融合蛋白一步催化制备n-乙酰神经氨酸的方法
技术领域：
本发明公开了一种融合酶蛋白一步催化制备N-乙酰神经氨酸的方法，属于生物 工程技术领域。
背景技术：
N-乙酰神经氨酸是一个含9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖，广泛存在 于许多生物体内，随着生物进化程度的增加，唾液酸及衍生物在生物体内的含量亦增加。在 动物体内和多种微生物表面，因唾液酸带有一个羧基而赋予细胞和许多复合糖的负电荷性 质。在细胞与细胞之间、细胞与外界环境之间的信号传递和识别过程中，唾液酸残基起着至 关重要的作用。经过近十几年的发展，糖生物学和糖化学在生物工程和制药工业中的作用 日显重要。在以糖为基础的治疗药物中，流感病毒唾液酸酶抑制剂的开发是一个成功的例 子。如上所述，由于唾液酸酶对于新生成病毒从细胞表面的唾液酸受体释放是必需的，因此 抑制唾液酸酶可终止病毒的复制，呈现该病的严重性减弱和病程缩短。如葛兰素公司推出 的抗病毒新药Zanamivir就是N-乙酰神经氨酸的类似物。唾液酸是一种必需的和丰富的定位于细胞表面聚糖末端的氨基糖。它在很多生物 学中有重要作用，比如病毒侵染，病毒的神经氨酸酶移走受感染细胞表面的唾液酸是其形 成病毒颗粒后进行释放的基本步骤。因此唾液酸类似物被广泛的应用于抗病毒药物。如葛 兰素公司推出的抗病毒新药Zanamivir就是N-乙酰神经氨酸的类似物，可以阻抑A和B型 流感病毒的神经氨酸酶，它已经被商业化生产，用于避免高致病H5W病毒的感染。由于唾液酸存在于人乳中，并且大量研究已经证实唾液酸对于增强婴儿的免疫力 和提高大脑的发育有重要作用，唾液酸可以添加到一些婴幼儿奶粉中。因此唾液酸的规模 化生产对于医药及食品工业有重要的作用。唾液酸的酶法合成主要是以N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸钠为底物，在N乙酰神经氨 酸醛缩酶的作用下生成N-乙酰神经氨酸。但是由于N-乙酰甘露糖胺的价格昂贵，所以实 际上有“化学加酶法”和“双酶法”两种方法。“化学加酶法”是将廉价的N乙酰葡萄糖胺在 碱性条件下进行异构化生成N-乙酰甘露糖胺，但是此方法回收率较低，环境污染严重，限 制了其大规模应用。“双酶法”是采用N乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶制备成N-乙酰甘露 糖胺，但是该酶提取困难，重组表达的酶活比较低，并且两个酶催化两步反应工艺复杂，不 能满足大规模生产的需求。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，公开了一种融合蛋白一步催化制备N-乙 酰神经氨酸的方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的，融合蛋白一步催化制备N-乙酰神经 氨酸的方法，其特征是包括以下步骤(1)利用重叠PCR技术，将N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶的基因连在一起，导入毕赤酵母宿主细胞中，从而获得具有N-乙酰葡萄糖胺-2-差向 异构酶和N-乙酰神经氨酸异构酶活性的融合蛋白；(2)反应体系的pH为6. 5-8.0，反应温度为30_40°C，N-乙酰葡萄糖胺与丙酮酸及 其盐的重量比为1-1. 2，将N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸及其盐与游离的融合酶蛋白或者固定 化的融合蛋白混勻，反应得到混合物；(3)从反应混合物分离制备N-乙酰神经氨酸。所述的步骤⑴中的融合蛋白中的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶为 E. C. 5. 1. 3. 8 ；融合蛋白中N-乙酰神经氨酸醛缩酶为E. C. 4. 1. 3. 3。