抗链球菌的联合疫苗的制作方法
专利名称：：抗链球菌的联合疫苗的制作方法抗链球菌的联合疫苗本发明涉及保护鱼类免受链球菌感染的联合疫苗，以及所迷联合疫苗的制备方法。链球菌属GSYrep&coccM)的多种细菌是目前所知引发鱼类感染的原因，尤其是水产养殖鱼类。此类链球菌种的实例为海豚链球菌("5Yre/7Z^cocc^//7yaeJ,难辨链球菌(&cT//Y7c/7e)、无孝L链球菌(5,柳/sc〃ae)、停乳链球菌(i1,々柳hc〃ae)和海豹链球菌(5./7力0cae)。近来，对难辨链球菌和无乳链球菌的命名有所争议。Vandamme等人(Int.J.Syst.Bacteriology47:81-85(1995))建议难辨链球菌实际上为非溶血性无乳链球菌(无乳链球菌为P-溶血性细菌)。为了方便，本文使用传统的命名法，即海豚链球菌、难辨链球菌、无乳链球菌。海豚链球菌常见于罗非鱼(Tilapia)、虹鳟(Rainbowtrout)、欧洲黑舻(Europeanseabass)和欧鳊(Europeanbream)、亚洲黑妒(Asianseabass)、美国红鱼(Reddrum)、鲭带鱼(Rabbitfish)、牙鲜(Japaneseflounder)、黄《师鱼(Yellowtail)和杂交条紋鲈鱼(hybridstripedbass)。海豚链球菌感染对水生养殖的年度影响超过1亿美元。难辨链球菌常见于亚洲黑鲈、罗非鱼、红鳍笛鲷(Snapper)和鲶鱼(Catfish)。目前发现无乳链球菌主要感染罗非鱼。抗鱼类链球菌感染的疫苗为本领域所知。许多链球菌疫苗基于被杀死的完整细胞。无乳链球菌疫苗具体描迷于美国专利申请US2005/0208077。海豚链球菌疫苗具体描述于美国专利US6，379,677。抗海豚链球菌感染的疫苗也已经商业化。例如抗海豚链球菌感染的疫苗NorvaxStrepSi可从IntervetInt.公司购得。Eldar等人(Vaccine13:867-870(1995))描述了基于被杀死的完整细胞的抗难辨链球菌的疫苗。鉴于海豚链球菌和难辨链球菌为常见引发鱼类(尤其是罗非鱼和亚洲黑炉)疾病的原因，施用药物时联合使用对抗海豚链球菌和难辨链球菌的疫苗似乎很有吸引力。然而出乎意料的是，当海豚链球菌和难辨链球菌作为联合疫苗使用时，严重的损坏了其抵抗海豚链球菌的保护作用。另一方面，如果不用难辨链球菌疫苗，仅腹膜内(IP)施用海豚链球菌疫苗时，其抗海豚链球菌的保护作用如所料。出于不明原因，似乎联合疫苗中难辨链球菌的存在可高度抑制抗海豚链球菌免疫应答的产生。本发明的目的就是提供解决所述问题的方法。令人吃惊的是，如果保护鱼类免受链球菌感染的联合疫苗中含有免疫原性量的难辨链球菌细胞和免疫原性量的海豚链球菌细胞，其中难辨链球菌细胞对海豚链球菌细胞的比值大于或等于(>)40:10时，所述疫苗抗海豚链球菌免疫应答产生的抑制现象或是发生在可接受的范围，或是根本不出现。如上所述，所含免疫原性量的难辨链球菌细胞和免疫原性量的海豚链球菌细胞当然要能够引起对其各自细菌种属的免疫应答反应。然7而，疫苗中难辨链球菌细胞的含量应该至少为海豚链球菌细胞含量的四倍。因此，本发明的第一个实施方案涉及保护鱼类免受链球菌感染的联合疫苗，所述疫苗的特征是它含有免疫原性量的难辨链球菌(Streptococcusdifficile)细胞和免疫原性量的海豚链球菌(Streptococcusiriiae)细胞，其中难辨链球菌细胞对海豚链球菌细胞的比值>40:10。可从本文的实施例中更清楚地认识到，难辨链球菌细胞量比海豚链球菌细胞量多四倍以上的联合疫苗，对生成抗海豚链球菌免疫应答的抑制作用甚至更低。