一种防止转基因荧光观赏鱼基因漂移的方法

本发明属于生物，具体是涉及一种防止转基因荧光观赏鱼基因漂移的方法。

背景技术：

1、crispr/cas9技术是最新一代的基因编辑技术，全称clustered regularlyinterspaced sho rt palindromic repeats(crispr)/crispr-associated 9(cas9)。该技术廉价便捷、操作简单、应用广泛，是十分具有前景的基因编辑工具。crispr最早是在大肠杆菌中发现，并于2000年命名为“crispr”(jansen r,embden j d,gaastra w,etal.identification of genes that are associated with dna repeats inprokaryotes[j].mol microbiol,2002,43(6):1565-75)，常用的crispr/cas9系统，包含cas9、sgrna两部分，cas9蛋白可以在sgrna的引导下，对靶dna双链进行切割，造成碱基的插入或缺失，从而实现基因敲除。

2、vasa基因是最初在果蝇(drosophila melanogaster)中发现的母源性基因，它在果蝇生殖细胞的形成和发育中发挥着重要的作用(schüpbach t,wieschaus e.maternal-effect mutations altering the anterior-posterior pattern of the drosophilaembryo[j].rouxs arch dev biol,1986,195(5):302-17)。vasa基因编码依赖atp的rna解旋酶，为dead－box家族的一员，广泛存在于各种生物之中。

3、vasa基因在生物的生殖中发挥着重要作用，且具有较高的同源性和保守性。在果蝇中，vasa基因的表达沉默使得雌性果蝇卵子无法正常生成，从而造成雌性果蝇不育；在斑马鱼中，vasa基因被敲除后表现为雄性不育(hartung o,forbes m m,marlow fl.zebrafish vasa is required for germ-cell differentiation and maintenance[j].mol reprod dev,2014,81(10):946-61)；在人类中，患少精症的群体，vasa基因表达量只有正常人的1/5。该基因在海水模式生物黑点青鳉(oryziasmelastigma)中研究仍较少。

4、目前通过转基因技术构建优良品种的鱼类已经越来越广泛，如快速生长的三文鱼、泥鳅，无肌间刺武昌鱼，具有荧光的观赏鱼等，随着生物科技的发展，转基因荧光观赏鱼因其独特的荧光特性受到市场的青睐。然而，随着这些转基因鱼在水族贸易中的普及，也带来了基因漂移的问题。基因漂移是指转基因生物与野生种交配，导致转基因特征传入野生种群，从而对生态系统造成不可预见的影响。如何有效避免在养殖过程中转基因鱼发生逃逸后可能带来的基因污染已经引起人们的广泛关注。

5、黑点青鳉具有繁殖速度快、生长周期短及体外受精等优点，十分适合开展基因编辑，建立黑点青鳉vasa基因敲除模型，对解决海水转基因鱼类的逃逸难题以及转基因鱼类的产权保护问题都可以提供一定的借鉴意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术中存在的转基因荧光黑点青鳉基因漂移，导致转基因特征传入野生种群的问题，提供一种防止转基因荧光观赏鱼基因漂移的方法。通过敲除vasa基因来阻止转基因荧光鱼与野生种交配而发生的基因漂移，避免基因漂移带来的危害，解决转基因海水鱼类的逃逸难题。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

3、一种防止转基因荧光观赏鱼基因漂移的方法，通过设计一个特异性的敲除靶点，利用crispr/cas9技术敲除转基因荧光鱼类的vasa基因，将f0代与野生型配对产生可育的f1代杂合子，之后f1代杂合子配对产生f2代纯合子；f2代纯合子个体不育，实现防止转基因荧光鱼类的基因漂移。

4、所述利用crispr/cas9技术敲除转基因荧光鱼类的vasa基因，包括如下步骤：

5、(1)在ensembl数据库查找转基因荧光鱼的vasa基因序列；

6、(2)设计敲除靶点，在vasa基因atg之后的外显子序列上设计靶点，将靶点序列连接至pt7-grna载体中，并进行测序验证；

7、(3)确定vasa基因的敲除靶点后，通过体外转录合成sgrna，之后将sgrna、cas9蛋白以及酚红的混合物通过显微注射的方式注射到转基因荧光鱼的受精卵(1-2细胞期)中；

8、(4)72h后提取注射的转基因荧光鱼卵的基因组dna，通过pcr结合限制性内切酶酶切的方式筛选突变体，并进行测序验证；

9、(5)将f0代培养至性成熟，与野生型进行配对，筛选出f1代杂合子，将突变类型相同的杂合子配对产生f2代纯合子，发现纯合子个体全部表现为雄性；

10、(6)通过组织学以及统计f2代纯合子与野生型配对所得卵的受精率进一步确认f2代纯合子个体不育。

11、本发明还提供一个黑点青鳉vasa基因敲除的特异性靶点，位于黑点青鳉vasa的基因序列的第十七个外显子上，该靶点的碱基序列如序列表seq id no.1所示。

12、所述黑点青鳉vasa基因敲除的特异性靶点用于crispr/cas9技术敲除黑点青鳉的vasa基因，以防止转基因荧光黑点青鳉基因漂移。

13、与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点和技术效果：

14、本发明公开一种防止转基因荧光观赏鱼基因漂移的方法，通过设计特异性敲除靶点，利用crispr/cas9技术对鱼类生殖发育的关键基因vasa进行敲除，敲除后将f0代嵌合体与野生型鱼进行配对产生可育的f1代杂合子，之后将f1代杂合子自交即可得到f2代纯合子，纯合子表型为全部雄性且不育。通过本方法，可以构建vasa基因敲除的转基因荧光鱼家系，且获得不育的雄性个体，有效阻止转基因荧光鱼与野生种的交配带来的基因漂移；该方法对于防止转基因鱼类荧光基因漂移以及保护品种权具有重大意义。本发明验证海水鱼类vasa基因敲除的可能性，对转基因海水鱼类的逃逸难题以及产权问题提供一定的帮助与借鉴。

1.一种防止转基因荧光观赏鱼基因漂移的方法，其特征在于通过设计一个特异性的敲除靶点，利用crispr/cas9技术敲除转基因荧光鱼类的vasa基因，将f0代与野生型配对产生可育的f1代杂合子，之后f1代杂合子配对产生f2代纯合子；f2代纯合子个体不育，实现防止转基因荧光鱼类的基因漂移。

2.如权利要求1所述一种防止转基因荧光观赏鱼基因漂移的方法，其特征在于所述利用crispr/cas9技术敲除转基因荧光鱼类的vasa基因，包括如下步骤：

3.如权利要求1所述一种防止转基因荧光观赏鱼基因漂移的方法，其特征在于设计一个黑点青鳉vasa基因敲除的特异性靶点，位于黑点青鳉vasa的基因序列的第十七个外显子上，该靶点的碱基序列如序列表seq id no.1所示。

4.如权利要求3所述黑点青鳉vasa基因敲除的特异性靶点用于crispr/cas9技术敲除黑点青鳉的vasa基因，以防止转基因荧光黑点青鳉基因漂移。