酶K)，在54°C水浴摇床中孵育2h，转速约160rpm。胶块洗涤15mL的50°C纯水洗涤15min，重复洗2次；之后加入50°C TE，洗涤15min,重复洗3次，加入5mL TE，继续酶切或置4°C保存备用。胶块内DNA酶切用刀片切下2mm宽的胶块放入150 U L酶切缓冲液(116 y L纯水+15 u L T Buffer+15u L BSA(牛血清白蛋白)+4 y L SmaI)，在37°C水浴中孵育4h以上。电泳电泳时间为21h，电压为6V，角度为120°，始末脉冲时间为4. Os 40s。染胶和图像的获取电泳结束后，凝胶用0. I u g/mL的Gel-red(核酸染料)染色30min,纯水脱色60min,在凝胶成像仪中读取图像。聚类分析应用BioNumerics数据库软件进行处理，识别图像条带；选择UPGMA(分析方法)方法进行聚类分析；按照PulseNet (实验室分子分型监测网络)的命名原则，对每一种不同的带型进行命名。(四)、各PFGE基因型代表菌株毒力测定各PFGE基因型菌株经TSB扩大培养24h，测定菌液浓度为菌株半数致死量的50-100倍(IX IO8CFU (菌落形成单位)/尾);攻毒组每尾鱼腹腔注射0. 2mL菌液，对照组腹腔注射0. 2mL灭菌TSB，每个试验组设2个平行组，每组20尾；正常饲喂，每天记录死鱼尾数，连续观察记录15天；统计每个试验组的死亡率，测定各PFGE基因型代表菌株毒力。(五)、各PFGE基因型代表菌株免疫原性和保护范围测定I、无乳链球菌水剂灭活疫苗制备从-80°C冰箱取出保存的无乳链球菌菌种接种于血平板，28°C培养24h，挑取单菌落于IOmL TSB培养基28°C，120rpm振荡培养24h ;革兰氏染色镜检无污染后加入到IOOmLTSB培养基28°C，120rpm振荡培养24h，铺板计数方法对培养菌液进行细菌计数；革兰氏染色镜检无污染后加入甲醛进行灭活，使其最终浓度为0. 25%，120rpm，28°C振荡24h灭活；菌液IOOOOg离心lOmin，分别收集菌体和上清；上清使用IOkDa (千道尔顿)超滤膜5倍体积超滤浓缩；按菌体上清浓缩液体积比为16mL IL的比例混合制备疫苗，结合平板计数和0D600测定结果，调整疫苗浓度为2. 5 X IO9ceIls (细胞)/mL ;铺血平板检测疫苗是否完全灭活。2、各PFGE基因型代表菌株型内免疫保护试验按上述疫苗制备方法分别将各PFGE基因型代表菌株制备成灭活疫苗并通过腹腔注射免疫鱼；免疫15天后，每个试验组选择1-4株相同PFGE基因型菌株(其中I株为同源菌株，即疫苗菌株本身；其它均为异源菌株)进行腹腔注射感染，每个菌株感染试验组设2个平行组，每组15尾；感染后正常饲喂，每天记录死鱼尾数，连续观察记录15天；计算各组的免疫相对保护率，比较疫苗对同PFGE型内同源或异源菌株免疫原性差异。3、疫苗候选菌株第I轮筛选根据各PFGE基因型代表菌株型内免疫保护试验结果证实，各代表菌株制备的疫苗对基因型内同源或异源菌株具有相同免疫保护率，因此设计该试验进行疫苗候选菌株第I轮筛选；利用各PFGE型代表菌株制备的疫苗分别通过腹腔注射免疫鱼；免疫15天后，利用所有PFGE型代表菌株的混合菌液对免疫鱼进行腹腔注射感染；每个试验组设2个平行组，每组15尾；感染后正常饲喂，每天记录死鱼尾数，连续观察记录15天，计算各PFGE型代表菌株制备的疫苗对所有基因型代表菌株混合菌液感染的免疫保护率，筛选获得免疫效果较好的疫苗候选菌株。4、疫苗候选菌株第2轮筛选通过免疫保护试验对第I轮筛选获得的疫苗候选菌株进行免疫保护范围的测定；将筛选获得的疫苗分别通过腹腔注射免疫鱼；免疫15天后，利用所有PFGE基因型代表菌株分别对免疫鱼进行腹腔注射感染；每个试验组设2个平行组，每组15尾；感染后正常饲喂，每天记录死鱼尾数，连续观察记录15天，计算所选疫苗对各PFGE基因型代表菌株的免疫保护率，分析各疫苗的免疫保护范围；根据免疫保护率和免疫保护范围选择疫苗候选菌株。
5、疫苗候选菌株组合免疫根据上述两轮筛选试验选择免疫保护率较好，免疫范围较广，并可交叉弥补的疫苗进行组合，通过腹腔注射免疫鱼；免疫15天后，利用所有PFGE基因型代表菌株及其混合菌液分别对免疫鱼进行腹腔注射感染；每个试验组设2个平行组，每组15尾；感染后正常饲喂，每天记录死鱼尾数，连续观察记录15天，计算各组合免疫组对各PFGE基因型代表菌株及其混合菌液的免疫保护率，分析各组合免疫的免疫保护范围；根据免疫保护率和免疫保护范围选择较好的菌株组合。本发明与现有技术对比其特点在于I、本发明采用PFGE技术对鱼类无乳链球菌流行菌株进行基因型分析，通过比较菌株PFGE基因型与其免疫原性对应关系，证实PFGE分型技术可用于指导鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株的筛选及疫苗生产应用。2、本发明通过利用PFGE技术与动物免疫保护试验对本实验室建立的我国罗非鱼无乳链球菌病原库菌株进行了基因型与免疫原性分析，获得了免疫保护率高、保护范围较广的疫苗候选菌株和菌株组合。、