因此，优选的联合疫苗其难辨链球菌细胞对海豚链球菌细胞的比值>40:8，更优选的比值依次为>40:6、>40:2、>40:2和>40:1。因此，根据本发明其实施方案的优选形式涉及联合疫苗，其中所述比值为>40:8,更优选的为>40:6，进一步优选的为>40:4,再进一步优选的为>40:2，以及最优选的为>40:1。传统上，许多亚洲鱼疫苗被尽可能做成水基质疫苗。它们不含油相。然而目前倾向于制成油包水乳液、水包油包水乳液或水包油乳液。与相应的水基质疫苗相比，这些乳液疫苗有更有效的优势。此外，乳液疫苗所用抗原量更少。因此，根据本发明其实施方案的另一优选形式涉及联合疫苗，其中疫苗为油包水疫苗。根据本发明其实施方案的另一优选形式仍然涉及联合疫苗，其中疫苗为水包油疫苗。根据本发明其实施方案的另一优选形式再次涉及联合疫苗，其中疫苗为水包油包水疫苗。水基质疫苗和基于水和油的乳液都遇到联合疫苗中难辨链球菌的存在高度抑制抗海豚链球菌免疫应答产生的问题，所述问题已被解决。如上文提供的方法只是对该问题的一个解决方案。如果基于油和水的乳液被用于疫苗，另一个解决方案也是可行的，可以与上述解决方案联合使用。令人吃惊的是，如果海豚链球菌细胞和难辨链球菌细胞分别处于油包水乳液的不同水滴中时，所述问题就会次显著或甚至不显著。此种情况下，原则上难辨链球菌细胞对海豚链球菌细胞的比值甚至不需维持在>40:8。海豚链球菌细胞和难辨链球菌细胞分别处于不同水滴中的油包水乳液其制备相对简便。制备基本油包水乳液的标准程序是基于一定量的单水相、单油相和一定量细菌细胞的混合。水相可仅为水、水基质緩沖液等。油相可为矿物或非矿物油(见下)。此外，可加入一种或多种乳化剂和/或去污剂。制备这些乳液的方法及所用组份为本领域所熟知的。本发明所用方法不同于标准方法的是使用了两种而非一种水相；一种水相包含海豚链球菌细胞，而另一种水相包含难辨链球菌细胞。目前，两种水相都可用一定量的油相乳化，分别制备油包水乳液后，再混合两种油包水乳液。对此方法的改变可为先制备包含两种链球菌细胞类型之一的油包水乳液，并如在乳化过程中向水相中加入另一种类型的链球菌细胞。如此操做，(大多数)第二种类型的链球菌细胞会自动整合入油包水乳液的新生水滴中。不言而喻，不论制备方法如何，海豚链球菌细胞和难辨链球菌细胞分别处于乳液不同水滴中的油包水乳液总在本发明的范畴之中。因此，本发明的另一实施方案涉及保护鱼类免受链球菌感染的联合疫苗，其中所述疫苗为油包水疫苗，所述疫苗包含免疫原性量的海豚链球菌细胞和难辨链球菌细胞，其中海豚链球菌细胞和难辨链球菌细胞分别处于所述油包水乳液的不同水滴中。另一种可能为使用水包油包水乳液，其中免疫原性量的海豚链球菌细胞和难辨链球菌细胞分别处于所迷水包油包水乳液的不同水滴中。该种乳液包含水滴，其位于小油滴内，该油滴又被水相包围。因此，所述实施方案的另一形式涉及保护鱼类免受链球菌感染的联合疫苗，其中所迷疫苗为水包油包水乳液，所述疫苗含有免疫原性量的海豚链球菌和难辨链球菌细胞，其中海豚链球菌组份和难辨链球菌组份分别处于所迷水包油包水乳液的不同氷滴中。使海豚链球菌细胞和难辨链球菌细胞分别处于水包油包水乳液中的另一种可能性也是先制备油包水乳液，其中所迷水相只含有海豚链球菌细胞或难辨链球菌细胞。下一步，可用水相乳化所述油包水乳液，该水相含所述两种细菌组份中的另一种组份，也即难辨链球菌细胞或海豚链球菌细胞。因此，所述实施方案的另一种形式也涉及保护鱼类免受链球菌感染的联合疫苗，其中所述疫苗为水包油包水疫苗，所述疫苗含有免疫原性量的海豚链球菌细胞和难辨链球菌细胞，其中海豚链球菌细胞位于所述水包油包水乳液油相包裹的水滴中，而难辨链球菌细胞位于所述水包油包水乳液的自由水相中。