含仿生牙周膜的生物牙根支架/细胞/膜片复合体及其组织工程构建方法
[0113]图2为本发明的牙髓干细胞与支架复合培养方法
[0114]A:接种细胞后的支架材料B:旋转式三维培养系统C:接种2天后，有少量的细胞开始黏附在支架材料上(600x)D:培养5天后，细胞相互连接成一片，排列紧密(100x)
[0115]图3为本发明的仿生牙周膜片的大体观察照片。当培养基成分中加入20yg/ml的抗坏血酸后，可以促进细胞快速增殖，并分泌大量细胞外基质胶原成分，将所有细胞连接在一起，当生长到10-13天后，可以将整个细胞膜片完整揭下来。
[0116]图4为本发明的仿生牙周膜片的组织学染色切片。切片上可见牙周干细胞膜片由2-3层细胞构成，细胞之间细胞外基质丰富，连接紧密。
[0117]图5为本发明的仿生牙周膜片的透射电镜照片。透射电镜显示，牙周膜细胞膜片保持了细胞间的紧密连接，且具有细胞正常的生理活动。其中A图显示为完整的细胞形态。B图表明获得的牙周膜干细胞膜片保持了细胞间的紧密连接。C图示细胞生长分化很好，胞浆内大量微丝，沿细胞膜表面可见胞吐小泡。D图中表明细胞周围可见基质和胶原纤维(主要为2型胶原)
[0118]图6为本发明的仿生牙周膜片的基因和蛋白表达检测结果。检测结果表明牙周膜细胞膜片与酶消化下来的细胞相比，细胞外基质明显增高。图A、B、C分别为I型胶原(collagen I，C0LI)，纤维连接蛋白(fibronectin)及整联蛋白01(integrin β?)的real-time PCR对比结果。图D、E、F分别为以上蛋白的免疫荧光化学染色结果，也从蛋白水平证实了这一点
[0119]图7为本发明的再生牙周组织与正常组织及种植体牙周组织的组织学情况对比。回植后6个月，组织学观察显示再生的生物牙根组织形态与新生的骨组织不同，其散在分布着少量细胞，推测可能是成牙本质细胞或成牙骨质细胞，中央为均匀、粉染的基质。新形成的硬组织区域外为纤维结缔组织包绕，纤维走行与正常牙周膜类似，有sharpy纤维样结构插入新形成的硬组织区。种植体磨片染色结果显示形成单纯的骨结合，并没有正常的牙周膜结构。其中A为生物牙根植入后6个月，B为正常的牙根结构，C为种植体磨片。PDL:牙周膜D:牙本质C:牙骨质B:骨IM:种植体
【主权项】
1.一种含仿生牙周膜的生物牙根支架/细胞/膜片复合体，其特征在于，该生物牙根复合体的支架成分为磷灰石/胶原有序排列的矿化胶原，支架中生长有牙源性干细胞，支架外部紧密结合有牙源性干细胞细胞膜片。2.根据权利要求1的一种生物牙根支架/细胞/膜片复合体，其特征在于，支架材料中所述胶原为动物源性的I型胶原，所述磷灰石的主要物相为羟基磷灰石，其中磷灰石以弱结晶的纳米微粒形式有序排列在胶原分子之间与分子表面，胶原/磷灰石= 5/5?2/8(w/w)。3.根据权利要求1的一种生物牙根支架/细胞/膜片复合体，其特征在于，所述支架孔隙率为70 %?95 %，孔径为50?500μπι，供牙源性干细胞贴附、生长、增殖和活性表达。4.根据权利要求1的一种生物牙根支架/细胞/膜片复合体，其特征在于，所述牙源性干细胞细胞膜片富含细胞、细胞外基质以及胶原纤维。5.—种含仿生牙周膜的生物牙根支架/细胞/膜片复合体的制备方法，包括以下步骤: 步骤S1、生物牙根支架的制备，具体包括: 步骤Sl-1、将胶原溶于盐酸、硝酸或醋酸中的任何一种，配制成胶原的酸溶液，其中胶原浓度为 5.0 X 10—5?5.0 X 10—3g/mL ； 步骤S1-2、持续搅拌步骤Sl-1获得的溶液，缓慢滴加含钙离子的溶液，钙离子的加入量为每克胶原对应加入钙离子0.01?0.16mol; 步骤S1-3、持续搅拌步骤S1-2获得的溶液，缓慢滴加含磷酸根离子的溶液，磷酸根离子的加入量与步骤S1-2中钙离子加入量的摩尔比为Ca/P = 1/1?2/1; 步骤S1-4、持续搅拌步骤S1-3获得的溶液，缓慢滴加NaOH溶液至混合体系pH=6?8，当PH=5?6时，混合体系开始出现沉淀，当pH=7时，混合体系出现白色悬浊液； 步骤S1-5、将步骤S1-4获得的混合体系静置24?120小时，抽去上清液，用离心的方法洗去杂质离子，离心浓缩得到矿化胶原胶冻； 