制备基因工程菌株的方法及生产藤黄绿菌素的方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程技术领域的菌株及利用该菌株生产抗生素的方法，具体 是一种制备基因工程菌株的方法及生产藤黄绿菌素的方法。
背景技术：
假单胞菌(Pseudomonas sp. )M18是从上海郊区甜瓜根际分离筛选到的一株重要 的植物根际促生假单胞菌株，它能分泌一种聚酮类抗生素-藤黄绿菌素(Huang XQ, etal. Identification and characterization of pltZ, a gene involved in therepression of pyoluteorin biosynthesis in Pseudomonas sp. M18. FemsMicrobiology Letters 2004,232:197 202)。藤黄绿菌素由一个间苯二酚环(起源于聚酮生物合成)和一个氯 化的吡咯环的部分结构共同组成，具有广谱活性，能抑制细菌和真菌，特别是抑制卵菌属真 菌如终极腐霉等，可用于除草(Haas D, Defago G, Biological control of soi 1-borne pathogens by fluorescent pseudomonads. NatureReviews Microbiology 2005,3:307 319)。离体培养皿生物测定显示，藤黄绿菌素对各种农作物真菌性病原菌特别是对水稻纹 枯病菌、腐霉和疫霉等具有高效的广谱抑菌作用。藤黄绿菌素在自然界中易降解、无残留， 是一种高效、安全、低毒、低残留、环保型的微生物源农药。假单胞菌(Pseudomonas sp.)M18 野生型分泌的藤黄绿菌素浓度非常低，不适合规模化的工业生产。为了进一步提高藤黄绿 菌素产量、降低生产成本，实现藤黄绿菌素的产业化，迫切需要大幅度提高藤黄绿菌素的发 酵效价。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种制备基因工程菌株的方法及生 产藤黄绿菌素的方法。利用本发明制备的PqsR基因阻断工程菌M18PRG，每升发酵液中，藤 黄绿菌素的发酵效价约为150毫克，与现有技术相比发酵效价提高了 3 4倍，该工程菌可 为进一步构建多基因高产工程菌株应用于微生物源农药生产奠定基础。本发明是通过以下的技术方案实现的，第一方面，本发明涉及一种基因工程菌株的制备方法，包括如下步骤步骤一，从假单胞菌(Pseudomonas sp. )M18的总基因组DNA中克隆pqsR基因；步骤二，将pqsR基因亚克隆至携带抗生素抗性基因的质粒，得重组质粒；步骤三，在pqsR基因中插入抗生素抗性基因，构建重组自杀质粒；步骤四，将重组自杀质粒转化至大肠杆菌，之后与假单胞菌(Pseudomonas sp.) M18野生型菌株双亲杂交；步骤五，利用含有步骤三所述抗生素的培养基和含有步骤二所述抗生素的培养基 进行筛选，得到能在含步骤三所述抗生素的培养基上生长，且在含步骤二所述抗生素的培 养基上不能生长的菌株，即得基因工程菌株。步骤二中，所述质粒为pEX18Tc、pEX18Gm或pEX18Ap。
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优选地，所述质粒为pEX18Tc。步骤二中，所述抗生素抗性基因为四环素抗性基因、庆大霉素抗性基因或氨苄青 霉素抗性基因。优选地，所述抗生素抗性基因为庆大霉素抗性基因。步骤三中，所述抗生素抗性基因为庆大霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因。步骤四中，所述大肠杆菌为大肠杆菌SM10。步骤五中，所述培养基为LB培养基。第二方面，本发明还涉及利用前述基因工程菌株生产藤黄绿菌素的方法，包括如 下步骤步骤一，培养基因工程菌株，得发酵液；步骤二，提纯发酵液，得藤黄绿菌素。步骤一中，所述培养使用的培养基具体为该培养基的pH为7. 5，1L培养基的组分 为蛋白胨 20g，甘油 15mL，MgSO4 1. 5g，K2HPO4O. 3g，余量为水。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明克隆了假单胞菌 (Pseudomonas sp. )M18中强烈抑制藤黄绿菌素生物合成的负调控基因pqsR、阻断了 pqsR 基因的功能，构建了基因工程菌M18PRG，利用本发明制备的pqsR基因阻断工程菌M18PRG， 每升发酵液中，藤黄绿菌素的发酵效价约为150毫克，与现有技术相比发酵效价提高了 3 4倍，该工程菌可为进一步构建多基因高产工程菌株应用于微生物源农药生产奠定基础。本发明涉及的假单胞菌(Pseudomona sp. )M18菌株已在专利号为ZL 00119857. 2 的中国发明专利中公开。