10因此，所述实施方案的另一种形式也涉及保护鱼类免受链球菌感染的联合疫苗，其中所述疫苗为水包油包水疫苗，所述疫苗含有免疫原性量的海豚链球菌细胞和难辨链球菌细胞。其中难辨链球菌细胞位于所述水包油包水乳液油相包裹的水滴中，而海豚链球菌细胞位于所述水包油包水乳液的自由水相中。如上所述的油包水乳液和水包油包水乳液在一段时间后，倾向于形成沉淀(油包水)或分层(水包油包水)而后在最坏的情况下会破碎。所述现象尤其取决于液滴大小、储存时间和温度、所用乳化剂等等。因此，能得到最佳效果的联合疫苗为难辨链球菌细胞对海豚链球菌细胞的比率>40:8，此外两种细菌组份被另外分离于如上所述的不同液滴或不同水相中。这样的疫苗有两步保障即使乳液破碎，难辨链球菌细胞对海豚链球菌细胞的比例也能保证疫苗的效率。因此，本发明的另一种实施方案涉及保护鱼类免受链球菌感染的油包水或水包油包水联合疫苗，其中所述疫苗含有免疫原性量的难辨链球菌细胞和免疫原性量的海豚链球菌细胞，其中难辨链球菌细胞对海豚链球菌细胞的比值为依次优选为>40:10、>40:8、>40:6、>40:4、>40:2或>40:1，而且其中海豚链球菌细胞和难辨链球菌细胞分别处于所述油包水或水包油包水乳液的不同水滴中。所述实施方案的另一种形式涉及保护鱼类免受链球菌感染的水油水联合疫苗，其中所述疫苗含有免疫原性量的难辨链球菌细胞和免疫原性量的海豚链球菌细胞，其中难辨链球菌细胞对海豚链球菌细胞的比值为依次优选为>40:10、>40:8、>40:6、>40:4、>40:2或>40:1，而且所述保护鱼类免受链球菌感染的联合疫苗中海豚链球菌细胞位于所迷水包油包水乳液油相包裹的水相液滴中，而难辨链球菌细的自由水相中。所述实施方案的另一形式也涉及保护鱼类免受链球菌感染的水油水联合疫苗，其中所述疫苗含有免疫原性量的难辨链球菌细胞和免疫原性量的海豚链球菌细胞。其中难辨链球菌细胞对海豚链球菌细胞的比值依次优选为>40:10、>40:8、>40:6、>40:4、>40:2或>40-1，而且所述保护鱼类免受链球菌感染的联合疫苗中难辨链球菌细胞位于所述水包油包水乳液油相包裹的水相液滴中，而海豚链球菌细胞位于所述水包油包水乳液的自由水相中。根据本发明，优选形式的联合疫苗也可包含免疫刺激物质(immunostitnulatorysubstance)，也叫4故佐齐寸。佐剂通常包含能以非特异性的方式增强宿主免疫应答的物质。多种不同佐剂都为本领域所熟知的。常用于鱼类和贝类养殖的典型佐剂有胞壁酰二肽(muramyldipeptides)、月旨多糖(1ipopolysaccharides)、数种葡聚糖(glucans)和聚糖(glycans)及卡伯波")(Carbopol(R))(—种均聚物)。JanRaa的综述论文对于适用于鱼类和贝类疫苗的佐剂提供了广泛概述(ReviewsinFisheriesScience4(3):229-288(1996))。疫苗也可包含所谓的"栽体"。栽体为有细菌粘附而不共价结合的化合物。这些载体尤其是生物孩t嚢(bio-microcapsules)、微藻酸盐(micro-alginates)、月旨质体(1iposomes)和大分子物(macrosols)都是本领域所熟知的。抗原被部分包被于载体中的一种特殊的载体形式，被称为ISC0M(EP109.942、EP180.564、EP242.380)。此外，疫苗可包含一种或多种合适的表面活性成分或乳化剂(如Span或Tween)。