重组真核表达质粒复合物在制备马腺疫链球菌疫苗的应用
[0055]将提取的pVAXl质粒以BamH I ,Xho I进行酶切，37°C过夜酶切，回收片段。
[0056]在0.5mL的eppendorf管依次加入:
PVAXl载体片段 18 μ L
1X buffer I2 μ L
BamHIIyL
Xho IIyL
ddH208 μ L
混匀，37°C水浴酶切2h，65°C 15min终止反应。按Roche DNA快速回收试剂盒说明书回收酶切产物。
[0057]PVAXl载体与外源DNA片段的连接反应
将酶切后的S基因与酶切后的载体pVAXl，在T4 DNA连接酶作用下16 °C过夜连接。
[0058]0.5mL eppendorff 管中依次加入:
载体 DNA0.5 μ L
S基因酶切回收产物 4yL 1X 连接 buffer2 μ L
T4DNA连接酶I μ L
dd H2012.5 yL
16 °C连接过夜。
[0059]感受态细胞的制备和转化:从新鲜LB平板挑取单菌落的DH5a接种1mLLB肉汤，37°C剧烈摇振培养3?4h后，冰上放置1min ;4°C、6000rpm离心4min，以冰预冷的0.1mol/mL CaC12 悬浮沉淀，置冰浴 1min ;4°C、6000rpm 离心 4min，加 400 μ L 冰预冷的0.1mol/mL CaCl2重新悬浮沉淀，4°C放置待用；取20(^1^感受态细胞至印pendorf管中，加入1yL的连接产物，立即混匀，冰上放置30min ;42°C热休克90s，迅速转移至冰浴21^11，然后加入800 4 1^ 37°C预热的LB培养基，37°C缓慢摇振2h ;取10yL培养液涂布LB 平板(含 Amp 100yg/mL)37°C 培养 14 ?16h。
[0060]将含S基因的的重组质粒转化大肠杆菌Dh5 α，感受态购自天为公司，用限制性内切酶酶切的方法及重组质粒测序的方法鉴定重组克隆。酶切结果参见附图1，泳道3中构建的重组质粒PVAXl-SgBamH I与Xho I双酶切后，可以获得与目的片段大小一致的基因片段。而泳道2中的对照则没有该片段。
[0061]重组质粒冰冻保存于-20°C，重组菌在含20?50%甘油培养液中保存于_20°C或_70°C。融合基因的序列测定采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行测序。测序结果表明，所得到的基因序列与设计的完全一致。以上参见附图2可知。
[0062]实施例四:重组真核表达质粒PVAXl-E的构建
马腺疫链球菌本地流行菌株{Streptococcus, equi subsp equi)XZl CGMCC N0.7830,该菌种为本申请人已于2013年分离获得，并于2013年6月28日由“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC N0.7830。挑取绵羊血琼脂平板上XZl株单菌落接种至含5%犊牛血清(购自杭州四季青)的Todd-Hewitt broth (THB)肉汤中，37°C静置培养过夜，取0.5mL菌液离心，提取染色体DNA，溶于PH8.0 TE缓冲液中，冻存备用。
[0063]提取马腺疫链球菌XZl株基因组DNA的步骤如下:分别挑取绵羊血平板上XZl菌落接种到Todd-Hewit肉汤，37°C静止培养过夜；取0.5mL菌液离心沉淀，TE缓冲液(10mMol/LTris-Hcl，ImMol/L EDTA，ρΗ7.4)洗涤菌体；以冷丙酮悬浮菌体6000g离心5min，并干燥；37°C用溶菌酶(2mg/mL)200uL处理菌体lh，加TESN裂解液(1mMol/LTris-Hcl, ImMol/L EDTA, I % Sarkosyl，6mol/LNaI，ρΗ7.4)裂解；加等体积异丙醇沉淀DNA, 1000g离心1min ;沉淀悬浮于200uL 40%异丙醇中，离心洗涤；70%乙醇洗涤沉淀；干燥的沉淀溶于 10uL TE 缓冲液(1mMoI/LTris-HcI, ImMol/L EDTA, pH8.0)，4°C备用。
[0064]采用聚合酶链反应(PCR)方法自马腺疫链球菌XZl株染色体DNA中分离E蛋白基因。引物Pl与P2两端分别添加BamH I和ZAo I酶切位点和保护性碱基，采用的引物序列分别是:
E 基因的上游引物 Pl:5' G GAT CCC GGC CCC GCC ACA ATG GGC AAG TGG GTA ACCTTT GTT TCC CTT CTC3' (SEQ ID NO:3)
E基因的下游引物P2:5' CTCGAG TCAGAACAGGCTGCCCAGGGG CTT 3' (SEQ ID NO:4)。
[0065]所述PCR操作程序是:在一 200 μ L微量离心管中加入下列试剂:
模板DNA 2 μ L
1x PCR buffer 10 μ L 25mM MgCl 28 yL
2.5mM dNTPs8 μ L
引物各0.5yL
ddH2018 μ L
Taq 酶3yL
混匀后，立即进行PCR反应。PCR循环参数:94°C变性4min后，进入循环，94°C 30s，53°C 35s，72°C 45s，共 30 个循环，最后 72°C延伸 lOmin。