所述的融合蛋白中的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶包括具有N-乙酰葡萄糖 胺-2-差向异构酶活性的多肽，N-乙酰神经氨酸醛缩酶包括具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶 活性的多肽；所述的融合蛋白的融合方式(1)第一区位于融合蛋白的N端，第二区位于融合蛋 白的C端；(2)第一区位于融合蛋白的C端，第二区位于融合蛋白的N端；优选的融合方式为N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶N端与N-乙酰神经氨酸异构 酶C端融合。所述的步骤(1)中的融合蛋白还包括在N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙 酰神经氨酸异构酶之间加入0-30个长度的氨基酸作为连接肽。所述的步骤(1)中的融合蛋白还包括在N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙 酰神经氨酸异构酶之间加入10个氨基酸长度或(G4S)5作为连接肽，优选(G4S)5作为连接 肽。所述的反应体系的pH为6. 5-8. 0，反应温度为30_40，N-乙酰葡萄糖胺与丙酮酸 及其盐的重量比为1-1. 8，其中优选PH 7. 5，温度36°C，N-乙酰葡萄糖胺与丙酮酸及其盐的 重量比为1.5倍。所述的步骤(1)中的融合蛋白存中的融合蛋白包括在于宿主细胞内表达或从宿 主中分泌出来，优选胞内表达。所述的融合蛋白的宿主细胞是细菌或酵母或动物细胞或植物细胞，优选酵母细 胞，更优选毕赤酵母。所述的步骤(1)中的融合蛋白包括固定后的酶蛋白。所述的步骤(2)中固定化的融合蛋白所用的载体为高分子合成材料或木炭或陶 瓷或玻璃或纤维素，优选Amberlite FPA。本发明将以前的两步反应中的两个酶融合表达，从而显著简化了生产工艺流程和 降低生产成本。本发明中由于融合蛋白中两酶的活性中心位点邻近，使得酶促反应的效率 得到了极大的提高。本发明的转化效率达到了 60%以上，并且能在30h内完成催化反应，该 方法操作简便，对N-乙酰神经氨酸在工业大规模生产上有较大意义。
图1显示本发明的一个实施例中制得的唾液酸产品的HPLC图；图2a显示唾液酸标品红外扫描；图2b显示本发明的一个实施例中制得的唾液酸产品红外扫描。
具体实施例方式实施例1用于本发明中的酶包括不含额外序列的酶，N端或者C端有氨基酸残基缺失的酶 及含有额外序列的酶(如带有标签序列)的蛋白或多肽，只要这些变异的N-乙酰葡萄糖 胺-2-差向异构酶仍然保留其天然形式所具备的催化N-乙酰葡萄糖胺形成N-乙酰甘露糖 胺的活性，N-乙酰神经氨酸醛缩酶仍然保留其天然形式所具备的催化N-乙酰甘露糖胺和 丙酮酸及其盐形成N-乙酰神经氨酸的活性即可。其中优选融合蛋白中的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶是指E. C. 5. 1. 3. 8,N-乙 酰神经氨酸醛缩酶是指E. C. 4. 1. 3. 3。本发明使用的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶来源广泛，包括但不限于猪肾，猴 肾，人肾，酵母及蓝藻，优选蓝藻，更优选蓝藻中的鱼腥藻属(Anabaena sp.)。本发明使用本领域中常见的N-乙酰神经氨酸醛缩酶来源广泛，包括但不限于 大肠杆菌属(Escherichia)，芽孢杆菌属(Bacillus)，杆菌属(Bac terium)，假单胞杆 菌属(Pseudomonas), Breviba terium气杆菌属(Aerobacter)等，其中优选大肠杆菌属 (Escherichia)，更优选N-乙酰神经氨酸醛缩酶来源E. coli. K12株系。本发明表达载体可以通过商业途径获得，包括但不限于细菌表达载体PET_32a， PET-22b, PET-28a, pBV220 等；酵母表达载体 pHIL-D，pPIC9k, pPIC3. 5K, pPICZa pPICZ, pGAPZa，pGAPZ，pYES等；动物细胞表达载体pSVK3，pMSG，pcDNA3. 1等。