一种嵌合抗原受体脂肪干细胞及其制备方法
[0034]进一步地，本发明所述嵌合抗原受体由scFv抗原结合序列、跨膜序列及胞内信号转导序列组成。本发明需构建第三代的嵌合抗原受体以及改进的针对脂肪干细胞靶向性的嵌合抗原受体(CAR-Trunc-FGFRl)。如图1所示，第三代的嵌合抗原受体由scFv抗原结合序列、跨膜序列及胞内信号转导序列组成。其中，scFv抗原结合序列包括针对不同肿瘤的序列，所述scFv抗原结合序列为CEA(序列见Seq-CEA-scFv)、cMet(序列见Seq-cMet-scFv)、EGFRvII I (序列见Seq-EGFRvI I 1-scFv)、FAP(序列见Seq-FAP-scFv)、Her2(序列见Seq-Her2-scFv)、GD2(序列见 Seq_GD2_scFv)、PSMA(序列见 Seq-PSMA-scFv)、Me so the I in (序列见 Seq-Mesothel in-scFv)和 NCAM(序列见 Seq-NCAM-scFv)等中的一种。
[0035]进一步地，本发明所述scFv抗原结合序列包括轻链可变区序列和重链可变区序列。优选地，本发明所述scFv抗原结合序列包括轻链可变区序列、重链可变区序列、连接轻链可变区序列和重链可变区序列的优化联结区序列及位于轻链可变区序列之前的可溶信号妝序列，如图1所不。
[0036]跨膜序列在脂肪干细胞活化中起着重要的作用，对跨膜序列不同的设计能够影响导入的CAR基因的表达能力。值得注意的是，所述scFv抗原结合序列和跨膜序列之间包含一段铰链序列(Hinge序列)，如图1所示。所述Hinge序列为CD8的胞外铰链结构。优选地，所述跨膜序列为CD8。而经过实验验证简化了操作，采用CD8分子的胞外铰链结构将跨膜序列与scFv抗原结合序列直接相连接。换句话说，本发明跨膜序列包括CD8的胞外铰链序列及跨膜序列(序列见 Seq-CD8-hinge_trans) ο
[0037]进一步地，本发明所述胞内信号转导序列包括⑶28胞内结构域序列(序列见Seq-CD28_endo)，4-1BB胞内结构域序列(序列见Seq-4-lBB-endo)以及0)3ζ胞内结构域序列(序列见 Seq-CD3G_endo)。
[0038]本发明将上述不同的scFv抗原结合序列、铰链序列、跨膜序列以及胞内信号转导序列自由组合，就可以得到针对不同实体肿瘤的嵌合抗原受体脂肪干细胞。其中，所述实体肿瘤包括胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌等。
[0039]本发明中，改进的针对脂肪干细胞靶向性的嵌合抗原受体(CAR-Trunc-FGFRl)主要包括针对不同的实体肿瘤的scFv抗原结合序列、bFGF(fibroblast growth factor 2，bFGF)的主要受体FGFRl(fibroblast growth factor receptor I，FGFR1)跨膜序列及胞内信号转导序列，如图2所示。目前的研究表明，bFGF能够有效地维持脂肪干细胞的干性，因此，将bFGF的主要受体FGFRl在脂肪干细胞内高效表达能够极大地有助于维持脂肪干细胞的干性，使脂肪干细胞在体内移植之后有效地、长久地保持活性及生存。所以，本发明中，分别将针对不同肿瘤的scFv抗原结合序列和FGFRl跨膜序列及胞内信号转导序列组合成一种专门为脂肪干细胞而产生的优化CAR-Trunc-FGFRl技术。其中，各种不同的scFv抗原结合序列与在CAR中的序列相同。其中，FGFRl跨膜序列及胞内信号转导序列见Seq-FGFRl-trans-endoo
[0040]基于上述嵌合抗原受体脂肪干细胞，本发明还提供一种如上任一所述的嵌合抗原受体脂肪干细胞的制备方法，其包括步骤:
A、首先合成针对脂肪干细胞的嵌合抗原受体序列，并合成能够分泌到胞外的肿瘤杀伤因子序列；
B、然后将上述嵌合抗原受体序列和肿瘤杀伤因子序列分别构建到慢病毒载体上，得到表达嵌合抗原受体或者肿瘤杀伤因子的慢病毒；
C、将表达嵌合抗原受体或者肿瘤杀伤因子的慢病毒感染脂肪干细胞，慢病毒感染完成之后，得到分泌表达肿瘤杀伤因子的嵌合抗原受体脂肪干细胞。
[0041]通过上述制备方法，本发明结合了嵌合抗原受体特异性地结合特异肿瘤类型的高靶向性特点，以及脂肪干细胞免疫原性低、容易被病毒感染、能在短时间内大规模扩增以及肿瘤杀伤因子的抗肿瘤作用，能够解决当前CART治疗肿瘤的多个包括“免疫风暴”、嵌合抗原表达效率低以及异体移植免疫排斥等难以解决的问题，进而提高了治疗肿瘤的效果。
[0042]下面通过实施例对本发明进行详细说明。
[0043]实施例1
CAR-脂肪干细胞表达TRAIL治疗肿瘤
在本实施例中，针对不同的实体肿瘤，首先结合第三代CAR、脂肪干细胞以及表达分泌型TRAIL来治疗肿瘤，如图3所示。首先需要合成第三代嵌合抗原受体即合成串联的:可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8(铰链序列及跨膜序列)-CD28-endo-4-lBB-endo-CD3G序列，其中，合成的序列两端需要合成EcoR I和BamH I酶切位点。另外，还需要合成能够分泌到胞外的TRAIL基因(又名TNFSF10)，其序列见Seq-TRAIL。其中，TRAIL序列的两端也分别需要加上EcoR I和BamH I酶切位点。然后将上述两种序列分别构建到PLVX慢病毒载体上。构建过称为:采用EcoR I和BamH I对PLVX载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的PLVX载体与合成的可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8(铰链序列及跨膜序列)-CD28-endo-4-lBB-endo-CD3G序列或者TRAIL按照摩尔比例为1:10混合(20微升体系)，再加入T4 DNA连接酶缓冲溶液，之后在45 °C水浴热激5分钟，热激之后放置到4°C冰箱5分钟，最后加入2微升T4 DNA连接酶，在16 °C连接过夜。