适用于油包水、水包油包水和水包油乳液的油性佐剂有如矿物油或可代谢油。矿物油有如Bayo^、Maco^和Drakeol。代谢油有如植物油(如花生油和大豆油)、动物油(如鱼油角篁烷和角簠烯)以及生育酚及其衍生物。加入的佐剂量取决于所述佐剂自身性质，以及厂商提供的关于这些剂量的相应信息。疫苗经常与稳定剂混合，例如可用于保护细菌免受降解、延长疫苗保质期、或是改善冻干效率。有用的稳定剂尤为SPGA、碳水化合物(如山梨醇、甘露醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖)、蛋白(如白蛋白或酪蛋白或其降解产物)和緩冲液(如碱金属磷酸盐)。如上所述，链球菌疫苗可通过诸如注射施用，通常为腹膜内注射(也叫做IP注射)。从保护的角度看，IP接种疫苗为优选的疫苗接种方法，因为它可提供较好的和持久的保护。对于非活性疫苗尤其这样。本发明的疫苗基本包含免疫原性量的细菌以及药学适用载体。其中所用术语"免疫原性(immunogenic)"被定义为足以在目标鱼中引发免疫应答的量。药学适用载体可简单如水或緩冲液或乳液。施用细胞的量取决于所用链球菌种类、是否有佐剂、施用用途、施用时间、待免疫的鱼龄、普遍健康情况、水温和饮食。当使用商业化可得疫苗时，生产商会提供此类信息。一般来讲，本发明所用基于死菌苗的疫苗通常施用剂量可为103到101。、优选106到109、更优选的为108到109之间的细菌量。超过101。的细菌量虽然也有免疫活性，但出于商业原因少受关注。本发明基于减毒的活细菌的疫苗可以较低剂量使用，因为细菌在施用后一定时间内可以继续复制。一般来讲，本发明所用疫苗优选为保护鱼类免受链球菌感染的疫苗，此外所述疫苗也可抗一种或多种鱼类病原病毒或微生物。因此，生产所述疫苗时除链球菌外，在联合疫苗中同时使用至少一种其它鱼类病原微生物或病毒、该微生物或病毒的抗原或编码该抗原的遗传物质是有益的。这样的疫苗其好处在于它不仅提供了对抗链球菌感染的保护，也保护鱼类免于其它疾病。因此，所述实施方案的优选形式涉及疫苗，其中所述疫苗包含至少一种鱼类的其他病原微生物或病毒、或一种其它抗原或编码该抗原的遗传物质，其中所述其他抗原或遗传物质源于鱼类病原病毒或微生物。热带和/或地中海鱼类的典型重要商业化病原体为鳗孤菌(f76Woa/^z/"ar咖)、美人鱼发光杆菌(户力o励a"er/咖^9/Hse/ae)杀鱼(//sc/c/ds)亚种、海洋屈挽杆菌(re/7ac/6scjy/w迈迈ar/t/迈i/迈)、黄杆菌(尸/a一a"er/"迈577,)、屈挠杆菌(尸/ez/^s"e,sp.),力口氏享L球菌(Za"ococci/s^srr/ae)、迟純爱德华菌(f^rards/e//s"r&)、鯰鱼爱德华菌(i./c"/ur/)、病毒性坏死病毒(ViralNecrosisvirus)、虹彩病毒(iridovirus)、鲤鱼春季病毒血症病毒(SpringViremiaofCarpvirus)和锦鲤疱渗病毒(KoiHerpesvirus)。重要的商业化寒水鱼病原体实例为鳗弧菌、杀鲑气单胞菌(Jer咖o/"s"a细/7/c/^se),杀鲑弧菌(K/6r/<9sa7咖/2/c油e)、粘被孢菌(#or"e"<2r/"c^),病海弧菌(F/6Wo、黄杆菌、屈挠杆菌、链球菌(i7r—)、力口氏乳球菌，迟钝爱德华菌，鲶鱼爱德华菌、鲑鱼立克次氏体(户/sc/Wci:e"sias"迈加2、)、鲑鱼胰腺病病毒(SalmonPancreaticDiseasevirus)、睡眠病病毒(SleepingDiseasevirus)、病毒性神经坏死病毒(ViralNervousNecrosisvirus)、传染性胰脏坏死病毒(InfectiousPancreaticNecrosisvirus)、传染性造血器官坏死病毒(Infectioushaematopoieticnecrosisvirus)、传染性鲑鱼贫血病毒(InfectiousSalmonAnaemiavirus)、病毒性出血败血症病毒(ViralHaemorrhagicSepticaemiavirus)和虹彩病毒。