本发明技术具有针对性强、筛选效率高，效果明显等特点，筛选获得的我国罗非无乳链球菌病疫苗候选菌株组合可保护病原库90% (9/10)的基因型和96. 47% (82/85)流行菌株。该技术为鱼类链球菌病疫苗候选菌株筛选提供了一种新的方法，适宜在鱼类链球菌病疫苗候选菌株的筛选，对鱼类链球菌病的免疫防控、对鱼类无乳链球菌病疫苗研发和生产应用具有重要的指导意义和应用价值。
图I : 二重PCR快速检测鱼类无乳链球菌和海豚链球菌。1-6泳道分别为海豚链球菌(ATCC29178)和无乳链球菌(ATCC27956)、海豚链球菌(ATCC29178)、无乳链球菌(ATCC27956)、停乳链球菌(NCTC4335S)、副乳房炎链球菌(MCCCA01039)、格氏乳球菌(MCCCA07812)标准菌株；7_19泳道分别为罗非鱼无乳链球菌病流行菌株各PFGE型代表菌株FJ005，⑶009，⑶024，⑶008，FJ007,⑶022，HNO16, GX042,ffl)004，GX032，GX005，GX022，GX009 ;20泳道为空白对照；M表示DL 2000DNA分子量标准，从上到下分子量分别为 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp 和 lOObp。 图2 :中国罗非鱼链球菌流行菌株分布情况。图3 :罗非鱼无乳链球菌病流行菌株PFGE分型结果(总图)，图中虚线位置分别为图2-1与图2-2、图2-2与图2-3分割位置；图3-1 :罗非鱼无乳链球菌病流行菌株PFGE分型结果，PFGE基因型C、D ；图3-2 :罗非鱼无乳链球菌病流行菌株PFGE分型结果，PFGE基因型B、H、E、F ;图3-3 :罗非鱼无乳链球菌病流行菌株PFGE分型结果，PFGE基因型A、G、I、J。图4 :疫苗%、VB、Vd的免疫保护范围。
具体实施例方式下面以我国罗非鱼无乳链球菌疫苗候选菌株筛选为例，结合附图，对本发明的技术应用进行详细叙述一、我国罗非鱼链球菌病流行菌株分离与保种采用野外现场分离和实验室分离获得我国罗非鱼链球菌病流行菌株。野外分离2006 2011年，本实验室人员分别到广东省的湛江、茂名、化州、高州、阳江、珠海、阳春、高要、广州、清远、惠州、汕头12市，广西省的南宁、北海、玉林、钦州、百色、柳州6市，海南省海口、琼海、澄迈、临高、文昌5市，福建漳州市及云南罗平县的罗非鱼发病养殖场进行链球菌现场分离。发病罗非鱼均出现链球菌病的典型症状，如鳃和鳍条出血、游姿失衡、体色发黑、肠道出血等。通过细菌接种环对病鱼脑、肝、肾、脾或鳍部进行细菌血平板划接种分离，28°C培养24h。挑取单菌落于TSB液体培养基扩大培养24h，镜检无污染后，取0. 8ml菌液，加入0. 2ml甘油后充分混匀，于_80°C冷冻保存。实验室分离2006 2011年,养殖户使用氧气袋充氧运输发病罗非鱼或冷冻运输病死鱼至实验室对病鱼或病死鱼进行细菌分离，方法同上。二、我国罗非鱼链球菌病流行菌株鉴定与病原库建立 I、罗非鱼链球菌鉴定采用肉眼及显微镜观察、生化和PCR方法对分离的流行菌先生进行鉴定。
肉眼及显微观察肉眼观察罗非鱼无乳链球菌病在血平板上生长为白色、P溶血菌落，菌落呈圆形且轮廓平滑。接种于TSB液体培养基28°C培养12h后，原清澈透明的培养基逐渐变浑浊至不透明。革兰氏染色后显微镜油镜观察革兰氏染色呈阳性，菌体为球形、多呈链状排列。通过肉眼及显微观察可初步鉴定为罗非鱼链球菌。生化鉴定使用接种环挑取纯化后在固体培养基上生长的单菌落，然后接种于IOmL的TSB液态培养基28°C，120rpm振荡培养24h。利用法国生物梅里埃公司API鉴定系统进行细菌鉴定，绝大部分流行菌株可鉴定到种。二重PCR快速检测PCR引物参考黎炯(2010)和Zlotkin等(1998)公开发表论文。无乳链球菌(S. agalactiae)特异性引物为 Hl 5，-AAGCGTGTATTCCAGATTTCCT-3，和H25’ -CAGTAATCAAGCCCAGCAA-3’，特异性扩增片段大小为474bp ;海豚链球菌(S. iniae)特异性引物为 P15' -CTAGAGTACACATGTACTTAAG-3'和 P2 5’ -GGAITTTCCACTCCCATTAC-3'，特异性扩增片段大小为474bp。