一种嵌合抗原受体脂肪干细胞及其制备方法
[0069]之后将连接得到的质粒做细菌转化，其过程为:将连接得到的质粒放置在冰上，并且将DH5a细菌(每管50微升)在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42°C水浴热激90秒钟;然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟;最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37°C振荡培养I小时;培养完成之后涂平板，然后放置在37°C培养过夜;第二天挑取克隆测序。
[0070]对于测序正确的序列，进一步需要包装成慢病毒。其过程为:将PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8(铰链序列及跨膜序列)-CD28-endo-4-lBB-endo-CD3G或者PLVX-microRNA-101载体20微克，与pREV、pRRE、pVSVG各10微克混合;然后将50微升超纯水和50微升脂质体混合;之后将质粒和脂质体混合均匀，在室温放置15分钟；最后加入到汇合度为70%-80%的10厘米培养皿的293T细胞中。然后在6小时之后换上1mL培养基，72小时之后收集上清，用0.44微米滤器过滤之后，采用50000g/min离心90分钟，分别收集PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8(铰链序列及跨膜序列)-CD28-endo-4-lBB-endo-CD3G或者PLVX- microRNA-101慢病毒，备用。
[0071]收集到PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列_CD8(铰链序列及跨膜序列)_CD28-endo-4-lBB-endo-CD3G或者PLVX- microRNA-101慢病毒之后，同时将这两种病毒感染脂肪干细胞，其感染过程为:在10厘米培养皿中培养脂肪干细胞到40%-50%汇合度，然后将PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8(铰链序列及跨膜序列)-CD28-endo-4-lBB-endo-CD3G或者PLVX- microRNA-101这两种慢病毒各ImL以及培养基8mL加入培养皿混合均匀，12小时之后换新鲜培养液即可。
[0072]病毒感染完成之后，就将表达microRNA-101的CAR脂肪干细胞大规模体外扩增。培养到足够数量之后，对细胞进行消化即加入适量胰蛋白酶消化，最后用磷酸盐缓冲液清洗三遍之后，输入人体用于移植治疗肿瘤。
[0073]实施例6
在本发明中，针对不同的实体肿瘤，可以结合改进的针对脂肪干细胞的CAR-Trunc-FGFRl、脂肪干细胞以及表达microRNA-101来治疗肿瘤，如图8所示。同理，首先需要合成针对脂肪干细胞的CAR-Trunc-FGFRl，各个结构域串联序列为:可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFRl-trans-endo序列，其中，合成的序列两端需要合成EcoR I和BamH I酶切位点。另外，还需要合成能够分泌到胞外的microRNA-101表达序列，由于序列较短，我们采用先合成带有EcoR I和BamH I双酶切位点的单链寡核苷酸链，然后利用退火的方法得到能够表达microRNA-101的双链寡核苷酸。
[0074]然后将上述两种序列分别构建到PLVX慢病毒载体上。构建过称为:采用EcoR I和BamH I对PLVX载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的PLVX载体与合成的可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFRl-trans-endo序列或者microRNA-101的双链寡核苷酸按照摩尔比例为I: 10混合(20微升体系)，再加入T4 DNA连接酶缓冲溶液，之后在45°C水浴热激5分钟，热激之后放置到4°C冰箱5分钟，最后加入2微升T4 DNA连接酶，在16 °C摄氏度连接过夜。
[0075]之后将连接得到的质粒做细菌转化，其过程为:将连接得到的质粒放置在冰上，并且将DH5a细菌(每管50微升)在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42°C水浴热激90秒钟;然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟;最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37°C振荡培养I小时;培养完成之后涂平板，然后放置在37°C培养过夜;第二天挑取克隆测序。
[0076]对于测序正确的序列，进一步需要包装成慢病毒。其过程为:将PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFRl-trans-endo载体或者PLVX- microRNA-101载体20微克，与pREV、pRRE、pVSVG各10微克混合;然后将50微升超纯水和50微升脂质体混合;之后将质粒和脂质体混合均匀，在室温放置15分钟;最后加入到汇合度为70%-80%的10厘米培养皿的293T细胞中。然后在6小时之后换上1mL培养基，72小时之后收集上清，用0.44微米滤器过滤之后，采用50000g/min离心90分钟，分别收集PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFRl-trans-endo或者PLVX- microRNA-101慢病毒，备用。