图1为用于pqsR基因双交换的重组自杀质粒构建示意图；图2为pqsR基因阻断工程菌M18PRG与假单胞菌(Pseudomonas sp. )M18野生型 菌株的藤黄绿菌素产量的HPLC定量测定图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如 Sambrook 等分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例pqsR基因阻断工程菌M18PRG的构建及发酵生产藤黄绿菌素步骤一，pqsR基因的克隆(1)根据LysR家族调控蛋白PqsR编码基因保守序列设计引物，利用PCR技术从假 单胞菌M18基因组模板中扩增包含pqsR基因的DNA片段。引物 1:5' -TAT AGA ATT CAC ATG CCG GCA TGC CAG-3‘，带下划线的碱基为 EcoRI酶切位点；引物 2:5' -TAA TAA GCT TTG GCC GAT GCC GAT GGC-3‘，带下划线的碱基为HindIII酶切位点。PCR反应体系(50 μ L) 10 X高保真DNA聚合酶缓冲液5 μ L，dNTP (2. 5mmol/ L) 4 μ L，引物1和引物2各1 μ L，模板DNA 3 μ L，高保真酶(5U/ μ L) 0. 2 μ L，重蒸水 35. 8 μ L0 PCR 反应条件94°C 5min ;30 个循环，每个循环具体为94°C 40s，65°C 1. 5min, 72°C 90s ；之后72°C IOmin0染色体DNA提取采用UNIQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒(上 海生工生物工程技术服务有限公司)。(2)回收1. 5-kb的包含pqsR基因的PCR产物，委托英骏生物技术有限公司进行 DNA测序，分析发现，所测序列中包含一个999-bp的开放阅读框(SEQID NO :1)，编码一个大 小为332个氨基酸的细菌LysR家族调控蛋白(SEQID NO :2)。(3)包含pqsR基因的PCR产物经EcoR I和HindIII双酶切后，克隆经 EcoR I 和 HindIII 双酶切处理的 pEX18Tc 质粒(Hoang TT, Karkhoff-Schweizer RR, et al.Abroad-host-range Flp-FRT recombination system for site-specific excision ofchromosomally-located DNA sequences !application for isolation of unmarkedPseudomonas aeruginosa mutants. Gene 1998, 212 :77 86),此重组质粒命名为 pEXTc-pqsR。步骤二，pqsR基因的阻断(l)pqsR基因中有一个BamHI位点(位于ATG下游第77个核苷酸)，将含有pqsR基 因的重组质粒pEXTc-pqsR用BamHI酶切，回收；同时将庆大霉素抗性基因Gnf用BamH I从 ρUCGm(Keen NT,Tamaki S,et al. Improved broad-host-range plasmids for DNAcloning in gram-negative bacteria. Gene 1988,70 191 197)酶切得到 0. 85-kb 的片段，回收； 用T4DNA连接酶连接该两段DNA片段，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选正确 的转化子，得到用于pqsR双交换的重组自杀质粒，命名为pEXTcPRG(图1)；(2)将含有 pqsR: Gmr 重组质粒 pEXTcPRG 转化大肠杆菌 SMlO (Sambrook J, WatsonRD. Molecular Cloning -.a Laboratory Manual. 3rd edn. Cold Spring Harbor, NY Cold Spring Harbor Laboratory，2001)，将其作为供体菌，假单胞菌(Pseudomonassp.) M18野生型作为受体菌。37 0C USOrpm的条件下分别过夜培养供体菌和受体菌，各自取500 μ L的菌液 10000rpm/min离心lmin，弃上清；分别用ImL的LB培养基(每升LB培养基含胰蛋白 胨IOg,酵母粉5g，NaCl IOg,相应固体培养基加15g琼脂粉 ’参考Sambrook J，Watson RD. Molecular Cloning -.a Laboratory Manual. 3rd edn. Cold Spring Harbor, NY :Cold Spring Harbor Laboratory, 2001)洗一次；之后，让两种菌混合并悬浮于100 μ L的LB培 养基中。吸取混合菌液点于中央放有一片圆形细菌微孔滤膜的无抗生素的LB固体培养皿 中，37°C下培养18 24小时。刮取上述菌体稀释于ImL的LB培养基中，涂布于含有40ug/ml庆大霉素筛选平 板，培养24小时后观察结果。挑取单菌落，用灭菌牙签挑取单一克隆同时分别点于含庆大 霉素(Gm，40ug/ml)与四环素(Tet，125ug/ml)的平板进行筛选。重组自杀质粒pEXTcPRG转 入假单胞菌(Pseudomonas sp. )M18菌株后，不能在染色体外自主复制，其携带的pqsR: :Gmr 突变基因与受体菌M18的染色体发同源重组。在含四环素的平板上不生长而在含庆大霉 素的平板上生长的相应克隆表明已发生双交换，即获得假单胞菌(Pseudomona sp.)M18的pqsR基因阻断工程菌，命名为M18PRG。(3)抽提pqsR基因阻断工程菌的染色体DNA，以假单胞菌(Pseudomonas sp. )M18 野生型染色体DNA作为对照，用引物 1(5' -TAT AGA ATT CAC ATG CCG GCA TGC CAG-3‘) 和引物 2(5' -TAA TAA GCT TTG GCC GAT GCC GAT GGC-3 ‘)进行 PCR、酶切、测序验证。 pqsR基因阻断工程菌的PCR产物较野生型的PCR产物大0. 