利用鱼类下脚料和固定化酶制备缓释性海参饵料的方法与流程

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种利用鱼类下脚料和固定化酶制备缓释性海参饵料的方法。

背景技术：

我们知道，海参具有很高的营养价值和药用价值，被人们视为重要的海珍品。近年来，海参消费需求量的逐年增加导致了海参自然资源的过度开发和种群数量的急剧下降，因此，海参的人工养殖也随之发展起来。饵料是海参生长发育的物质基础，随着海参大规模养殖的发展，天然饵料已不能满足海参养殖的需要，因此需要人工投喂饵料。目前，人工投喂饵料存在着人工成本高、投放的饵料利用率低、人工投放饵料的量和时间不易掌握等问题。

鱼类是我国沿海丰富的海产资源，鱼类加工后的下脚料（鱼碎肉和内脏）成本低、蛋白质、牛磺酸含量高，是海参理想的天然饵料，但是使用未加工的鱼下脚料，又存在海参无法消化利用的缺点。

技术实现要素：

为了克服现有技术中鱼类下脚料直接投喂海参无法消化利用的不足，本发明提供一种工艺合理、海参饵料的肠道利用率高的利用鱼类下脚料和固定化酶制备缓释性海参饵料的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：利用鱼类下脚料和固定化酶制备缓释性海参饵料的方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：

（a）鱼类下脚料发酵处理

（a1）发酵种子液的培养

在DAE培养基中接入W2菌种，控制温度20～25℃，在150～180r/min条件下，培养2～3d，得种子菌液，所述的种子菌液OD600为1.0～1.2；其中，所述的DAE培养基的配方为：蛋白胨0.4～0.8g，酵母膏0.05～0.2g，磷酸铁0.01～0.02g，海水90～100ml；所述的W2菌种为鱼肠道中分离筛选得到的产蛋白酶菌株，该W2菌种与所述的DAE培养基的接种比例为1:300～500；

（a2）鱼类下脚料发酵液的制备

选取鱼下脚料为原料，研磨至肉糜状；称量肉糜状鱼类下脚料放入步骤(a1)制得的种子菌液中，控制温度20～25℃，在150～180r/min条件下，培养2～3d，取发酵液，得鱼类下脚料发酵液；其中，所述的肉糜状鱼类下脚料与种子菌液的料液比为1:20～25；

（b）固定化酶的制备

（b1）载体制备

称取壳聚糖溶解于浓度为20～30%的盐酸溶液中，配成壳聚糖溶液；然后将制得的壳聚糖溶液注射到含15%的氢氧化钠和30%甲醇混合溶液中，凝结成中空球形壳聚糖；其中，所述的壳聚糖与盐酸溶液的料液比为1:3～5，所述的壳聚糖的脱乙酰度为80%～85%；

（b2）载体活化

将步骤（b1）制得的中空球形壳聚糖放入浓度为4～8%的戊二醛水溶液中，于室温下搅拌反应4～6h，然后4℃静置过夜，去上清液后用水清洗2～3次，去除残余的戊二醛，得戊二醛活化处理的中空球形壳聚糖；其中，所述的中空球形壳聚糖与戊二醛水溶液的料液比为1:2～3；

（b3）酶的包埋

将步骤（b2）制得的戊二醛活化处理的中空球形壳聚糖分别加入不同pH 值缓冲液配置的中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶制剂中，室温下搅拌反应2～3h ，于4℃静置过夜，用水清洗去除游离酶，即得固定化的中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶；其中，所述的中性蛋白酶的缓冲液pH 值为6.8～7.5；所述的碱性蛋白酶的缓冲液pH 值为8.5～10.5；所述的酸性蛋白酶的缓冲液pH 值为4.0～4.5；

（c）投放

将步骤（b3）制得的固定化的中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶与步骤（a2）制得的鱼类下脚料发酵液按料液比为1:50～100投入海参养殖水域中。

本发明是在培养基中接种鱼肠道中分离筛选得到的产蛋白酶菌株，培养出种子菌液；将鱼类下脚料肉糜放入种子菌液中发酵，形成富含蛋白质的发酵液；将壳聚糖溶液注射到氢氧化钠和甲醇混合溶液中，凝结成中空球形壳聚糖载体；载体放入戊二醛水溶液中活化；利用固定化酶技术，将酶包裹在空心球壳聚糖载体中，形成固定化酶；将固定化酶与发酵液一起投放到海参养殖水域，即可。固定化酶的稳定性高，半衰周期长，鱼类下脚料发酵液与其一起投入海参饲养水域中，底物可以透过孔道与酶接触反应，将鱼下脚料废液中的蛋白进行酶解，不仅提高了海参饵料的肠道利用率，减少代谢产物的排出，提高海参的生长速率、饲料转化率，而且还能对沉积在海底或池底的残饵起到一定的降解作用，减少养殖业中氮、磷的排放，保护养殖生态环境。本发明工艺合理，其中，所采用的蛋白酶为模拟海参体内从前肠到后肠的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶；所采用的壳聚糖，投入饲养海参水域后，还可以起到净化水质的作用。因为酶的作用底物是有限的，一次性投放的鱼下脚料发酵液并不能立刻被完全消化完，鱼类下脚料发酵液与固定化的蛋白酶配合缓慢又源源不断地为海参供给养料。两者一次性投放可以减少投放饵料的次数，降低人工成本。本发明充分利用海产废弃物，提高海洋资源利用率，减少环境污染，增加海参养殖饵料种类，具有广阔的市场前景。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