优选酵母表达载体， 更优选PPIC3. 5K。大肠杆菌的表达系统的启动子可以是任何一种。如trp启动子(P trp)Uac启动 子(P lac)、T7启动子、PL启动子、I3R启动子，PSE启动子等来源于大肠杆菌或噬菌体的启 动子，优选T7启动子。酵母表达系统的启动子可以是其中任意一种。如GAP启动子，AOXl启动子，PGK启 动子，ADH启动子等。优选的方法是将融合蛋白基因克隆到载体pPIC3. 5k，这是酵母整合型 质粒，带有His4选择标记。醇氧化酶操纵子(AOXl)两侧的序列用于编码基因整合至酵母 染色体，并控制编码基因的表达。优选启动子为A0X1。一、BP融合基因片段的PCR扩增(1)利用引物设计软件，根据测序结果中的基因序列设计下列引物(2)以鱼腥藻的基因为模板，引物1和2，PCR扩增N-乙酰葡萄糖胺_2_差向异构 酶基因。反应体系及反应条件如下N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶基因 IyL弓I物一 5，gaattcatggggaaaaacttacaagcactggcg-3‘弓丨物二 5，-cgcggggattcaactcaacgcctcgaa-3，弓丨物三5，-ttcgaggcgttgagttgaatccccgcg-3，弓I物四5，-gcggccgcatggcaacgaatttacgtggcgtaatg-310XPCR Buffer 5 μ LdNTPs(2. 5mmol/L) 4μ L引物 l(10ymol/L) 1 μ L
引物 2(10ymol/L)1 μ LTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 5 μ L加ddH20 至终体积为 50 μ L ；94°C预变性 4min ；94°C变性 30s，57°C退火 30s，72°C 延伸20s，循环35次；72°C最终延伸7min ；4°C保存；(3)以大肠杆菌K12菌株的基因组为模板，引物3和4为，PCR扩增N-乙酰神经氨 酸醛缩酶基因。反应体系及反应条件如下N-乙酰神经氨酸醛缔酵酶基因1 μ L
10XPCR Buffer5 μ L
dNTPs(2. 5mmol/L)4μ L
引物 3(10ymol/L)1 μ L
引物 4(10ymol/L)1 μ L
Taq DNA 聚合酶(5U/'yL)0. 5μ L
加ddH20至终体积为50 μ L ；94°C预变性4min ；94°C变性30s, 57°C退火30s, 72°C
延伸20s，循环35次；72°C最终延伸7min ；4°C保存。二、基因的体外拼接(1)将两纯化后的PCR产物1 1混合作为模板，重叠PCR体外拼接N-乙酰葡萄 糖胺-2-差向异构酶基因和N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因，反应体系及反应条件如下混合的模板2yL10XPCR Buffer5μ LdNTPs(2. 5mmol/L)4μ L
Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0. 5 μ L加ddH20 至终体积为 50 μ L ；94°C预变性 2min ；94°C变性 30s，44°C退火 30s，72°C 延伸15s，循环8次；72°C最终延伸7min ；之后立即向反应体系中加入lOymol/L的引物1 和引物3各1 μ L，改变退火温度为54°C，延伸时间为20s，继续进行PCR扩增，循环30次；(2)上述PCR产物进行纯化，回收融合蛋白BP基因。将得到的融合基因(BP)克隆至T载体，经测序验证后，连接有目的基因的T载体 经EcoRl和Notl双酶切，凝胶电泳后割胶回收，载体pPIC3. 5K经同样处理后与前者通过T4 连接酶16°C连接过夜。将连接过夜的DNA转化E. coliDH5a感受态细胞。然后从E. coli DH5 α转化子中提取pPIC3. 5K/BP质粒，为转化毕赤酵母细胞做好准备。三、毕赤酵母感受态酵母细胞的制备(1)从新活化的YPD平板上挑取单菌落，接种到装有IOmL YPD培养基的50mL三角 瓶中，30°C，180r/min过夜培养。