[0077]收集到PLVX-信号肽序列-scFv-FGFRl-trans-endo或者PLVX-microRNA-101 慢病毒之后，同时将这两种慢病毒感染脂肪干细胞，其感染过程为:在10厘米培养皿中培养脂肪干细胞到40%-50%汇合度，然后将PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFRl-trans-endo 或者 PLVX-microRNA-101 这两种慢病毒各 ImL 以及培养基 8mL 加入培养皿混合均匀， 12小时之后换新鲜培养液即可。
[0078]病毒感染完成之后，就将表达microRNA-101的CAR-Trunc-FGFRl脂肪干细胞大规模体外扩增。培养到足够数量之后，对细胞进行消化即加入适量胰蛋白酶消化，最后用磷酸盐缓冲液清洗三遍之后，输入人体用于移植治疗肿瘤。
[0079]综上所述，本发明提供的一种嵌合抗原受体脂肪干细胞及其制备方法，本发明结合了嵌合抗原受体特异性地结合特异肿瘤类型的高靶向性特点，以及脂肪干细胞免疫原性低、容易被病毒感染、能在短时间内大规模扩增以及肿瘤杀伤因子的抗肿瘤作用，能够解决当前CART治疗肿瘤的多个包括“免疫风暴”、嵌合抗原表达效率低以及异体移植免疫排斥等难以解决的问题，进而提高了治疗肿瘤的效果。经过本发明改造的脂肪干细胞，既具有了非常特异的迀移至特定肿瘤部位的高效靶向性，同时又避免了过度激活免疫系统从而进一步产生免疫排斥的风险，并且其携带的肿瘤杀伤因子又能够在肿瘤部位高效杀伤肿瘤，进而达到治疗肿瘤的目的。
[0080]应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
【主权项】
1.一种嵌合抗原受体脂肪干细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体脂肪干细胞由嵌合抗原受体、脂肪干细胞和肿瘤杀伤因子组成。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体由scFv抗原结合序列、跨膜序列及胞内信号转导序列组成。3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其特征在于，所述scFv抗原结合序列包括轻链可变区序列和重链可变区序列。4.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其特征在于，所述scFv抗原结合序列包括轻链可变区序列、重链可变区序列、连接轻链可变区序列和重链可变区序列的优化联结区序列及位于轻链可变区序列之前的可溶信号肽序列。5.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其特征在于，所述scFv抗原结合序列为CEA、cMet、EGFRvII1、FAP、Her2、⑶2、PSMA、Mesothelin和NCAM中的一种。6.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其特征在于，所述scFv抗原结合序列和跨膜序列之间包含一段Hinge序列。7.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其特征在于，所述跨膜序列为CD8。8.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其特征在于，所述胞内信号转导序列包括CD28胞内结构域序列、4-1BB胞内结构域序列和CD3G胞内结构域序列。9.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞，其特征在于，所述肿瘤杀伤因子为TRAIL基因、TNF-α基因及TNF家族具有肿瘤杀伤作用的基因、具有肿瘤杀伤作用的mi croRNA分子以及具有肿瘤杀伤作用的蛋白因子中的一种。10.—种如权利要求1?9任一所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤: A、首先合成针对脂肪干细胞的嵌合抗原受体序列，并合成能够分泌到胞外的肿瘤杀伤因子序列； B、然后将上述嵌合抗原受体序列和肿瘤杀伤因子序列分别构建到慢病毒载体上，得到表达嵌合抗原受体或者肿瘤杀伤因子的慢病毒； C、将表达嵌合抗原受体或者肿瘤杀伤因子的慢病毒感染脂肪干细胞，慢病毒感染完成之后，得到分泌表达肿瘤杀伤因子的嵌合抗原受体脂肪干细胞。
【专利摘要】本发明公开一种嵌合抗原受体脂肪干细胞及其制备方法，所述嵌合抗原受体脂肪干细胞由嵌合抗原受体、脂肪干细胞和肿瘤杀伤因子组成。本发明结合了抗原受体特异性性地结合特异肿瘤类型的高靶向性特点，以及脂肪肝细胞免疫原性低、容易被病毒感染、能再短时间内大规模扩增以及肿瘤杀伤因子的抗肿瘤作用，能够解决当前CART治疗肿瘤的“免疫风暴”、嵌合抗原表达效率低及异体移植免疫排斥等问题，提高了治疗肿瘤的效果。经过改造的脂肪干细胞，既具有了特异的迁移至特定肿瘤部位的高效靶向性，同时又避免了过度激活免疫系统从而进一步产生免疫排斥的风险，并且其携带的肿瘤杀伤因子又能够在肿瘤部位高效杀伤肿瘤，进而达到治疗肿瘤的目的。
【IPC分类】C12N15/867, C12N5/10
【公开号】CN105567640
【申请号】CN201610054302
【发明人】陈光风, 史秀娟, 刘小青
【申请人】苏州佰通生物科技有限公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年1月27日
文档序号 :
【 9804447 】
技术研发人员：陈光风,史秀娟,刘小青
技术所有人：苏州佰通生物科技有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
技术研发人员：陈光风,史秀娟,刘小青
技术所有人：苏州佰通生物科技有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除