一种油菜角果数主效qtl的分子标记及应用
[0018] 本研究中所用的亲本材料为中双11号和73290,均由中国农科院油料所生物技术 育种课题组技术人员在王汉中研究员带领下育成。中双11号是由中双9号与高油、长角和 大粒品系2F10和26102经复合杂交、小孢子培养和加倍选育而来73290由93275(中油杂4 号恢复系）作母本和中双2号选株杂交的杂种Fl代进行小孢子培养与套袋自交选育而成 的多角果数品系。
[0019] 一种油菜角果数性状主效QTL位点紧密连锁的分子标记在油菜高产育种中的应 用，其步骤是：
[0020] (1)田间种植中选F2代单株自交所产生的F3种子，在定苗前取样，用CTAB法抽提 叶片总DNA，过程中所用到的试剂（提取液、氯仿、异戊醇、无水乙醇）如上所述；
[0021] (2)利用qPN. A6位点连锁的分子标记CNU400对两亲本（中双11号和73290)的 F3代进行辅助选择，仅保留带型和73290相同的单株，保留植株角果数超过中双11的比例 高达92. 3%。通过鉴定上述角果数主效QTL位点来预测油菜角果数，可提高油菜高产育种 的选择效率，从而加快育种进程。
[0022] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0023] 本发明首次定位到油菜多角果品系73290号中控制角果数的主效QTL位点，可解 释18. 5%的表型方差。在常规育种方法中，角果数性状表型鉴定要等到成熟期考种，费时费 力且选择效率低下（角果数表型受环境影响很大）。通过检测角果数性状主效QTL位点，可 以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率。本发明中角果数主效QTL 点位置明确，检测方法方便快速，不受环境影响。通过检测与角果数性状紧密连锁的分子标 记，即可预测角果数的多少，进而准确快速筛选多角果单株。
【附图说明】
[0024] 图1为一种油菜品种中双11和多角果品系73290构建的F2和F2:3群体在武汉种 植时2009-2011年主序角果数的频率分布图。
[0025] 结果表明角果数表型呈正态分布，且变异范围很宽，证明角果数属于数量性状。
[0026] 图2为一种油菜中双11 X 73290_F2群体A6连锁群分子标记遗传连锁图谱。
[0027] 右半部分指示该连锁群上的标记名称，左半部分指示每个标记对应的遗传图据。
[0028] 图3为一种位于A6连锁群上的角果数主效QTL位点LOD曲线示意图。
[0029] 图中横坐标代表连锁群，纵坐标代表LOD值。
[0030] 图4为利用分子标记CNU400对F3单株进行基因型分析和筛选的带型示意图。
[0031] 图中1-46为F3单株编号，最后两个Pl和P2分别代表亲本中双11和73290。A、 B、H和-分别代表中双11、73290、杂合以及缺失基因型。
【具体实施方式】
[0032] 本发明所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术。本发明实施例中使用的是油 菜中双11号和油菜品种73290杂交构建的群体。
[0033] 实施例1 :
[0034] 油菜角果数分离群体的构建及性状测定：
[0035] 本发明实施例中使用油菜品种中双11 (主序角果数60个左右）和多角果品系 73290 (主序角果数100个左右）杂交构建F2和F2:3分离群体。两亲本和两群体的角果数 表型在成熟期收获后经考种鉴定。角果数考种数据表明：两群体角果数均呈正态分布，证明 角果数性状的数量遗传特征（图1)。
[0036] 实施例2 :
[0037] 叶片总DNA的提取：
[0038] 利用CTAB法提取叶片总DNA，具体步骤如下：
[0039] (1)取0. 1克新鲜叶片放入研磨，加700微升提取液研磨，随即转入1. 5毫升离心 管中置于65°C恒温水浴60分钟，其间混合2-3次；
[0040] (2)加等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25 :24 :1，V/V/V)，轻轻颠倒使其充分混匀， 在12000rpm离心10分钟，轻轻吸取上清液转入另一 1. 5毫升离心管；加等体积的氯仿：异 戊醇（24 :1，V/V)重新抽提一次；
[0041] (3)加入1毫升-20°C预冷无水乙醇，置于_20°C冷冻不超过30分钟让DNA析出； 12000rpm离心10分钟让DNA沉淀，倒掉离心管中乙醇溶液；用75% (V/V)乙醇清洗2 - 3 次，倒掉浸泡液，打开离心管盖置于通风橱内吹干；
[0042] (4)加入 TE(10mM Tris，pH 8. 0 ; ImM EDTA，pH 8. 0)溶解 DNA ;用紫外分光光度计 测定DNA的浓度，于-20°C冰箱中保存备用；
[0043] 实施例3 :
[0044] 引物的开发和合成：
[0045] 申请人利用的SSR引物包括两类：合成油菜公开（http: //www. ukcrop. net/ Brassica DB)和自主开发的 SSR、和 STS 引物（Wang et al. 2012 ;Huang et al. 2013 ;Shi et al. 2014,）并对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显 影后对条带的大小进行判别，筛选多态性引物。过程中所用到的主要软件包括SSRPrimer， BWA和sa mtools ;主要试剂包括Taq酶、dNTP、丙烯酰胺、尿素、冰醋酸、硝酸银等。
[0046] 实施例4 :
[0047] 引物多态性的筛选，其流程如下：
[0048] (1)从亲本中各随机选择10株DNA等量混合，作为筛选引物的模板。
[0049] (2)利用溶解后的引物对亲本DNA进行PCR扩增，
[0050] 反应体系：
[0051]
[0052]
【主权项】
1. 一种与甘蓝型油菜角果数性状主效QTL位点紧密连锁的分子标记的 引物，CNU400F: 5, - CGAGTTTTTGTGTGTACGTATAGTAAT-3' 和 CNU400R:5，-CCAAAGTGCGTAAAGGAAGG-3,。
2. 权利要求1所述引物在甘蓝型油菜角果数性状标记辅助选择中的应用。
3. 权利要求1所述引物在甘蓝型油菜角果数性状QTL位点精细定位中的应用。
4. 权利要求1所述引物在甘蓝型油菜角果数性状QTL位点图位克隆中的应用。
5. 权利要求1所述的引物在加速油菜角果数性状改良进程中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种油菜角果数主效QTL的分子标记及应用，该标记可用于角果数性状改良中的分子标记辅助选择以及该QTL位点的精细定位和图位克隆。该分子标记的引物为CNU400F:5’-CGAGTTTTTGTGTGTACGTATAGTAAT-3’和CNU400R：5’-CCAAAGTGCGTAAAGGAAGG-3’。利用该标记对油菜中双11号和73290F3代进行选择，筛选出的F3单株角果数高于中双11的比例高达92.3%。因此，利用该标记进行辅助选择可大大提高高产育种的选择效率。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104805080
【申请号】CN201410597585
【发明人】王汉中, 师家勤, 杨玉花, 叶姜, 刘贵华, 王新发
【申请人】中国农业科学院油料作物研究所
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2014年10月30日
文档序号 :
【 8483910 】
技术研发人员：王汉中,师家勤,杨玉花,叶姜,刘贵华,王新发
技术所有人：中国农业科学院油料作物研究所
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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