(2)将过夜培养的种子以0. 1 %的接种量接种到装有150mL YPD培养基的500mL三角烧瓶中，30°C，150r/min培养至A600 = 1.3左右。(3)取IOOmL 培养好的菌液分装至两个50ml的离心管中，4°C，8000r/min，5min离心弃上清。(4)每管用 40ml预冷无菌水重悬菌体沉淀，4°C，8000r/min，5min离心弃上清。重复此步骤一次。(5) 用灭过菌的预冷的lmol/L山梨醇溶液IOmL重悬菌体沉淀，4°C，8000r/min，5min离心弃上 清。(6)用无菌的lmol/L山梨醇溶液300 μ L重悬菌体沉淀，分装至无菌1. 5mL离心管中， 每支100 μ L放于冰上待用。四、毕赤酵母感受态细胞的电击转化
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取0. 1 μ g (彡5 μ L) all线性化处理的重组质粒pPIC3. 5K/BP与100 μ L酵母感 受态细胞混勻；将酵母和转化DNA混合物转移到冰冷的0. 2cm间隙的电击池中；按一般真 菌转化的设置(1. 5kV、25 μ F、200 Ω、时间参数5ms)，进行电击转化；电击结束后立即加入 600 μ 1 lmol/L冰冷的山梨醇，混勻后各取200 μ 1分别涂布到含有lmol/L山梨醇的MD平 板上，30°C培养至菌落出现。五、毕赤酵母转化子的筛选方法从YPD平板上挑一单菌落接入到摇瓶生长培养基(100mL/500mL三角瓶)，30°C， 220rpm,培养24 30h (A600 = 20左右)。4°C，3000rpm离心收集菌体，弃去上清液，接入至 20mL诱导培养基中(浓缩4倍)，30°C，220rpm，每24h补加3%甲醇，诱导72 96h。下摇 床离心后，收集菌体，细胞破碎测酶活，经过大量筛选，最终获得一株酶活较高的菌株(G3)。酶活定义lu酶活定义为每分钟产生1 μ mol N-乙酰神经氨酸所需酶量。实施例2工程菌GS115/G3的发酵及酶蛋白的固定化从新鲜的斜面上挑取一环种子，接种到已灭好菌的IOOml的种子培养基中，培养 16-18h，接种到2L基础培养基BSM中，8-10h左右溶氧(DO)达到最低并开始反弹，此时开始 流加甘油，使溶氧维持在20%左右，当A600达到100左右，即开始甲醇诱导，诱导60h左右 后下罐。8000rpm离心20min收集菌体。将发酵收集的菌体称取500克，加入IL水重悬，压力lOOObar，共破碎两次。破碎 后15000rpm离心30min，得到1. IL融合酶蛋白的粗酶液。将高压破碎和去杂蛋白后所得的粗酶固定化到载体上得到固定化酶，一种优选 的方法是按照粗酶液量载体量=1-20 1的投入载体，在反应器中固定12-48h，温度 18-30°C, pH 6. 5-8. 5。然后将载体和融合酶酶蛋白放入发酵罐中，30°C，150rpm，固定24h。固定完毕用 IM的磷酸缓冲(pH8.0)液洗载体，然后离心测得酶活25U/g。实施例3转化称取200g固定好的酶蛋白，投入到IL的反应体系中(N-乙酰葡萄糖胺1. 2M，丙酮 酸钠0. 8M，ATP IOOMm, pH 7. 6)，混勻后，30°C，160rpm反应，28h后离心放罐，收集转化液。实施例4结晶将实施例3中所得到的转化液14000rpm，离心15min，去除杂质。活性炭60°C脱色 lh，浓缩5倍，加入10倍体积的乙醇，4°C结晶4-5天。三足式离心机离心收集唾液酸晶体， 烘干4-5天，HPLC检测唾液酸纯度(见图1)将唾液酸样品进行红外光谱分析，结果与标品 一致(见图2)。
权利要求