[0066]目的片断的回收和纯化:PCR产物经1%琼脂糖电泳后，切下目的条带，用DNA快速纯化试剂盒提取凝胶中目的片段，具体步骤按试剂盒说明书进行操作。即:琼脂糖电泳后割下含DNA的琼脂糖块，使体积尽可能小，放入1.5mL eppendorf管中；按每10mg琼脂糖加入300 μ L结合缓冲液的比例加入结合缓冲液，将印pendorf管涡旋振荡15?30s，置50°C水浴lOmin，使琼脂块完全溶化，每2?3min涡旋振荡一次；按每10mg琼脂糖块加A150uL异戊醇的比例加入异戊醇，涡旋振荡彻底混匀；将溶化后的溶液移入吸附柱中，12000g、15?25°C离心lmin，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中；在吸附柱中加入500 μ L洗脱缓冲液，2000g、15?25°C离心lmin，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；在吸附柱中再次加入200 μ L洗脱缓冲液，静置lmin后，12000g、15?25°C离心lmin，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；12000rpm、15?25°C离心lmin，彻底除去吸附柱中的洗脱液；将吸附柱放入一只干净的1.5mL eppendorf管中，在吸附膜中央加入50?10yL溶解缓冲液，静置Imin后，12000g、15?25°C离心lmin,回收产物即为纯化的目的片段，回收产物-20°C冻存备用。
[0067]S基因的酶切与回收:将回收的E基因片段用BamH I ,Xho I进行酶切，37°C过夜酶切，酶切后产物经凝胶纯化试剂盒回收后(方法同上)，-20°C保存备用。
[0068]在0.5mL的eppendorf管依次加入:
S基因片段8yL
10X buffer I2 μ L
BamHIIyL
Xho IIyL
ddH208 μ L
混匀，37°C水浴酶切2h，65°C 15min终止反应。
[0069]按Roche DNA快速回收试剂盒说明书回收酶切产物。
[0070]PVAXl载体片段的酶切与回收:挑取含有pVAXl质粒的单菌落，于LB(50 μ g/mLkan)培养基中培养，200 rpm、37 °C培养12 h，提取质粒。质粒提取步骤同上。
[0071]将提取的pVAXl质粒以BamH I ,Xho I进行酶切，37°C过夜酶切，回收片段。
[0072]在0.5mL的eppendorf管依次加入:
PVAXl载体片段 18 μ L
10Χ buffer I2 μ L
BamHIIyL
Xho IIyL
ddH208 μ L
混匀，37°C水浴酶切2h，65°C 15min终止反应。按Roche DNA快速回收试剂盒说明书回收酶切产物。
[0073]PVAXl载体与外源DNA片段的连接反应
将酶切后的S基因与酶切后的载体pVAXl，在T4 DNA连接酶作用下16 °C过夜连接。
[0074]0.5mL eppendorf 管中依次加入:
载体 DNA0.5 μ L
S基因酶切回收产物 4yL 1X 连接 buffer2 μ L
T4DNA连接酶I μ L
dd Η2012.5 yL
16 °C连接过夜。
[0075]感受态细胞的制备和转化:从新鲜LB平板挑取单菌落的DH5a接种1mL LB肉汤，37°C剧烈摇振培养3?4h后，冰上放置1min ;4°C、6000rpm离心4min，以冰预冷的0.1mol/mL CaCl2 悬浮沉淀，置冰浴 1min ;4°C、6000rpm 离心 4min，加 400 μ L 冰预冷的0.1mol/mL CaCl2重新悬浮沉淀，4°C放置待用；取200 4]^感受态细胞至eppendorf管中，加入1yL的连接产物，立即混匀，冰上放置30min ;42°C热休克90s，迅速转移至冰浴21^11，然后加入800 4 1^ 37°C预热的LB培养基，37°C缓慢摇振2h ;取10yL培养液涂布LB 平板(含 Amp 100yg/mL)37°C 培养 14 ?16h。
[0076]用限制性内切酶酶切的方法及重组质粒测序的方法鉴定重组克隆。
[0077]重组质粒冰冻保存于-20°C，重组菌在含20?50%甘油培养液中保存于_20°C或_70°C。酶切结果参见附图3，泳道3中构建的重组质粒pVAXl-E经BamH I与Xho I双酶切后，可以获得与目的片段大小一致的基因片段。而泳道2中的对照则没有该片段。I连接的E基因的序列测定采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行测序。测序结果表明，所得到的基因序列与设计的完全一致。以上参见附图4可知。
[0078]实施例五:重组真核表达质粒PVAXl-S和PVAXl-E的提取扩增
结合上述实施例三和实施例四。接种含PVAXl-S和PVAXl-E重组真核表达质粒的宿主菌DH5a至LB肉汤(含50 μ g/mL kan)中，37°C摇振培养12?14h。按QIAGEN质粒提取试剂盒说明书进行。
[0079]取3mL 菌液至 1.5mL eppendorf 管中，4 °C、8000rpm 离心 3min，彻底弃上清；加250 μ Lpl缓冲液至^endorf管中，重新溶
文档序号 :
【 8468636 】
技术研发人员：苏艳,苏玲玲,张宝江,邵俊高
技术所有人：新疆农业大学,苏艳
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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