感染鲑鱼(Salmonids)的寄生虫有如鲑鱼齊痂鱼氣(丄e/7eop/^力erif/ssfl/边o//s)、长身鱼IL(CaZ/gz/se/o/g"i^)、鲑隐鞭虫(Cr/一6/aw/迈os/〃ca)、脑粘液丸虫(妙;r由/wscer6ra〃;？)和杖鱼库多虫(f油a^戸"es)。感染淡水鱼的寄生虫有如多毛鱼虱(/c/^力，雄/r/"s迈"/"77///50。罗非鱼寄生虫有力口指环虫("ac0^c^7r"^)和车轮虫(7>/^力0^//"<3)。海洋鱼类可能尤其受寄生虫本尼登虫(^/2^/e/2iaser/o/se)的感染因此，在所述实施方案的更优化形式中，其他微生物或病毒选自以下鱼类病原体缦弧菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、海洋屈挠杆菌、黄杆菌、屈挠杆菌、加氏乳球菌、迟钝爱德华菌、鲶鱼爱德华菌、病毒性坏死病毒、鲤鱼春季病毒血症病毒、虹彩病毒、传染性造血器官坏死病毒、传染性鲑鱼贫血病毒、病毒性出血败血症病毒和锦鲤疱渗病毒、杀鲑气单胞菌、杀鲑弧菌、粘被孢菌、病海弧菌，鲑鱼立克次氏体，鲑鱼胰腺病病毒、睡眠病病毒、病毒性神经坏死病毒、传染性胰脏坏死病毒、虹彩病毒、鲑鱼疮痂鱼虱、长身鱼虱、鲑隐鞭虫、脑粘液丸虫、杖鱼库多虫、多毛鱼虱，指环虫、车轮虫和本尼登虫。此外，本发明涉及联合疫苗的制备方法，所述疫苗可用于保护鱼类免受链球菌感染，其中所述疫苗为含有免疫原性量海豚链球菌细胞和难辨链球菌细胞的油包水疫苗或水包油包水疫苗，其中海豚链球菌细胞和难辨链球菌细胞分别处于所述油包水或水包油包水乳液的不同水滴中，其中所述方法包括制备含有免疫原性量海豚链球菌细胞的油包水或水包油包水乳液及含有免疫原性量难辨链球菌细胞的油包水或水包油包水乳液的步骤，及随后混合两种乳液的步骤。本发明还涉及联合疫苗的制备方法，所述疫苗可用于保护鱼类免受链球菌感染，其中所述疫苗为含有免疫原性量海豚链球菌细胞和难辨链球菌细胞的水包油包水疫苗，其中所述疫苗的海豚链球菌细胞位于所述水包油包水乳液油相包裹的水滴中，而难辨链球菌细胞位于所述水包油包水乳液的自由水相中，所述方法包括制备油包水乳液的步骤，其水相仅含有海豚链球菌细胞或难辨链球菌细胞，及随后的用水相乳化该油包水乳液的步骤，该水相含有两种细菌组份(也即难辨链球菌细胞或海豚链球菌细胞)的另一种细菌。实施例-实施例1.以不同难辨链球菌和海豚链球菌抗原比例制备的罗非鱼疫苗效用评估本实施例所用攻击菌林为野生型难辨链球菌菌林和野生型海豚链球菌菌抹。;^萝用于制备疫苗的所有细菌培养物都源自野生型难辨链球菌和海豚链球菌菌抹，并用福尔马林灭活。商业化可得产品ISA736AVG在疫苗制备中被用作油性佐剂。含不同比率两种抗原的六种疫苗被检测。表1所示为每种疫苗的组成。16表1显示多种配方所用疫苗组成及各抗原浓度的详细信息<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>实验设计,验逸所述实验总共使用了315条大小相近的鱼，这些鱼被分成7组，每组45条。