含仿生牙周膜的生物牙根支架/细胞/膜片复合体及其组织工程构建方法
[0022]所述仿生牙周膜中，膜片由2-3层细胞构成，其中水分占50?80wt%，除水分以外的物质组成中，胶原纤维占60?75wt%。
[0023]本发明的第二方面，提供了含仿生牙周膜的生物牙根支架的制备方法。
[0024]该制备方法综合了体外仿生矿化技术和细胞膜片技术，主要包括以下步骤:
[0025]步骤S1-1、将胶原溶于盐酸、硝酸或醋酸中的任何一种，配制成胶原的酸溶液，其中胶原浓度为5.0 X 10—5?5.0 X 10—3g/mL ；
[0026]步骤S1-2、持续搅拌步骤Sl-1获得的溶液，缓慢滴加含钙离子的溶液，钙离子的加入量为每克胶原对应加入I丐尚子0.0I?0.16mol ；
[0027]步骤S1-3、持续搅拌步骤S1-2获得的溶液，缓慢滴加含磷酸根离子的溶液，磷酸根离子的加入量与步骤S1-2中钙离子加入量的摩尔比为Ca/P = 1/1?2/1;
[0028]步骤S1-4、持续搅拌步骤S1-3获得的溶液，缓慢滴加NaOH溶液至混合体系pH=6?8，当pH=5?6时，混合体系开始出现沉淀，当pH=7时，混合体系出现白色悬浊液；
[0029]步骤S1-5、将步骤S1-4获得的混合体系静置24?120小时，抽去上清液，用离心的方法洗去杂质离子，离心浓缩得到矿化胶原胶冻；
[0030]步骤S1-6、将步骤S1-5获得的胶冻进行冷冻干燥，研磨后获得矿化胶原粉体。
[0031]本发明的第三方面，提供了含仿生牙周膜的生物牙根支架/细胞复合体制作方法。
[0032]含仿生牙周膜的生物牙根支架/细胞复合体制备过程包括以下步骤:
[0033]步骤S2-1、选用符合生产质量管理规范(GMP)条件下培养的自体或异体牙周膜干细胞，将生长旺盛的第二或第三代牙周膜干细胞接种在1cm培养皿，培养成分为α-ΜΕΜ培养基(含15 %胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100yg/ml链霉素，20.0yg/ml维生素C)，每三天换液；
[0034]步骤S2-2、培养10-14天后，培养皿边缘细胞出现皱褶，用较钝刀片或细胞刮子将细胞膜片整体揭下来，过程中细胞膜片不要干燥；
[0035]步骤S2-3、选用符合生产质量管理规范(GMP)条件下培养的异体牙髓干细胞，将1x107牙髓干细胞消化后用培养基吹打混匀，通过滴加和负压吸附的方式接种于生物牙根支架材料上:
[0036]步骤S2-4、将步骤S2-3获得的支架材料在培养箱中静置4小时，然后放入旋转式三维培养器内继续培养，转速2-5次/分钟，每三天换液，培养5天；
[0037]步骤S2-5、将步骤S2-2获得的牙周膜片完整展开，对折，并将液体吸干，将步骤S2-4获得的支架/细胞复合体放置于牙周膜片的一侧，向另一侧卷起包裹支架/细胞复合体，松紧合适。
[0038]所述符合生产质量管理规范(GMP)条件下培养的异体干细胞还可以为以下牙源性干细胞，如牙囊干细胞、牙髓干细胞、根尖牙乳头干细胞、脱落乳牙干细胞、牙龈干细胞。
[0039]本发明的第四方面，提供了含仿生牙周膜的生物牙根的组织工程学构建方法。
[0040]该构建方法主要包括以下步骤:
[0041]步骤S3-1、检测步骤S1-5获得的矿化胶原胶冻中固体物质的含量，对胶冻进行稀释或者浓缩，使其中固体物质的含量达到0.72?0.9g/mL;
[0042]步骤S3-2、量取一定量步骤S2a_l获得的矿化胶原胶冻填入模具中，进行充分冷冻干燥，获得矿化胶原支架，并进行切割剪裁；
[0043]步骤S3-3、配制浓度为0.005?0.25wt %的戊二醛的乙醇溶液作为交联剂，将步骤S2a-2获得的矿化胶原支架浸泡于交联剂溶液中24?48小时，进行交联；
[0044]步骤S3-4、将矿化胶原支架从交联剂溶液中取出，置于层析柱中，以流动的纯水洗涤48?72小时，以除去残留的交联剂；
[0045]步骤S3-5、将步骤S3-4获得的矿化胶原支架进行真空干燥或者冷冻干燥；