PCR反应产品为中国大连TaKaRa公司PCR试剂盒，PCR体系如下10XEx Taq Buffer (Mg2+) 5. 0 u L, dNTP 2. 0 u L,H1,H2,P1 and P2 引物各 2. OyL， 2.Ou I DNA 模板(大约 50ng) ,l.OuL Takara Ex Taq (5U/ u L), 32. 0 u L ddH20,总体积50 ii L ;PCR反应在在美国ABI公司的GeneAmp PCR system 9700进行；PCR反应程序第一步，94°C，5min ;第二步，94°C，30sec, 58°C，30sec, 72°C，45sec, 35 个循环；第三步，72°C，IOmin ；1. 2%琼脂糖凝胶电泳，GeneGreen染色,凝胶成像系统拍照。每次PCR设阳性和空白对照。2、罗非鱼链球菌病原库建立通过对我国罗非鱼主要养殖区链球菌发病罗非鱼的细菌分离与鉴定，共从广东、海南、广西、福建和云南5省的26个市，98个罗非鱼养殖场分离获得142株罗非鱼链球菌病流行菌株(菌株分布见附图2)，实验室有针对性的选择了 105株进行了 PCR鉴定和PFGE基因型分析(见表I)。通过电脑对鉴定鉴定的链球菌菌株进行整理归档，记录每株细菌的相关信息(时间、地点、采样组织及鉴定结果等)，建立罗非鱼无乳链球菌病病原库。该病原库菌株来源年份为2006-2011年，菌株分布区域的罗非鱼养殖量和产量约占中国罗非鱼总量的90%以上。因此，该病原库菌株可以代表中国近6年罗非鱼链球菌流行菌株特点。表I我国罗非鱼链球菌病原库部分菌株信息表
权利要求
1.一种鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株筛选方法，其特征在于它的技术内容包括 (1)鱼类链球菌病流行菌株分离与保种； (2)鱼类无乳链球菌病流行菌株鉴定与病原库建立； (3)鱼类无乳链球菌病流行菌株PFGE基因型分析； (4)各PFGE基因型代表菌株毒力測定； (5)各PFGE基因型代表菌株免疫原性和保护范围測定； 应用PFGE技术对鱼类无乳链球菌流行菌株进行基因型分析，根据分型结果比较不同PFGE基因型流行菌株免疫原性和保护范围获得鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株或菌株组合。
2.根据权利要求I所述的鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株筛选方法，其特征是采用PFGE技术对鱼类无乳链球菌流行菌株进行基因型分析，通过比较菌株PFGE基因型与其免疫原性对应关系，证实PFGE分型技术可用于指导鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株的筛选及疫苗生产应用。
全文摘要
本发明公开了一种鱼类无乳链球菌疫苗候选菌株筛选方法，通过该方法对罗非鱼无乳链球菌病流行菌株分离与保种、流行菌株鉴定与病原库建立、流行菌株PFGE基因型分析、各PFGE基因型代表菌株毒力测定、各PFGE基因型代表菌株免疫原性和保护范围测定，筛选获得了可用于我国罗非鱼无乳链球菌病免疫预防的疫苗候选菌株和菌株组合。该技术具有针对性强、筛选效率高，效果明显等特点，筛选获得的我国罗非无乳链球菌病疫苗候选菌株组合可保护病原库90％的基因型和96.47％流行菌株。该技术为鱼类链球菌病疫苗候选菌株筛选提供了一种新的方法，适宜在鱼类链球菌病疫苗候选菌株的筛选，对鱼类链球菌病的免疫防控具有重要意义和应用价值。
文档编号C12R1/46GK102676683SQ20121017562
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者李健, 李莉萍, 梁万文, 王瑞, 甘西, 罗永巨, 陈明, 陈福艳, 雷爱莹, 黄婷 申请人:广西壮族自治区水产研究所
文档序号 :
【 411024 】
技术研发人员：陈明,王瑞,李莉萍,甘西,梁万文,黄婷,雷爱莹,罗永巨,李健,陈福艳
技术所有人：广西壮族自治区水产研究所
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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技术研发人员：陈明,王瑞,李莉萍,甘西,梁万文,黄婷,雷爱莹,罗永巨,李健,陈福艳
技术所有人：广西壮族自治区水产研究所
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