重组真核表达质粒复合物在制备马腺疫链球菌疫苗的应用
[0080]实施例六:重组真核表达质粒PVAXl-S和PVAXl-E的表达与鉴定结合上述实施例三、实施例四和实施例五。
[0081]将提取扩增的重组真核表达质粒PVAXl-S和PVAXl-E采用VigoFect转染试剂进行转染，参照高效真核转染试剂(威格拉斯)说明书进行。
[0082]转染前ld，六孔培养板接种2 X 15?4 X 15个293T细胞，至转染时细胞密度达到60%。转染前lh，更换新鲜的完全培养液，置37 °C, 5% C02培养。取5 μ g DNA,加入稀释液中至总体积为100 μ 1，轻轻混匀，室温放置。取VigoFect 2 μ 1，加入稀释液中至总体积为100 μ 1，轻轻混匀，室温放置5min。将稀释的VigoFect逐滴加入稀释的DNA溶液中，轻轻混匀，所得的转染工作液在室温放置15 min。将转染工作液轻轻混匀，逐滴加入2mL培养液中，轻轻混匀培养液，置37 °C，5% CO2培养。转染后24?48 h，观察并收取细胞。
[0083]采用WesternBlot检测重组质粒是否表达及其抗原性检测。总蛋白抽提试剂对收取细胞进行抽提，作用数分钟，吹打数次后，冰浴2 h即完成。抽提的蛋白加入5XLoadingBuffer,95 °C，10 min，即完成样品制备。
[0084]取制备好的样品，加入上样缓冲液，100°C加热3?5分钟，用质量百分浓度为12%的分离胶、质量百分浓度为5%的积层胶进行SDS-PAGE，电泳完毕后，将分离产物电转移至NC膜上，用质量百分浓度为5%的脱脂牛奶封膜，加入的一抗分别为1: 1000稀释家兔抗S蛋白多克隆抗血清和抗E蛋白多克隆抗血清，温度37°C孵育I小时，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，温度37°C孵育I小时，洗膜，显色。PVAXl-S的Western-blot结果见图2，其中I泳道为PVAX1-S，2泳道为阴性对照，可见I泳道有一明显蛋白条带，而2泳道未见条带。表明转染后的pVAXl-S能够在293T细胞进行正确表达。PVAXl-E的Western-blot结果见图4，其中I泳道为PVAX1_E，2泳道为阴性对照，可见I泳道有一明显蛋白条带，而2泳道未见条带。表明转染后的pVAXl-E能够在293T细胞进行正确表达。
[0085]实施例七:重组真核表达质粒PVAXl-S和PVAXl-E复合物的制备结合上述实施例三至实施例六。
[0086]在浓度为0.01mol/L、pH 为 7.2 ?7.4 的 PBS (由浓度为 137mmol/L 的 NaCl、浓度为 2.7mmol/L 的 KC1、浓度为 4.3mmol/L 的 Na2HPO4 和浓度为 1.4mmol/L 的 KH2PO4 组成)中，按质量比为1:1加入纯化的PVAXl-S和PVAX1-E，使PVAXl-S和PVAXl-E在PBS中的浓度均为0.5mg/mL，混合均匀，室温下孵育30分钟，即得PVAXl-S和PVAXl-E复合物。
[0087]实施例八:重组真核表达质粒PVAXl-S和PVAXl-E复合物对小鼠的免疫保护效力试验
以下试验是基于结合上述实施例一至实施例七展开如下实验。
[0088]菌株和质粒:马腺疫链球菌菌株(Streptococcus,equi subsp equi ) XZl CGMCCN0.7830，该菌种为本申请人已于2013年分离获得，并于2013年6月28日由“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC N0.7830。
[0089]实验动物分组:60只昆明白小鼠平均分为5组，每组12只，分别编号为A组重组质粒pVAXl-S免疫组、B组重组质粒pVAXl-E免疫组、C组pVAXl-S+pVAXl_E对照组、D组PVAXI质粒对照组和E组PBS对照组。
[0090]免疫用重组真核表达质粒复合物免疫原的制备及免疫:将质粒、壳聚糖按照1:0.5比例混合，制备成注射浓度为0.5 mg/mL的重组质粒复合物疫苗，采用后肢腿部肌肉注射方法免疫，注射剂量50 μ g/只。采用2次免疫，免疫间隔时间为21d，初次免疫后O d、14 d、35 d各断尾采血I次，分离血清-20 °0保存用于检测。
[0091]实验动物免疫后体液免疫和细胞免疫的检测:免疫前及每次免疫后2周后对免疫小鼠进行断尾采血，分离血清。用间接ELISA方法检测免疫前及各免后血清中抗体滴度。将FnBPA纯化蛋白用PH=9.6的碳酸钠缓冲液4°C进行过夜包被。对鼠血清进行不同浓度稀释:初始100倍稀释，随后倍比稀释。将不同稀释度的血清做一抗37°C温育2h。将羊抗鼠HRP标记的二抗1:4000稀释，37°C温育Ih后，洗涤、显色、终止，0D450nm读数。
[0092]不同时间的血清经100倍稀释后做一抗分别作ELISA检测，0D450nm读数，以空载体和PBS注射组做对照。结果参见附图5。研宄的结果表明I免后(P〈0.01)及2免后(P〈0.001)的卡个体检测结果显示PVAX1-S+PVAX1-E组合免疫组比PVAX1-S，PVAXl-E单独免疫组及PBS对照组、空载体对照组诱导的抗体水平高，且与对照组相比差异极显著。