利用鱼类下脚料和固定化酶制备缓释性海参饵料的方法，其经过下列工艺步骤：

（a）鱼类下脚料发酵处理

（a1）发酵种子液的培养

在DAE培养基中接入W2菌种，控制温度22℃，在160r/min条件下，培养3d，得种子菌液，该种子菌液OD600为1.1；其中， DAE培养基的配方为：蛋白胨0.5g，酵母膏0.1g，磷酸铁0.015g，海水95ml； W2菌种为鱼肠道中分离筛选得到的产蛋白酶菌株，该W2菌种与DAE培养基的接种比例为1:400；

（a2）鱼类下脚料发酵液的制备

选取鱼下脚料为原料，送入研磨机中研磨至肉糜状；称量肉糜状鱼类下脚料放入步骤(a1)制得的种子菌液中，其肉糜状鱼类下脚料与种子菌液的料液比为1:22；控制温度23℃，在160r/min条件下，培养3d，取发酵液，得鱼类下脚料发酵液；

（b）固定化酶的制备

（b1）载体制备

称取脱乙酰度为82%的壳聚糖溶解于浓度为25%的盐酸溶液中，其壳聚糖与盐酸溶液的料液比为1:4，配成壳聚糖溶液；然后将制得的壳聚糖溶液注射到含15%的氢氧化钠和30%甲醇混合溶液中，凝结成中空球形壳聚糖；

（b2）载体活化

将步骤（b1）制得的中空球形壳聚糖放入浓度为6%的戊二醛水溶液中，其中空球形壳聚糖与戊二醛水溶液的料液比为1:2.5；于室温下搅拌反应5h，然后4℃静置过夜，去上清液后用水清洗3次，去除残余的戊二醛，得戊二醛活化处理的中空球形壳聚糖；

（b3）酶的包埋

将步骤（b2）制得的戊二醛活化处理的中空球形壳聚糖分别加入pH值为7.0缓冲液配置的中性蛋白酶制剂、pH值为9.0缓冲液配置的碱性蛋白酶制剂和pH值为4.2缓冲液配置的酸性蛋白酶制剂中，室温下搅拌反应3h ，于4℃静置过夜，用水清洗去除游离酶，即得固定化的中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶；

（c）投放

将步骤（b3）制得的固定化的中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶与步骤（a2）制得的鱼类下脚料发酵液按料液比为1:80投入海参养殖水域中。

本实施例所提供的利用鱼类下脚料和固定化酶制备缓释性海参饵料的方法，其工艺合理，操作可靠。固定化酶的稳定性高，半衰周期长，对鱼类下脚料发酵液缓慢酶解，释放海参饵料，同时对沉积在海底或池底的残饵起到降解作用，减少养殖业中氮、磷的排放，所采用的壳聚糖还起到净化水质的作用，保护养殖生态环境。其减少投放饵料的次数，降低人工成本。本发明充分利用海产废弃物，提高海洋资源利用率，减少环境污染。

实施例2

利用鱼类下脚料和固定化酶制备缓释性海参饵料的方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：

（a）鱼类下脚料发酵处理

（a1）发酵种子液的培养

在DAE培养基中接入W2菌种，控制温度25℃，在150r/min条件下，培养2d，得种子菌液；该种子菌液OD600为1.2；其中， DAE培养基的配方为：蛋白胨0.8g，酵母膏0.05g，磷酸铁0.02g，海水100ml； W2菌种为鱼肠道中分离筛选得到的产蛋白酶菌株，该W2菌种与DAE培养基的接种比例为1:500；

（a2）鱼类下脚料发酵液的制备

选取鱼下脚料为原料，送入研磨机中研磨至肉糜状；称量肉糜状鱼类下脚料放入步骤(a1)制得的种子菌液中，其肉糜状鱼类下脚料与种子菌液的料液比为1: 25；控制温度20℃，在180r/min条件下，培养2d，取发酵液，得鱼类下脚料发酵液；

