一种检测幽门螺杆菌耐药突变位点的试剂盒和方法与流程

1.一种检测幽门螺杆菌耐药突变位点的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：

喹诺酮类抗生素耐药位点突变引物探针与阻滞序列；和/或

克拉霉素类抗生素耐药位点突变引物探针与阻滞序列；和/或

与上述引物探针相匹配的PCR试剂组。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述被检测的喹诺酮类抗生素耐药位点突变包括：幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变A259T、幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变T261G、幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变G271A、幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变G271T、与幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变A272G中一种或几种。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变A259T的引物探针序列为：

259-F：5’ACCACCCCCATGGCGATT3’

259-R：5’CGCCATCAATAGAGCCAAAGTG3’

259-P：5’GAGAATGGCGCAAGATTTTTCCATGCG3’；

与所述幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变A259T引物探针序列对应的阻滞序列为：

259-blocker：5’GGTAAATACCACCCCCATGGCGATA3’-NH₂C₆；

所述幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变T261G的引物探针序列为：

261-F：5’ACCACCCCCATGGCGATTAG3’

261-R：5’CGCCATCAATAGAGCCAAAGTG3’

261-P：5’GAGAATGGCGCAAGATTTTTCCATGCG’；

与所述幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变T261G引物探针序列对应的阻滞序列为：

261-blocker：5’GGTAAATACCACCCCCATGGCGATAAT3’-NH₂C₆；

所述幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变G271A的引物探针序列为：

271A-F：5’CCATGGCGATAATGCGGTTTTTA3’

271A-R：5’CGCCATCAATAGAGCCAAAGTG3’

271A-P：5’GAGAATGGCGCAAGATTTTTCCATGCG3’

与所述幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变G271A引物探针序列对应阻滞序列为：271A-blocker：

5’ACCCCCATGGCGATAATGCGGTTTATG3’-NH₂C₆；

所述幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变G271T的引物探针序列为：

271T-F：5’CCATGGCGATAATGCGGTTTTTA3’

271T-R：5’CCATGGCGATAATGCGGTTTTTT 3’

271T-P：5’GAGAATGGCGCAAGATTTTTCCATGCG3’

与所述幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变G271T引物探针序列对应的阻滞序列为：

271T-blocker：5’ACCCCCATGGCGATAATGCGGTTTATG3’-NH₂C₆；

所述幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变A272G的引物探针序列为：

272-F：5’CATGGCGATAATGCGGTTTAAGG 3’

272-R：5’CCATGGCGATAATGCGGTTTTTT 3’

272-P：5’GAGAATGGCGCAAGATTTTTCCATGCG3’

与所述幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变A272G引物探针序列对应的阻滞序列为：

272-blocker：5’ACCCCCATGGCGATAATGCGGTTTATGA3’-NH₂C₆；

优选地，所述幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变A259T的引物探针序列259-P、所述幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变T261G的引物探针序列261-P、所述幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变G271A的引物探针序列271A-P、所述幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变G271T的引物探针序列271T-P、所述幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变A272G的引物探针272-P的5’端被HEX集团修饰，所述幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变A259T的引物探针序列259-P、所述幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变T261G的引物探针序列261-P、所述幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变G271A的引物探针序列271A-P、所述幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变G271T的引物探针序列271T-P、所述幽门螺杆菌gyrA基因喹诺酮耐药位点突变A272G的引物探针272-P的3’端被BHQ1集团修饰。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测的克拉霉素类抗生素耐药位点突变包括：幽门螺杆菌23SrRNA基因克拉霉素耐药位点突变A2142C、幽门螺杆菌23SrRNA基因克拉霉素耐药位点突变A2142G、幽门螺杆菌23SrRNA基因克拉霉素耐药位点突变A2143G的一种或几种。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述幽门螺杆菌23SrRNA基因克拉霉素耐药位点突变A2142C的引物探针序列为:

2142C-F：5’TCCTACCCGCGGCAAGACTGC 3’

2142C-R：5’CCATAAGAGCCAAAGCCCTTACTTCA3’

2142C-P：5’TGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAG3’

与所述幽门螺杆菌23SrRNA基因克拉霉素耐药位点突变A2142C的引物探针序列的阻滞序列为：

2142C-blocker：5’TCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGA3’-NH₂C₆；

所述幽门螺杆菌23SrRNA基因克拉霉素耐药位点突变A2142G的引物探针序列:

2142G-F：5’CTACCCGCGGCAAGACTGG 3’

2142G-R：5’CCATAAGAGCCAAAGCCCTTACTTCA3’

2142G-P：5’TGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAG3’

与所述幽门螺杆菌23SrRNA基因克拉霉素耐药位点突变A2142G的引物探针序列对应的阻滞序列为：

2142G-blocker：5’TCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGA 3’-NH₂C₆；

所述幽门螺杆菌23SrRNA基因克拉霉素耐药位点突变A2143G的引物探针序列为:

2143-F：5’TACCCGCGGCAAGACGTAG 3’

2143-R：5’CCATAAGAGCCAAAGCCCTTACTTCA3’

2143-P：5’TGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAG 3’

与所述幽门螺杆菌23SrRNA基因克拉霉素耐药位点突变A2143G的引物探针序列对应的阻滞序列为：

2143-blocker：5’TCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAA3’-NH₂C₆；

优选地，所述幽门螺杆菌23SrRNA基因克拉霉素耐药位点突变A2142C的引物探针序列2142C–P、所述幽门螺杆菌23SrRNA基因克拉霉素耐药位点突变A2142G的引物探针序列2142G–P、所述幽门螺杆菌23SrRNA基因克拉霉素耐药位点突变A2143G的引物探针序列2143–P的5’端被FAM集团修饰，所述幽门螺杆菌23SrRNA基因克拉霉素耐药位点突变A2142C的引物探针序列2142C–P、所述幽门螺杆菌23SrRNA基因克拉霉素耐药位点突变A2142G的引物探针序列2142G–P、所述幽门螺杆菌23SrRNA基因克拉霉素耐药位点突变A2143G的引物探针序列2143–P的3’端被BHQ1集团修饰。

6.根据权利要求1～5任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂组包括dNTP、DNA聚合酶、PCR缓冲液。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂组包括：按反应体系为25μL计，所述引物探针与阻滞序列的浓度为0.1μM～0.5μM；优选地，所述探针浓度为0.1μM～0.5μM；所述DNA聚合酶0.06μM～0.3μM；所述PCR缓冲液包括：Tris浓度为1.0mM～2.0mM；KCl浓度为1.0mM～2.0mM；Mg²⁺浓度为0.6μM～3.0μM；所述dNTP浓度为2.0-2.5μM。

8.一种检测幽门螺杆菌耐药突变位点的方法，包括以下步骤：

1)提取被试样品中的幽门螺杆菌的DNA；

2)利用权利要求1～7任意一项所述的试剂盒，对步骤1)获得的被试样品幽门螺杆菌DNA进行荧光PCR；

3)通过荧光PCR的结果判断是否发生耐药性突变。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述荧光PCR的条件为95℃2min进行变性反应；95℃10s，55℃40s，40个循环，在55℃40s阶段收集荧光信号。

10.如权利要求1～7任意一项所述的试剂盒在检测幽门螺杆菌对喹诺酮类抗生素和/或克拉霉素类抗生素中的应用。