[0044]之后将连接得到的质粒做细菌转化，其过程为:将连接得到的质粒放置在冰上，并且将DH5a细菌(每管50微升)在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42°C水浴热激90秒钟;然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟;最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37°C振荡培养I小时;培养完成之后涂平板，然后放置在37°C培养过夜;第二天挑取克隆测序。
[0045]对于测序正确的序列，进一步需要包装成慢病毒。其过程为:将PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8(铰链序列及跨膜序列)-CD28-endo-4-lBB-endo-CD3G或者PLVX-TRAIL载体20微克，与pREV、pRRE、pVSVG各10微克混合;然后将50微升超纯水和50微升脂质体混合;之后将质粒和脂质体混合均匀，在室温放置15分钟;最后加入到汇合度为70%-80%的10厘米培养皿的293T细胞中，即图3中的转染过程。然后在6小时之后换上1mL培养基，72小时之后收集上清，用0.44微米滤器过滤之后，采用50000g/min离心90分钟，分别收集PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8(铰链序列及跨膜序列)-CD28-endo-4-lBB-endo-CD3G 或者 PLVX-TRAIL 慢病毒，备用。
[0046]收集到PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列_CD8(铰链序列及跨膜序列)_CD28-endo-4-lBB-endo-CD3G或者PLVX-TRAIL慢病毒之后，同时将这两种慢病毒感染脂肪干细胞，其感染过程为:在10厘米培养皿中培养脂肪干细胞到40%_50%汇合度，然后将PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-CD8(铰链序列及跨膜序列)-CD28-end0-4-lBB-end0-⑶3ζ或者PLVX-TRAIL这两种慢病毒各ImL以及培养基8mL加入培养皿混合均匀，12小时之后换新鲜培养液即可。
[0047]慢病毒感染完成之后，就将分泌表达TRAIL的CAR脂肪干细胞大规模体外扩增。培养到足够数量之后，对细胞进行消化即加入适量胰蛋白酶消化，最后用磷酸盐缓冲液清洗三遍之后，输入人体用于移植治疗肿瘤。
[0048]实施例2
CAR-Trunc-FGFRl脂肪干细胞表达TRAIL治疗肿瘤
在本实施例中，针对不同的实体肿瘤，可以结合改进的针对脂肪干细胞的CAR-Trunc-FGFR1、脂肪干细胞以及表达分泌型TRAIL来治疗肿瘤，如图4所示。同理，首先需要合成针对脂肪干细胞的CAR-Trunc-FGFRl，各个结构域串联序列为:可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFRl-trans-endo序列，其中，合成的序列两端需要合成EcoR I和BamH I酶切位点。另外，还需要合成能够分泌到胞外的TRAIL基因(又名TNFSF10)，其序列两端也需要加上EcoR I和BamH頂每切位点。
[0049]然后将上述两种序列分别构建到PLVX慢病毒载体上。构建过称为:采用EcoR I和BamH I对PLVX载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的PLVX载体与合成的可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFRl-trans-endo序列或者TRAIL按照摩尔比例为1:10混合(20微升体系)，再加入T4 DNA连接酶缓冲溶液，之后在45°C水浴热激5分钟，热激之后放置到4°C冰箱5分钟，最后加入2微升T4 DNA连接酶，在16 °C连接过夜。
[0050]之后将连接得到的质粒做细菌转化，其过程为:将连接得到的质粒放置在冰上，并且将DH5a细菌(每管50微升)在冰上解冻；之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟；然后将混合物在42°C水浴热激90秒钟;然后迅速将混合物再放置在冰上冷却2-3分钟;最后加入500微升无菌LB培养基，放置在37°C振荡培养I小时;培养完成之后涂平板，然后放置在37°C培养过夜;第二天挑取克隆测序。
[0051]对于测序正确的序列，进一步需要包装成慢病毒。其过程为:将PLVX-可溶信号肽序列-scFv抗原结合序列-FGFRl-t
文档序号 :
【 9804447 】
技术研发人员：陈光风,史秀娟,刘小青
技术所有人：苏州佰通生物科技有限公司
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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