步骤S1-6、检测步骤S1-5获得的矿化胶原胶冻中固体物质的含量，对胶冻进行稀释或者浓缩，使其中固体物质的含量达到0.72?0.9g/mL; 步骤S1-7、量取一定量步骤S1-6获得的矿化胶原胶冻填入模具中，进行充分冷冻干燥，获得矿化胶原支架，并进行切割剪裁； 步骤S1-8、配制浓度为0.005?0.25的％的戊二醛的乙醇溶液作为交联剂，将步骤31-7获得的矿化胶原支架浸泡于交联剂溶液中24?48小时，进行交联； 步骤S1-9、将矿化胶原支架从交联剂溶液中取出，置于层析柱中，以流动的纯水洗涤48?72小时，以除去残留的交联剂； 步骤S1-10、将步骤S1-9获得的矿化胶原支架进行真空干燥或者冷冻干燥； 步骤S1-11、对步骤S1-10获得的矿化胶原支架进行后处理、清洗和灭菌，获得矿化胶原基生物牙根支架，其中，对支架的后处理包括但不限于:加工通孔或者盲孔、加工表面沟槽/纹路/图案、边缘倒角、修剪，灭菌后封存； 步骤S2、生物牙根支架/细胞复合体的制备，具体包括: 步骤S2-1、选用符合生产质量管理规范条件下培养的异体牙髓干细胞，将I X 17牙髓干细胞消化后用培养基吹打混匀，通过滴加和负压吸附的方式接种于生物牙根支架材料上；步骤S2-2、将步骤S2-3获得的支架材料在培养箱中静置4小时，然后放入旋转式三维培养器内继续培养，转速2-5次/分钟，每三天换液，培养5天； 步骤S3、生物牙根支架/细胞/膜片复合体的制备，具体包括: 步骤S3-1、选用符合生产质量管理规范条件下培养的自体或异体牙周膜干细胞，将生长旺盛的第二或第三代牙周膜干细胞接种在1cm培养皿，培养成分为α-ΜΕΜ培养基，含15%胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100yg/ml链霉素，20.0yg/ml维生素C，每三天换液； 步骤S3-2、培养10-14天后，培养皿边缘细胞出现皱褶，用较钝刀片或细胞刮子将细胞膜片整体揭下来，过程中细胞膜片不要干燥； 步骤S3-3、将步骤S3-2获得的牙周膜片完整展开，对折，并将液体吸干，将步骤S2-4获得的支架/细胞复合体放置于牙周膜片的一侧，向另一侧卷起包裹支架/细胞复合体。6.根据权利要求5所述一种含仿生牙周膜的生物牙根支架/细胞/膜片复合体的制备方法，其特征在于所述符合生产质量管理规范条件下培养的异体干细胞还包括以下牙源性干细胞:牙囊干细胞、牙髓干细胞、根尖牙乳头干细胞、脱落乳牙干细胞、牙龈干细胞。
【专利摘要】本发明将动物源性的I型胶原与羟基磷灰石制备成牙根样生物牙根支架，再将牙髓干细胞附着在其上，并且外侧包裹有牙周细胞膜片，形成生物牙根支架/细胞/膜片复合体，再将复合体植入动物颌骨内进行生物牙根的再生。实施本发明，可以获得生物牙根支架/细胞/膜片复合体，植入动物颌骨内进行再生出的生物牙根不仅在结构和成分上与天然牙根相似，同时含有牙周膜结构，带冠后能行使功能，并能后期进行功能性改建。因此，本发明的生物牙根支架/细胞/膜片复合体进行牙根再生具有与天然牙根一致的成分和结构，并且含有牙周膜结构，在牙根再生的应用中有利于生物牙根的构建，具有广阔的临床应用前景。
【IPC分类】A61L27/12, A61L27/18, A61L27/50, A61L27/56, A61L27/24
【公开号】CN105536061
【申请号】CN201510634361
【发明人】王松灵, 胡磊, 韩子韵, 高振华, 王秀梅, 裘志烨, 王硕, 崔福斋
【申请人】王松灵
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2015年9月30日
文档序号 :
【 9773875 】
技术研发人员：王松灵,胡磊,韩子韵,高振华,王秀梅,裘志烨,王硕,崔福斋
技术所有人：王松灵
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：王松灵,胡磊,韩子韵,高振华,王秀梅,裘志烨,王硕,崔福斋
技术所有人：王松灵
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除