耕为确保完全排空胃肠道，接种前使所有鱼饥饿48小时，对每组含45条鱼的六个实验组各接种一种疫苗，另一组含45条鱼的实验组作为对照组不做处理。麻醉被接种的每组鱼，并向每条鱼手工注射0.05ml所设计的一种疫苗。在每条鱼身体侧面靠近胸鳍尖的正后方进行腹膜内注射。对接种后的观察持续24天。攻击芽祷培#海豚链球菌攻击菌种瓶取自<-5(TC的冰箱，解冻并将内容物接种至100.Oml胰蛋白胨大豆肉汤(TrypUcSoyBroth)。在32°C、转速为150RPM的摇床中培养。培养23小时后，培养产物0D刷为0.804。用0.9%NaCl制备0D"。为0.715的细菌悬液，作为攻击物质前先室温放置2小时。难辨链球菌攻击菌种瓶取自<-50。C的水箱，解冻并将内容物接种至100.0ml链球菌生长培养基(StreptococcalGrowthMedium)。在32。C、转速为150RPM的摇床中培养。培养24小时后，培养产物0D"。为0.176。用0.9%NaCl将部分培养物制成OD柳为0.133的细菌悬液，而后进一步稀释100倍，所得悬液被用作攻击物质。为确保完全排空胃肠道，攻击实验前使所有鱼饥饿48小时。通过IP注射进行攻击。所有鱼都被麻醉并在靠近胸鳍尖的正后方进行腹膜内注射，注射0.1ml标准化的细菌悬液。攻击后，将所有鱼转入其指定的容器中，并随后使其从麻醉处理中恢复。表2显示攻击悬液中的活菌数。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>接种后24天期间无死亡现象。各组每条鱼在接种后24天时体重增加平均值如以下表3所示。表3显示每条鱼在接种后24天时体重增加的平均值<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>未观察到多种实验组间的每条鱼体重增加平均值有明显差异。遽麥欢力评估6种二联疫苗的效力并用。/。RPS(相对存活百分率)表示。表4所示为每个接种组各攻击菌林的y。RPS数据。所记录所有被攻击鱼的死亡率都基于攻击细菌的阳性再分离。表4显示每个接种组各攻击菌林的。/oRPS数据以及用特定病原体攻击的对照组的死亡百分率。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>图l和2显示在接种后24天时对于用特定菌林攻击所得结果的各疫苗的RPS值。图1表示二联疫苗抵抗难辨链球菌攻击的效力。对照组攻击细菌阳性再分离致死率为93%。所有油性佐剂二联疫苗显示出抗难辨链球菌的保护作用。未见用水配制的二联疫苗有抗难辨链球菌的保护作用。这最可能与根本没有佐剂相关。配制比例(难辨链球菌海豚链球菌)为40:2和40:8的油性佐剂疫苗抗难辨链球菌的RPS为71%,而40:1和40:4的疫苗产生更低的RPS值，为64%RPS。所得RPS值最低的油性佐剂二联疫苗为40:40(难辨链球菌海豚链球菌)制剂，为50%RPS。图2显示二联疫苗抵抗海豚链球菌攻击的效力。所有二联疫苗都显示出抗海豚链球菌的保护作用，对照组攻击菌抹阳性再分离致死率为46°/。。未见配制比例(难辨链球菌海豚链球菌)为40:1的水基质疫苗和配制比例为40:l及40:2的油性疫苗间的保护水平有明显的差异，每个疫苗都给出相同的RPS值，为71%。然而，当油性佐剂疫苗中难辨链球菌海豚链球菌比例从40:4降低到40:8和40:40时，观察到所得RPS值减少。所述油性佐剂疫苗的RPS值分别为57%、42%和14%。结论本研究所得结果显示，在接种后期，每个接种组鱼的平均体重与对照组相比无显著差异。