重组真核表达质粒复合物在制备马腺疫链球菌疫苗的应用
[0030]图6显示为实验动物免疫后细胞免疫的检测图。图中通过SI刺激指数体现。
【具体实施方式】
[0031]下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，％皆指m/m质量百分比，份比按照重量份比核计。
[0032]本发明中涉及的设备和材料:
DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、限制性内切酶 BamH 1、Xho I，La-Taq DNA聚合酶，T4链接酶购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自OMEGA公司；BluePlus II Protein Marker购自北京全式金生物技术公司；卡那霉素(Kan)、DAB显色液、胰蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清、DMEM培养基、细胞培养板购于ThermoFisher公司；转染试剂VigoFect购于威格拉斯生物技术(北京)有限公司；细胞总蛋白抽提试剂购于武汉博士德生物工程有限公司；脑心浸液培养基(BHI)购于杭州天和微生物微生物试剂有限公司；胰蛋白胨、酵母浸粉、琼脂粉购于北京奥博星生物技术有限公司。三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸钠(SDS)、甘氨酸、二甲基亚砜(DMSO)购于Amersco公司；硝酸纤维素膜(NC膜)购于Milipo公司。
[0033]LDZX自动电热压力蒸汽灭菌器:上海申安医疗器械厂；PL303电子天平:梅特勒-托利多仪器有限公司；DHG_9140A电热恒温鼓风干燥箱:上海一恒科技有限公司；DK-600A电热恒温水箱:上海一恒科技有限公司；LT-1005台式低温恒温槽:杭州汇尔仪器设备有限公司；THZ-D台式恒温震荡器；江苏太仓实验设备厂；DG-70D电热恒温培养箱:宁波莱福科技有限公司；SW-CJ-1F超净工作台:苏州安泰空气技术有限公司；TgradientIPCR扩增仪:Bi0metre公司JS-780凝胶成像系统:培清科技；DYY_6C电泳仪:北京市六一仪器厂；5415R高速冷冻离心机:eppendorf ;B1Photometer核酸蛋白测定仪:eppendorf 公司，Trans-Blot Cell:B1_Rad 公司。
实验动物:5-7周龄雌性SPF级昆明白小鼠(18-20 g)，购自新疆医科大学实验动物中心。
[0034]本发明中选用的所有试剂、仪器、原辅材料都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
[0035]实施例一:重组真核表达质粒复合物的制备重组真核表达质粒复合物是由S蛋白和E蛋白的重组真核表达质粒PVAXl-S和PVAXl-E以1:1的质量比组合而成，该重组真核表达组合质粒的具体制备方法步骤如下:Cl)分别扩增S及E蛋白基因，将两个基因均用BernHl和Xho I内切酶酶切并纯化。
[0036](2)再将酶切纯化后的基因片段分别连接到经和Xho I内切酶酶切后的真核表达载体中。
[0037](3)通过上述步骤将PCR扩增得到的SeM基因片段分别用Xho 1、BamHl酶切后连入经沿ο 1、及丽7/真核表达载体PVAX-1，用T4DNA连接酶进行16 °C过夜连接，连接产物转化至万.DH5a感受态细胞中。提取质粒酶切鉴定阳性克隆，构建获得重组真核表达质粒PVAX1-S。
[0038](4)同理，通过上述步骤将PCR扩增得到的E蛋白基因片段分别用Xho 1、BamHl酶切后连入经通ol、及丽71真核表达载体PVAX-1，用T4DNA连接酶进行16°C过夜连接，连接产物转化至万.co7i DH5a感受态细胞中，提取质粒酶切鉴定阳性克隆，构建获得重组真核表达质粒PVAX1-E。
[0039](5)通过上述步骤(3)和(4)分别将获得重组质粒转化至工程菌中并对该重组质粒提取并纯化，利用获得重组真核表达质粒S蛋白和E蛋白以质量比1:1混合而成重组真核质粒复合物。
[0040]实施例二:重组真核表达质粒复合物的制备
本发明详实提供了上述重组真核表达质粒复合物的具体制备方法步骤如下:
(I)分别扩增S蛋白基因及E蛋白基因，将两个基因均用BamH和通ο I内切酶酶切并纯化，扩增的S蛋白基因及E蛋白基因分别参见附后的基因序列表中的SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2。
[0041](2)再将酶切纯化后的基因片段分别连接到经和Xho I内切酶酶切后的真核表达载体中PVAX-1，该载体具有SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。
[0042](3)通过上述步骤将PCR扩增得到的S基因片段分别用Xho 1、BamH I酶切后连入经、及丽71真核表达载体PVAX-1，用T4DNA连接酶进行16°C过夜连接，连接产物转化I E.coli DH5a感受态细胞中。提取质粒酶切鉴定阳性克隆，构建获得重组真核表达质粒PVAX1-S,该重组质粒具有SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列。
[0043](4)将PCR扩增得到的E蛋白基因片段分别用沿ο 1、BamHl酶切后连入经ZAoI真核表达载体PVAX-1，用T4DNA连接酶进行16°C过夜连接，连接产物转化至E.coli DH5a感受态细胞中，提取质粒酶切鉴定阳性克隆，构建获得重组真核表达质粒PVAX1-E，该重组质粒具有SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列。