85_kb ；通过BamHI酶切、DNA测 序进一步验证pqsR基因阻断工程菌M18PRG是正确的。步骤三，pqsR基因阻断工程菌M18PRG发酵生产藤黄绿菌素的HPLC分析将pqsR基因阻断工程菌M18PRG和假单胞菌(Pseudomonas sp. )M18野生 型菌株分别培养在 KMB 培养基(Kin EO，Ward MK，Raney DE，Two simple media for thedemonstration of pyocyanin and fluorescin. J. Lab. Clin. Med. 1954,44 301 ~ 307) 中，于28°C、220rpm摇床振荡培养。定时取样，利用高效液相色谱(HPLC)测定样品中藤黄 绿菌素的浓度。藤黄绿菌素发酵用KMB培养基(每升)蛋白胨20g，甘油15mL，MgS041.5g， K2HPO4O. 3g, pH 7.5。藤黄绿菌素的HPLC分析取200 μ L发酵菌液，加200 μ L乙酸乙酯进 行抽提，离心取100 μ L上清，真空干燥，溶于100 μ L甲醇中，取5 μ L进行C18反相高效液相 色谱(HPLC)分析，检测条件检测波长308nm，保留时间为3. lmin，流动相为70%甲醇，流 速lmL/min，探测范围为0.01。以藤黄绿菌素纯品作为标样。藤黄绿菌素产量测定结果见图 2。藤黄绿菌素产量HPLC分析结果表明，pqsR基因阻断工程菌M18PRG的藤黄绿菌素产量 与野生型菌相比提高了 3 4倍，pqsR基因阻断工程菌的藤黄绿菌素产量峰值为149 μ g/ mL而野生型的峰值仅为37. 5 μ g/mL。
权利要求
一种基因工程菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，从假单胞菌M18的总基因组DNA中克隆pqsR基因；步骤二，将pqsR基因亚克隆至携带抗生素抗性基因的质粒，得重组质粒；步骤三，在pqsR基因中插入抗生素抗性基因，构建重组自杀质粒；步骤四，将重组自杀质粒转化至大肠杆菌，之后与假单胞菌M18野生型菌株双亲杂交；步骤五，利用含有步骤三所述抗生素的培养基和含有步骤二所述抗生素的培养基进行筛选，得到能在含步骤三所述抗生素的培养基上生长，且在含步骤二所述抗生素的培养基上不能生长的菌株，即得基因工程菌株。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌株的制备方法，其特征是，步骤二中，所述质粒为 pEX18Tc、pEX18Gm 或 pEX18Ap。
3.根据权利要求2所述的基因工程菌株的制备方法，其特征是，所述质粒为pEXISTc。
4.根据权利要求1所述的基因工程菌株的制备方法，其特征是，步骤二中，所述抗生素 抗性基因为四环素抗性基因、庆大霉素抗性基因或氨苄青霉素抗性基因。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌株的制备方法，其特征是，所述抗生素抗性基因 为庆大霉素抗性基因。
6.根据权利要求1所述的基因工程菌株的制备方法，其特征是，步骤三中，所述抗生素 抗性基因为庆大霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因。
7.根据权利要求1所述的基因工程菌株的制备方法，其特征是，步骤四中，所述大肠杆 菌为大肠杆菌SM10。
8.根据权利要求1所述的基因工程菌株的制备方法，其特征是，步骤五中，所述培养基 为LB培养基。
9.一种根据权利要求1所述的基因工程菌株生产藤黄绿菌素的方法，其特征在于，包 括如下步骤步骤一，培养基因工程菌株，得发酵液；步骤二，提纯发酵液，得藤黄绿菌素。
10.根据权利要求9所述的生产藤黄绿菌素的方法，其特征是，步骤一中，所述培养 使用的培养基具体为该培养基的PH为7. 5，IL培养基的组分为蛋白胨20g，甘油15mL， MgSO4L 5g，K2HPO4O. 3g，余量为水。
全文摘要
一种基因工程技术领域的制备基因工程菌株的方法及生产藤黄绿菌素的方法；制备所述菌株的方法包括如下步骤从假单胞菌(Pseudomona sp.)M18的总基因组DNA中克隆pqsR基因；将pqsR基因亚克隆至携带抗生素抗性基因的质粒，得重组质粒；在pqsR基因中插入抗生素抗性基因，构建重组自杀质粒；将重组自杀质粒转化至大肠杆菌，之后与假单胞菌(Pseudomonas sp.)M18野生型菌株双亲杂交，抗性筛选，即得基因工程菌株；利用前述基因工程菌株生产藤黄绿菌素的方法，包括如下步骤培养基因工程菌株，得发酵液；提纯发酵液，得藤黄绿菌素。利用本发明制备的基因工程菌株使得藤黄绿菌素的发酵效价约为150毫克，与现有技术相比发酵效价提高了3～4倍。
文档编号C12N1/20GK101948790SQ20101028243
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月15日 优先权日2010年3月3日
发明者许煜泉, 黄显清 申请人:上海交通大学
文档序号 :
【 585915 】
技术研发人员：许煜泉,黄显清
技术所有人：上海交通大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
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技术研发人员：许煜泉,黄显清
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