因此，所有配制的二联疫苗当其施用剂量为每鱼O.05ml时，用于罗非鱼IP接种是安全的。难辨链球菌攻击结杲显示佐剂(优选油性佐剂)是二联(难辨链球菌和海豚链球菌)疫苗有效抗难辨链球菌所必需的。观察到对照组攻击菌林阳性再分离致死率为93%，并观察到所有油性疫苗都在不同水平显示保护作用观察到40:40(难辨链球菌海豚链球菌)疫苗20制剂的RPS值最低，为50.0%。对照组海豚链球菌攻击显示46%的攻击菌林阳性再分离致死率。比例为40:1(难辨链球菌和海豚链球菌)的水基质二联疫苗制剂和所有油性佐剂二联疫苗都显示抗海豚链球菌的保护作用。然而，40:40(难辨链球菌海豚链球菌)的油性佐剂疫苗制剂再次显示出最低RPSt0%。本研究显示当难辨链球菌抗原在制剂中的水平高出海豚链球菌抗原(基于细胞细胞)40或20倍时，可得到抗难辨链球菌的64%RPS或71。/。RPS值，以及对抗海豚链球菌的71。/。RPS值。附图简述图1:二联疫苗4氐抗难辨链球菌攻击的效力。图2:二联疫苗抵抗海豚链球菌攻击的效力。权利要求1.保护鱼类免受链球菌感染的联合疫苗，所述疫苗特征为含有免疫原性量的难辨链球菌(Streptococcusdifficile)细胞和免疫原性量的海豚链球菌(Streptococcusiniae)细胞，其中难辨链球菌细胞对海豚链球菌细胞的比值为≥40∶10。2.权利要求l的联合疫苗，特征在于所述比值为>40:8、优选为>40:6、更优选为>40:4、甚至进一步优选为>40:2以及最为优选为>40:1。3.权利要求1或2的联合疫苗，特征在于是油包水疫苗。4.权利要求1或2的联合疫苗，特征在于是水包油包水疫苗。5.保护鱼类免受链球菌感染的联合疫苗，特征在于所述疫苗是油包水疫苗，含有免疫原性量的海豚链球菌细胞和难辨链球菌细胞，其中海豚链球菌细胞和难辨链球菌细胞分别处于所述油包水乳液的不同水相液滴中。6.保护鱼类免受链球菌感染的联合疫苗，特征在于所述疫苗是水包油包水疫苗，含有免疫原性量的海豚链球菌细胞和难辨链球菌细胞，其中海豚链球菌细胞和难辨链球菌细胞分别处于所述水包油包水乳液的不同水相液滴中。7.保护鱼类免受链球菌感染的联合疫苗，其特征在于所述疫苗是水包油包水疫苗，含有免疫原性量的海豚链球菌细胞和难辨链球菌细胞，其中海豚链球菌细胞处于所述水包油包水乳液的被油相包裹的水相液滴中，而难辨链球菌细胞处于所迷水包油包水乳液的自由水相中。8.保护鱼类免受链球菌感染的联合疫苗，特征在于所述疫苗是水包油包水疫苗，含有免疫原性量的海豚链球菌细胞和难辨链球菌细胞，其中难辨链球菌细胞处于所述水包油包水乳液的被油相包裹的水相液滴中，而海豚链球菌细胞处于所述水包油包水乳液的自由水相中。9.权利要求1或2的联合疫苗，特征在于所述疫苗是权利要求5的基于油包水的疫苗，或是据权利要求6-8的水包油包水疫苗。10.权利要求1-9的联合疫苗，特征在于所述联合疫苗包含佐剂。11.权利要求1-10的联合疫苗，特征在于所述联合疫苗包含至少一种其他鱼类致病微生物或病毒，或一种其他抗原或编码所述其他抗原的遗传物质，其中所述其他抗原或遗传物质源于鱼类致病病毒或微生物。12.权利要求10的联合疫苗，特征在于所述其他微生物或病毒选自以下鱼类病原体鳗弧菌(Vibrioangui1larum)、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacteriumdamselaepiscicida)、海洋屈挠杆菌(TenacibaculummarUimum)、黄軒菌(Flavobacteriumsp.),屈挠軒菌(Flexibactersp.)