一种嵌合抗原受体脂肪干细胞及其制备方法
[0052]收集到PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFRl-trans-endo或者PLVX-TRAIL慢病毒之后，同时将这两种慢病毒感染脂肪干细胞，其感染过程为:在10厘米培养皿中培养脂肪干细胞到40%-50%汇合度，然后将PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFRl-trans-endo或者PLVX-TRAIL这两种慢病毒各ImL以及培养基8mL加入培养皿混合均匀，12小时之后换新鲜培养液即可。
[0053]病毒感染完成之后，就将分泌表达TRAIL的CAR-Trunc-FGFRl脂肪干细胞大规模体外扩增。培养到足够数量之后，对细胞进行消化即加入适量胰蛋白酶消化，最后用磷酸盐缓冲液清洗三遍之后，输入人体用于移植治疗肿瘤。
[0054]实施例3
CAR-脂肪干细胞表达TNF-α治疗肿瘤
在本实施例中，针对不同的实体肿瘤，首先结合第三代CAR、脂肪干细胞以及表达肿瘤杀死因子TNF-a来治疗肿瘤，如图5所示。首先需要合成第三代嵌合抗原受体即合成串联的:可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8(铰链及跨膜)-CD28-endo-4-lBB-endo-CD3G序列，其中，合成的序列两端需要合成EcoR I和BamH I酶切位点。另外，还需要合成能够分泌到胞外的TNF-α，其序列见Seq-TNF-α。
[0055]其中，TNF-α序列的两端也分别需要加上EcoR I和BamH I酶切位点。然后将上述两种序列分别构建到PLVX慢病毒载体上。构建过称为:采用EcoR I和BamH I对PLVX载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的PLVX载体与合成的可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8(铰链序列及跨膜序列)-CD28-endo-4-lBB-endo-CD3G序列或者TNF-α按照摩尔比例为I: 10混合(20微升体系)，再加入T4 DNA连接酶buffer溶液，之后在45°(:水浴热激5分钟，热激之后放置到4°C冰箱5分钟，最后加入2微升T4 DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
[0056]之后将连接的质粒做细菌转化，其过程为:将连接的质粒放置在冰上，并且将DH5a细菌(每管50微升)在冰上解冻;之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟;然后将混合物在42 0C水浴热激90秒钟;然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟；最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37 °C振荡培养I小时;培养完成之后涂平板，然后放置在37°C培养过夜;第二天挑取克隆测序。
[0057]对于测序正确的序列，进一步需要包装成慢病毒。其过程为:将PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8(铰链序列及跨膜序列)-CD28-endo-4-lBB-endo-CD3G或者PLVX-TNF-a载体20微克，与pREV、pRRE、pVSVG各10微克混合;然后将50微升超纯水和50微升脂质体混合;之后将质粒和脂质体混合均匀，在室温放置15分钟;最后加入到汇合度为70%-80%的10厘米培养皿的293T细胞中。然后在6小时之后换上1mL培养基，72小时之后收集上清，用0.44微米滤器过滤之后，采用50000g/min离心90分钟，分别收集PLVX-可溶信号肽序列-scFv 抗原结合序列-CD8(铰链及跨膜)-CD28-endo-4-lBB-endo-CD3G 或者 PLVX-TNF-a 慢病毒，备用。
[0058]收集到PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列_CD8(铰链及跨膜)-CD28-endo-4-lBB-endo-⑶3ζ或者PLVX-TNF-a慢病毒之后，同时将这两种慢病毒感染脂肪干细胞，其感染过程为:在10厘米培养皿中培养脂肪干细胞到40%-50%汇合度，然后将PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8(铰链序列及跨膜序列)-CD28-endo-4-lBB-endo-CD3G或者PLVX-TNF-α这两种慢病毒各ImL以及培养基8mL加入培养皿混合均匀，12小时之后换新鲜培养液即可。
[0059]病毒感染完成之后，就将分泌表达TNF-a的CAR脂肪干细胞大规模体外扩增。培养到足够数量之后，对细胞进行消化即加入适量胰蛋白酶消化，最后用磷酸盐缓冲液清洗三遍之后，输入人体用于移植治疗肿瘤。
[0060]实施例4
CAR-Trunc-FGFRl脂肪干细胞表达TNF-a治疗肿瘤
在本实施例中，针对不同的实体肿瘤，可以结合改进的针对脂肪干细胞的CAR-Trunc-FGFR1、脂肪干细胞以及表达分泌型TNF-a来治疗肿瘤，如图6所示。同理，首先需要合成针对脂肪干细胞的CAR-Trunc-FGFRl，各个结构域串联序列为:可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFRl-trans-endo序列，其中，合成的序列两端需要合成EcoR I和BamH I酶切位点。另外，还需要合成能够分泌到胞外的TNF-α基因，其序列两端也需要加上EcoR I和BamH I酶切位点。