[0093]用等量所构建的不同重组质粒免疫小鼠2次，二免90天后，对脾脏T淋巴细胞的MTT实验检测所得的刺激指数(stimulat1n index，SI)。结果参见附图6所示，MTT实验的结果显示PVAX1-S+PVAX1-E组合免疫组比空载体组和空白对照组更能刺激机体的细胞免疫水平。统计分析表明PVAX1-S+PVAX1-E与空载体组和空白对照组差异显著。
[0094]免疫后对小鼠的攻毒保护性试验:60只昆明白小鼠，体重20g，平均分为5组，每组12只。以重组质粒单独和组合后的抗原免疫实验小鼠，皮下注射PVAX-1空载体，PBS分别作对照，首次免疫将抗原50ug经皮下注射接种。各组均在首免后3周后进行第2 次免疫，2 免后 45d 用马腺疫链球菌菌株(Streptococcus, equi subsp equi )XZ1 CGMCCN0.7830通过腹腔注射进行攻毒，每只鼠腹腔接种最小致死菌量(IMLD)为5 X 17CFU,观察一周。记录每组试验鼠的发表，死亡情况，计算免疫保护效率。空白组12只小鼠36h全部死亡，PVAXl空载体组保护率为16.67%，PVAXl-S和PVAXl-E免疫组的保护率分别为66.67%，66.67%，PVAX1-S+PVAX1-E组合免疫组的保护率为83.33%。
【主权项】
1.一种重组真核表达质粒的复合物，其特征在于，重组真核表达质粒的复合物由马腺疫链球菌M蛋白的重组真核质粒与E蛋白的重组真核表达质粒以1:1质量比混合而成，所述的马链球菌S蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，所述的马链球菌E蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
2.—种如权利要求1所述的马腺疫重组真核表达质粒复合物的制备方法，其特征在于，重组真核表达质粒复合物的具体制备方法步骤如下: (1)分别扩增S蛋白的基因及E蛋白的基因，将两个基因均用I和通οI内切酶酶切并纯化； (2)再将酶切纯化后的基因片段分别连接到经ifeMlI和通Ol内切酶酶切后的真核表达载体PVAXl中； (3)通过上述步骤将PCR扩增得到的S基因片段分别用XhoI, BanEl酶切后连入经Xhol、BaniA I真核表达载体PVAX-1，用T4DNA连接酶进行16°C过夜连接，连接产物转化至E.coimm α感受态细胞中； (4)提取质粒酶切鉴定阳性克隆，获得重组真核表达质粒PVAXl-S； (5)将PCR扩增得到的E基因片段分别用Xho1、BanR I酶切后连入经Xho 1、BanR I酶切后的真核表达载体PVAX-1，用T4DNA连接酶进行16°C过夜连接，连接产物转化至E.coli DH5a感受态细胞中，提取质粒酶切并测序鉴定阳性克隆，获得重组真核表达质粒PVAXl-E ； (6)S蛋白和E蛋白重组真核表达质粒复合物由PVAXl-S和PVAXl-E以质量比1:1混合而成。
3.—种如权利要求2所述的马腺疫重组真核表达质粒复合物的制备方法，其特征在于，所述的S蛋白和E蛋白重组真核质粒复合物的制备方法为:在浓度为0.01mol/L、pH为7.2?7.4的PBS溶液中分别加入提取好的S蛋白和E蛋白重组真核表达质粒，按1:1质量比混合均匀后，即得S蛋白和E蛋白重组真核质粒的复合物。
4.如权利要求1、2或3任意所述的一种重组真核表达质粒复合物，其特征在于，所述的真核表达载体PVAX-1的序列如SEQ ID N0.7所示。
5.如权利要求1、2或3任意所述的一种重组真核表达质粒复合物，其特征在于，所述的重组真核表达质粒PVAXl-S的序列如SEQ ID N0.8所示。
6.如权利要求1、2或3任意所述的一种重组真核表达质粒复合物，其特征在于，所述的重组真核表达质粒PVAXl-E的序列如SEQ ID N0.9所示。
7.权利要求1、2或3任意所述的一种重组真核表达质粒复合物在制备马腺疫链球菌病药物的应用。
【专利摘要】本发明公开了重组真核表达质粒复合物在制备马腺疫链球菌疫苗的应用，通过将马腺疫链球菌来源的S蛋白和E蛋白的重组真核质粒PVAX1-S和PVAX1-E以1：1的质量比组合而成重组真核表达质粒复合物，通过在免疫动物试验得知其具有良好的免疫原性，且该重组质粒复合物免疫后的抗体水平、细胞免疫水平和免疫保护效果优于单一抗原单独免疫。通过选择了本地区流行菌株的S蛋白和E蛋白的重组真核表达质粒复合物用于免疫，克服了单一抗原产生的免疫保护效果差的缺点，具有良好的开发应用前景。
【IPC分类】A61P31-04, C12N15-79, A61K39-00, C12N15-66
【公开号】CN104789587
【申请号】CN201510165356
【发明人】苏艳, 苏玲玲, 张宝江, 邵俊高
【申请人】新疆农业大学, 苏艳
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月10日
文档序号 :
【 8468636 】
技术研发人员：苏艳,苏玲玲,张宝江,邵俊高
技术所有人：新疆农业大学,苏艳
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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