[0046]步骤S3-6、对步骤S3-5获得的矿化胶原支架进行后处理、清洗和灭菌，获得矿化胶原基生物牙根支架，其中，对支架的后处理包括但不限于:加工通孔或者盲孔、加工表面沟槽/纹路/图案、边缘倒角、修剪。灭菌后封存。
[0047]支架在微观上具有一定的孔隙结构，孔隙率为70%?95%，孔径为50?500μπι。在宏观上:该支架的外形为柱状体;柱状体的高度为9?12mm;柱状体的外侧面被垂直于柱状体轴向的平面所截得的形状为圆形或者近似圆形，周长为11?14_;内部可以具有沿柱状体轴向方向的通孔，或者开口朝柱状体底面的盲孔，盲孔沿柱状体轴向的长度不小于柱状体高度的2/3;柱状体内部盲孔或通孔的侧面被垂直于柱状体轴向的平面所截得的形状为圆形或者近似圆形，周长为3.0?6.0mm。
[0048]步骤S3-7、选用符合生产质量管理规范(GMP)条件下培养的异体牙髓干细胞，将IxlO7牙髓干细胞消化后用培养基吹打混匀，通过滴加和负压吸附的方式接种于步骤S3-6获得的生物牙根支架材料上。
[0049]所述符合生产质量管理规范(GMP)条件下培养的牙髓干细胞还可以为以下牙源性干细胞，如牙囊干细胞、牙周膜干细胞、根尖牙乳头干细胞、脱落乳牙干细胞、牙龈干细胞。
[0050]步骤S3-8、将步骤S3-7获得的支架材料在培养箱中静置4小时，然后放入旋转式三维培养器内继续培养，转速2-5次/分钟，每三天换液，培养5天；
[0051]步骤S3-9、将步骤S2-2获得的牙周膜片完整展开，对折，并将液体吸干，将步骤S3-8获得的支架/细胞复合体放置于牙周膜片的一侧，向另一侧卷起包裹支架/细胞复合体，松紧合适，形成支架/细胞/膜片复合体；
[0052]步骤S3-10、小型猪下颂前牙区牙齿拔除后3个月后，行生物牙根植入术；
[0053]手术过程:
[0054](I)麻醉:速眠新11+氯胺酮15mg/kg肌肉注射麻醉。备皮后使用2%碘伏进行头面部及口腔内消毒，铺巾。阿替卡因局部浸润麻醉。
[0055](2)下颂前牙区设计牙槽嵴顶切口，切开至骨面，翻起粘骨膜瓣，见下颂骨前牙缺牙区牙槽骨平整，宽度充足，先锋钻定位，逐级扩孔，备洞，牙槽嵴顶处植入支架/细胞/膜片复合体，植入时扭矩约35Ncm，采用潜入式植入，可吸收缝线严密缝合伤口。
[0056]步骤S3-11、种植手术后，小型猪当天肌肉注射(抗生素)青霉素80万u/只，连续三天给予添加青霉素饲料喂养。分别于术后I周、2周、4周观察伤口愈合情况，有无感染；
[0057]步骤S3-12、生物牙根植入术后6个月，生物牙根再生成功，行上部结构修复。沿原手术切口切开，翻瓣，暴露生物牙根，修整牙龈形态，将生物牙根暴露口腔内，严密缝合伤P;
[0058]步骤S3-13、I周后，可见牙龈外形恢复良好，硅橡胶采生物牙根内部印模，氧化锌暂封，灌注石膏模型，制作金属粧核；
[0059]步骤S3-14、就戴金素粧核，就位顺利，边缘密合，玻璃离子粘接，全冠牙体预备，硅橡胶取印模，灌注石膏模型，制作烤瓷全冠；
[0060]步骤S3-15、在缺牙区排蜡牙，硅橡胶翻印模，阴模内缺牙区部位加注自凝树脂，复位印模，待自凝树脂凝固后，取下硅橡胶印模，调磨、修整自凝树脂牙冠，抛光、消毒，玻璃离子粘接；
[0061]步骤S3_16、l周后于小型猪口内卸下临时冠，试戴烤瓷牙冠，就位顺利，边缘密合，玻璃离子粘接；
[0062]步骤S3-17、分别在全冠就戴3、6个月后取组织进行组织学及临床疗效评价，发现生物牙根周围有牙周膜样组织，sharpy纤维从牙根表面斜插入牙槽骨内，牙周组织健康。
【
文档序号 :
【 9773875 】
技术研发人员：王松灵,胡磊,韩子韵,高振华,王秀梅,裘志烨,王硕,崔福斋
技术所有人：王松灵
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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