[0061]然后将上述两种序列分别构建到PLVX慢病毒载体上。构建过称为:采用EcoR I和BamH I对PLVX载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的PLVX载体与合成的可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFRl-trans-endo序列或者TNF-α按照摩尔比例为1:10混合(20微升体系)，再加入T4 DNA连接酶缓冲溶液，之后在45°C水浴热激5分钟，热激之后放置到4°C冰箱5分钟，最后加入2微升T4 DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
[0062]之后将连接得到的质粒做细菌转化，其过程为:将连接得到的质粒放置在冰上，并且将DH5a细菌(每管50微升)在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42°C水浴热激90秒钟;然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟;最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37°C振荡培养I小时;培养完成之后涂平板，然后放置在37°C培养过夜;第二天挑取克隆测序。
[0063]对于测序正确的序列，进一步需要包装成慢病毒。其过程为:将PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFRl-trans-endo载体或者PLVX-TNF-a载体20微克，与pREV、pRRE、pVSVG各10微克混合;然后将50微升超纯水和50微升脂质体混合;之后将质粒和脂质体混合均匀，在室温放置15分钟；最后加入到汇合度为70%-80%的10厘米培养皿的293T细胞中。然后在6小时之后换上1mL培养基，72小时之后收集上清，用0.44微米滤器过滤之后，采用50000g/min离心90分钟，分别收集PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFRl-trans-endo 或者 PLVX-TNF-a 慢病毒，备用。
[0064]收集到PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFRl-trans-endo或者PLVX-TNF-α慢病毒之后，同时将这两种慢病毒感染脂肪干细胞，其感染过程为:在10厘米培养皿中培养脂肪干细胞到40%-50%汇合度，然后将PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFRl-trans-endo或者PLVX-TNF-α这两种慢病毒各ImL以及培养基8mL加入培养皿混合均匀，12小时之后换新鲜培养液即可。
[0065]病毒感染完成之后，就将分泌表达TNF-a的CAR-Trunc-FGFRl脂肪干细胞大规模体外扩增。培养到足够数量之后，对细胞进行消化即加入适量胰蛋白酶消化，最后用磷酸盐缓冲液清洗三遍之后，输入人体用于移植治疗肿瘤。
[0066]实施例5
CAR-脂肪干细胞表达microRNA-101治疗肿瘤
在本实施例中，针对不同的实体肿瘤，首先结合第三代CAR、脂肪干细胞以及表达microRNA-101来治疗肿瘤，如图7所示。首先需要合成第三代嵌合抗原受体即合成串联的:可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8(铰链序列及跨膜序列)-CD28-end0-4-lBB-end0-CD3G序列，其中，合成的序列两端需要合成EcoR I和BamH I酶切位点。另外，还需要合成能够分泌到胞外的microRNA-101表达序列(序列见Seq-1O 1-Forward和Seq-1O 1-Rever se)，由于序列较短，我们采用合成单链寡核苷酸链，然后退火的方法。
[0067]其中，上述序列的两端也分别加上EcoRI和BamH I酶切位点。序列合成之后，首先进行退火反应，其过程为:按照合成序列说明书将寡聚核苷酸单链用ddH20溶解成50 μΜ的溶液；然后将8μ1 的Seq-101_Forward、8yl 的Seq-101-Forward以及2μ1 的NEB Buffer 2和2 μ?的ddH20混合均匀，然后把EP管放在95°C水浴5分钟。此后关闭水浴锅，让EP管在水浴锅中自然降温到常温即完成退火，得到能够表达microRNA-101的双链寡核苷酸。
[0068]然后将上述两种序列分别构建到PLVX慢病毒载体上。构建过称为:采用EcoRI和BamH I对PLVX载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的PLVX载体与合成的可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8(铰链序列及跨膜序列)-CD28-endo-4-lBB-endo-⑶3ζ序列或者表达microRNA-101的双链寡核苷酸按照摩尔比例为1:10混合(20微升体系)，再加入T4 D
文档序号 :
【 9804447 】
技术研发人员：陈光风,史秀娟,刘小青
技术所有人：苏州佰通生物科技有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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