（b）固定化酶的制备

（b1）载体制备

称取脱乙酰度为85%的壳聚糖溶解于浓度为20%的盐酸溶液中，其壳聚糖与盐酸溶液的料液比为1: 5，配成壳聚糖溶液；然后将制得的壳聚糖溶液注射到含15%的氢氧化钠和30%甲醇混合溶液中，凝结成中空球形壳聚糖；

（b2）载体活化

将步骤（b1）制得的中空球形壳聚糖放入浓度为8%的戊二醛水溶液中，中空球形壳聚糖与戊二醛水溶液的料液比为1:2；于室温下搅拌反应4h，然后4℃静置过夜，去上清液后用水清洗3次，去除残余的戊二醛，得戊二醛活化处理的中空球形壳聚糖；

（b3）酶的包埋

将步骤（b2）制得的戊二醛活化处理的中空球形壳聚糖分别加入pH值为6.8缓冲液配置的中性蛋白酶制剂、pH值为10.5缓冲液配置的碱性蛋白酶制剂和pH值为4.0缓冲液配置的酸性蛋白酶制剂中，室温下搅拌反应2.5h ，于4℃静置过夜，用水清洗去除游离酶，即得固定化的中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶；

（c）投放

将步骤（b3）制得的固定化的中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶与步骤（a2）制得的鱼类下脚料发酵液按料液比为1:50投入海参养殖水域中。

本实施例所提供的利用鱼类下脚料和固定化酶制备缓释性海参饵料的方法，其工艺合理，操作可靠。固定化酶的稳定性高，半衰周期长，对鱼类下脚料发酵液缓慢酶解，释放海参饵料，同时对沉积在海底或池底的残饵起到降解作用，其减少投放饵料的次数，降低人工成本。本发明充分利用海产废弃物，提高海洋资源利用率，减少环境污染。

实施例3

利用鱼类下脚料和固定化酶制备缓释性海参饵料的方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：

（a）鱼类下脚料发酵处理

（a1）发酵种子液的培养

在DAE培养基中接入W2菌种，控制温度20℃，在180r/min条件下，培养3d，得种子菌液；该种子菌液OD600为1.0；其中，DAE培养基的配方为：蛋白胨0.4g，酵母膏0.2g，磷酸铁0.01g，海水90ml； W2菌种为鱼肠道中分离筛选得到的产蛋白酶菌株，该W2菌种与DAE培养基的接种比例为1:300；

（a2）鱼类下脚料发酵液的制备

选取鱼下脚料为原料，送入研磨机中研磨至肉糜状；称量肉糜状鱼类下脚料放入步骤(a1)制得的种子菌液中，其肉糜状鱼类下脚料与种子菌液的料液比为1:20；控制温度25℃，在150r/min条件下，培养2.5d，取发酵液，得鱼类下脚料发酵液；

（b）固定化酶的制备

（b1）载体制备

称取脱乙酰度为80%的壳聚糖溶解于浓度为30%的盐酸溶液中，其壳聚糖与盐酸溶液的料液比为1:3，配成壳聚糖溶液；然后将制得的壳聚糖溶液注射到含15%的氢氧化钠和30%甲醇混合溶液中，凝结成中空球形壳聚糖；

（b2）载体活化

将步骤（b1）制得的中空球形壳聚糖放入浓度为4%的戊二醛水溶液中，中空球形壳聚糖与戊二醛水溶液的料液比为1: 3；于室温下搅拌反应6h，然后4℃静置过夜，去上清液后用水清洗2次，去除残余的戊二醛，得戊二醛活化处理的中空球形壳聚糖；

（b3）酶的包埋

将步骤（b2）制得的戊二醛活化处理的中空球形壳聚糖分别加入pH值为7.5缓冲液配置的中性蛋白酶制剂、pH值为8.5缓冲液配置的碱性蛋白酶制剂和pH值为4.5缓冲液配置的酸性蛋白酶制剂中，室温下搅拌反应2h ，于4℃静置过夜，用水清洗去除游离酶，即得固定化的中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶；

（c）投放

将步骤（b3）制得的固定化的中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶与步骤（a2）制得的鱼类下脚料发酵液按料液比为1:100投入海参养殖水域中。

本实施例所提供的利用鱼类下脚料和固定化酶制备缓释性海参饵料的方法，其工艺合理，操作可靠。固定化酶的稳定性高，半衰周期长，对鱼类下脚料发酵液缓慢酶解，释放海参饵料，同时对沉积在海底或池底的残饵起到降解作用，减少养殖业中氮、磷的排放，所采用的壳聚糖还起到净化水质的作用，保护养殖生态环境。其减少投放饵料的次数，降低人工成本。本发明充分利用海产废弃物，提高海洋资源利用率，减少环境污染。