[0044](5) S蛋白和E蛋白重组真核质粒复合物由PVAXl-S和PVAXl-E以质量比1:1混合而成。
[0045](6)所述的S蛋白和E蛋白重组真核质粒复合物的制备方法为:在浓度为0.01mol/L、pH为7.2?7.4的PBS溶液中分别加入提取好的S蛋白和E蛋白重组真核表达质粒，按1:1质量比混合均匀后，即得S蛋白和E蛋白重组真核质粒的复合物，使PVAXl-S和PVAXl-E的终浓度为0.5mg/mL。
[0046]实施例三:重组真核表达质粒PVAXl-S的构建获取马腺疫链球菌S蛋白抗原表位编码的基因马腺疫链球菌本地流行菌株{Streptococcus, equi subsp equi)XZl CGMCC N0.7830,该菌种为本申请人已于2013年分离获得，并于2013年6月28日由“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC N0.7830。挑取绵羊血琼脂平板上XZl株单菌落接种至含5%犊牛血清(购自杭州四季青)的Todd-Hewitt broth (THB)肉汤中，37°C静置培养过夜，取0.5mL菌液离心，提取染色体DNA，溶于PH8.0 TE缓冲液中，冻存备用。
[0047]提取马腺疫链球菌XZl株基因组DNA的步骤如下:分别挑取绵羊血平板上XZl菌落接种到Todd-Hewit肉汤，37°C静止培养过夜；取0.5mL菌液离心沉淀，TE缓冲液(10mMol/LTris-Hcl，ImMol/L EDTA，ρΗ7.4)洗涤菌体；以冷丙酮悬浮菌体6000g离心5min，并干燥；37°C用溶菌酶(2mg/mL)200uL处理菌体lh，加TESN裂解液(1mMol/LTris-Hcl, ImMol/L EDTA, I % Sarkosyl，6mol/LNaI，ρΗ7.4)裂解；加等体积异丙醇沉淀DNA, 1000g离心1min ;沉淀悬浮于200uL 40%异丙醇中，离心洗涤；70%乙醇洗涤沉淀；干燥的沉淀溶于 10uL TE 缓冲液(1mMoI/LTris-HcI, ImMol/L EDTA, pH8.0)，4°C备用。
[0048]采用聚合酶链反应(PCR)方法自马腺疫链球菌XZl株染色体DNA中分离S蛋白基因。引物Pl与P2两端分别添加BanR I和Xho I酶切位点，采用的引物序列分别是:
S 基因的上游引物 Pl:5' G GAT CCC GGC CCC GCC ACA ATG GGC AAG TGG GTA ACCTTT GTT TCC CTT CTC 3' (SEQ ID NO:1)
S 基因的下游引物 P2:5' CTCGAG TCAGAACATTCTGCCCAG 3' (SEQ ID NO:2)。
[0049]所述PCR操作程序是:在一 200 μ L微量离心管中加入下列试剂:
模板DNA 2 μ L
1x PCR buffer 10 μ L 25mM MgCl 28 yL
2.5mM dNTPs8 μ L
引物各0.5yL
ddH2018 μ L
Taq 酶3yL
混匀后，立即进行PCR反应。PCR循环参数:94°C变性4min后，进入循环，94°C 30s，55°C 30s, 72°C 45s，共 30 个循环，最后 72°C延伸 lOmin。
[0050]目的片断的回收和纯化:PCR产物经1%琼脂糖电泳后，切下目的条带，用DNA快速纯化试剂盒提取凝胶中目的片段，具体步骤按试剂盒说明书进行操作。即:琼脂糖电泳后割下含DNA的琼脂糖块，使体积尽可能小，放入1.5mL eppendorf管中；按每10mg琼脂糖块加入300 μ L结合缓冲液的比例加入结合缓冲液，将印pendorf管涡旋振荡15?30s，置50°C水浴lOmin，使琼脂块完全溶化，每2?3min涡旋振荡一次；按每10mg琼脂糖块加入150yL异戊醇的比例加入异戊醇，涡旋振荡彻底混匀；将溶化后的溶液移入吸附柱中，12000g、15?25°C离心lmin，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中；在吸附柱中加入500 μ L洗脱缓冲液，2000g、15?25°C离心lmin，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；在吸附柱中再次加入200 yL洗脱缓冲液，静置Imin后，12000g、15?25°C离心lmin，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；12000rpm、15?25°C离心lmin，彻底除去吸附柱中的洗脱液；将吸附柱放入一只干净的1.5mL印pendorf管中，在吸附膜中央加入50?10yL溶解缓冲液，静置Imin后，12000g、15?25°C离心lmin，回收产物即为纯化的目的片段，回收产物_20°C冻存备用。
[0051]S基因的酶切与回收:将回收的S基因片段用BamH I ,Xho I进行酶切，37°C过夜酶切，酶切后产物经凝胶纯化试剂盒回收后，-20°C保存备用。
[0052]在0.5mL的eppendorf管依次加入:
S基因片段8yL
1X buffer I 2 μ L
BamHIIyL
Xho IIyL
ddH208 μ L
混匀，37°C水浴酶切2h，65°C 15min终止反应。
[0053]按Roche DNA快速回收试剂盒说明书回收酶切产物。
[0054]PVAXl载体片段的酶切与回收:挑取含有pVAXl质粒的单菌落，于LB(50
文档序号 :
【 8468636 】
技术研发人员：苏艳,苏玲玲,张宝江,邵俊高
技术所有人：新疆农业大学,苏艳
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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