融合蛋白一步催化制备N 乙酰神经氨酸的方法，其特征是包括以下步骤(1)利用重叠PCR技术，将N 乙酰葡萄糖胺 2 差向异构酶和N 乙酰神经氨酸醛缩酶的基因连在一起，导入毕赤酵母宿主细胞中，从而获得具有N 乙酰葡萄糖胺 2 差向异构酶和N 乙酰神经氨酸异构酶活性的融合蛋白；(2)催化反应体系的pH为6.5 8.0，反应温度为30 40℃，N 乙酰葡萄糖胺与丙酮酸及其盐的重量比为1 1.8，将N 乙酰葡萄糖胺和丙酮酸及其盐与游离的融合酶蛋白或者固定化的融合蛋白混匀，反应得到混合物；(3)从反应混合物分离制备N 乙酰神经氨酸。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白一步催化制备N-乙酰神经氨酸的方法，其特征是所 述的步骤(1)中的融合蛋白中的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶为E. C. 5. 1.3. 8,N-乙酰 神经氨酸醛缩酶为E. C. 4. 1. 3. 3。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白一步催化制备N-乙酰神经氨酸的方法，其特征是 所述的步骤(1)中融合蛋白中的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶包括具有N-乙酰葡萄糖 胺-2-差向异构酶活性的多肽，N-乙酰神经氨酸醛缩酶包括具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶 活性的多肽。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白一步催化制备N-乙酰神经氨酸的方法，其特征是 所述的融合蛋白的融合方式为(1)第一区位于融合蛋白的N端，第二区位于融合蛋白的C 端；(2)第一区位于融合蛋白的C端，第二区位于融合蛋白的N端。
5.根据权利要求1所述的融合蛋白一步催化制备N-乙酰神经氨酸的方法，其特征是所 述的步骤(1)中的融合蛋白包括在N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸异 构酶之间加入0-30个长度的氨基酸作为连接肽。
6.根据权利要求1所述的融合蛋白一步催化制备N-乙酰神经氨酸的方法，其特征是所 述的融合蛋白的宿主细胞是细菌或酵母或动物细胞或植物细胞。
7.根据权利要求1所述的融合蛋白一步催化制备N-乙酰神经氨酸的方法，其特征是所 述的步骤(1)中的融合蛋白在宿主细胞内表达或从宿主细胞中分泌出 来。
8.根据权利要求1所述的融合蛋白一步催化制备N-乙酰神经氨酸的方法，其特征是所 述的步骤(1)中的融合蛋白包括固定后的酶蛋白。
9.根据权利要求1所述的融合蛋白一步催化制备N-乙酰神经氨酸的方法，其特征是所 述的步骤(2)中固定化的融合蛋白所用的载体为高分子合成材料或木炭或陶瓷或玻璃或 纤维素。
全文摘要
本发明公开了融合蛋白一步催化制备N-乙酰神经氨酸的方法，属于生物工程技术领域。利用重叠PCR技术，将N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和N-乙酰神经氨酸醛缩酶的基因连在一起，导入毕赤酵母宿主细胞中，从而获得具有活性的融合蛋白，该融合蛋白在反应器中催化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸及其盐转化生成N-乙酰神经氨酸。本发明通过重叠PCR技术将两个酶融合，一步催化制备N-乙酰神经氨酸，显著简化了生产工艺流程和降低生产成本。由于融合蛋白中两酶的活性中心位点邻近，使得酶促反应的效率得到了极大的提高。本发明总的转化效率达到了60％以上，并且能在30h内完成催化反应，该方法操作简便，对N-乙酰神经氨酸在工业大规模生产上有较大意义。
文档编号C12N9/90GK101979644SQ201010282400
公开日2011年2月23日 申请日期2010年9月10日 优先权日2010年9月10日
发明者梅松 申请人:扬州博生源生物科技有限公司
文档序号 :
【 585914 】
技术研发人员：梅松
技术所有人：扬州博生源生物科技有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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