、力口氏乳球菌(Lactococcusgarviae)、迟钝爱德华菌(Edwardsiellatarda)、鲶鱼爱德华菌(E.ictaluri)、病毒性坏死病毒(ViralNecrosisvirus)、虹彩病毒(iridovirus)和锦鲤疱渗病毒(KoiHerpesvirus)、杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicidae),杀鲑弧菌(Vibriosalmonicidae)、粘被孢菌(Moritellaviscosa)、病海弧菌(Vibrioordalii)、鲑鱼立克次氏体(Piscirickettsiasalmonis)、鲑鱼胰腺病病毒(SalmonPancreaticDiseasevirus)、睡眠病病毒(SleepingDiseasevirus)、病毒性神经坏死病毒(ViralNervousNecrosisvirus)、传染性胰脏坏死病毒(InfectiousPancreaticNecrosisvirus)、传染性造血器官坏死病毒(Infectioushaematopoieticnecrosisvirus)、传染性鲑鱼贫血病毒(InfectiousSalmonAnaemiavirus)、病毒性出血败血症病毒(ViralHaemorrhagicSepticaemiavirus)、鲤鱼春季病毒血症病毒(SpringViremiaofCarpvirus)、虹彩病毒(iridoviruses)、鲑鱼齊痂鱼IL(Lepeophtheriussalmonis)、长身鱼IUCaliguselongatus)、鲑隐鞭虫(Cryptobiasalmositica)、脑粘液丸虫(Myxoboluscerebral")、杖鱼库多虫(Kudoathyrsites)、多毛鱼虱(IchthyophthiriusmultifilUs)、指环虫(Dactylogyrusspp.)、车轮虫(Trichodinaspp.)和本尼登虫(Benedeniaseriolae)。13.权利要求5的联合疫苗的制备方法，特征在于所述方法包括制备含有免疫原性量的海豚链球菌细胞的油包水乳液及含有免疫原性量的难辨链球菌细胞的油包水乳液的步骤，及随后混合两种乳液的步骤。14.权利要求6的联合疫苗的制备方法，特征在于所述方法包括制备含有免疫原性量的海豚链球菌细胞的水包油包水乳液及含有免疫原性量的难辨链球菌细胞的水包油包水乳液的步骤，及随后混合两种乳液的步骤。15.权利要求7的联合疫苗的制备方法，特征在于所述方法包括制备油包水乳液的步骤，其中水相仅含有海豚链球菌细胞，及随后在含有难辨链球菌细胞的水相中乳化所述油包水乳液的步骤。16.权利要求8的联合疫苗的制备方法，特征在于所述方法包括制备油包水乳液的步骤，其中水相仅含有难辨链球菌细胞，及随后在含有海豚链球菌细胞的水相中乳化所述油包水乳液的步骤。全文摘要本发明涉及保护鱼类免受链球菌感染的联合疫苗，以及所述联合疫苗的制备方法。文档编号A61K39/09GK101484184SQ200780025577公开日2009年7月15日申请日期2007年7月5日优先权日2006年7月6日发明者C·Y·恩纪,L·格里塞斯申请人:英特威国际有限公司
文档序号 :
【 1221709 】
技术研发人员：C.Y.恩纪,L.格里塞斯
技术所有人：英特威国际有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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