类胡萝卜素的分离方法
技术领域：
本发明涉及类胡萝卜素的微生物学制造方法。具体地，本发明涉及将作为饲料添加剂、食品添加剂、化妆品原材料、医药品原料等而有用的虾青素、角黄素 (canthaxanthin)、玉米黄质(zeaxanthin)、β-隐黄素(β-cryptoxanthin)、番爺红素 (Iycopene)、β -胡萝卜素、绿蠅黄质(phoenicoxanthin)、侧金盏花黄质(adonixanthin)、 海胆烯酮(echinenone)、Asteroidenone 和 3-羟基海胆酮(3-hydroxyechinenon)等类胡萝卜素从类胡萝卜素生产细菌的培养物中分离的方法。
背景技术：
类胡萝卜素是作为饲料添加剂、食品添加剂、化妆品原材料、医药品等而有用的天然色素。类胡萝卜素包括虾青素、角黄素、玉米黄质、隐黄素、番茄红素、胡萝卜素、 绿蝇黄质、侧金盏花黄质、海胆烯酮、Asteroidenone和3-羟基海胆烯酮等。这其中，虾青素作为诸如鲑鱼、鳟鱼、真鲷等养殖鱼类的体色改善剂、家禽类的卵黄色改善剂这样的饲料添加剂是有用的。此外，虾青素作为安全的天然食品添加剂或者健康食品原材料、化妆品原材料在产业上的价值高。侧金盏花黄质和绿蝇黄质的工业制造方法已经确立，从而其像虾青素那样作为饲料添加剂、食品添加剂、化妆品原材料、医药品等的用途是可以期待的。而且，胡萝卜素作为饲料添加剂、食品添加剂、化妆品原材料、医药品等使用，角黄素作为饲料添加剂、食品添加剂、化妆品等使用，玉米黄质作为食品添加剂、饲料添加剂、化妆品原材料等使用。而且，番茄红素、海胆烯酮、β-隐黄素、3-羟基海胆烯酮、Asteroidenone等作为饲料添加剂、食品原材料、化妆品原材料等的应用也是可以期待的。作为这些类胡萝卜素的制造方法，已知有化学合成方法、从天然物提取的方法、利用微生物产生的方法等。作为虾青素的化学合成方法，已知有由β -胡萝卜素进行转换的方法(非专利文献 1 =Pure Appl. Chem.，57，741，1985)和从 C15 镇盐(phosphonium salt)合成的方法(非
专利文献2 :Helv. Chim. Acta，64，2436，1981)。此外，虾青素存在于真鲷、鲑鱼等鱼类和虾、 蟹、磷虾等甲壳类中，因此也可以从它们中提取。采用化学合成方法制造的虾青素已经作为饲料添加剂销售。作为利用微生物生产虾青素的方法，已经报导的有利用绿藻类雨生红球藻 (Haematococcus pluvialis)的培养法(专利文献1 日本特开2007-97584)、利用红色酵母红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)的发酵法(专利文献2 日本特开平11_)、利用属于鞘氨醇单胞菌属69969 (Sphingomonas)的细菌的发酵法(专利文献3:日本特开 2006-191919)、利用属于短波单胞菌属(Brevundimonas)的细菌的发酵法(专利文献4 日本特开2006-340676)、利用属于赤细菌属(Erythrobacter)的细菌的发酵法(专利文献5 日本特开2008-259452)、利用属于副球菌属(Paracoccus)的细菌(以下也称作“副球菌属细菌”)的发酵法。作为生产虾青素的属于副球菌属的细菌的例子，可以列举出E-396株和 A-581-1株(专利文献6 日本特开平7-79796和非专利文献3 international Journal of Systematic Bacteriology (1999)，49，277-282)。作为其他虾青素生产性的属于副球菌属的细菌，可以列举出马氏副球菌(Paracoccus marcusii)MHl株(专利文献7 日本特表 2001-512030)、Paracoccus haeundaensis BC74171 株(非专禾丨J文献 4 international Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2004), 54,1699-1702) >hIJ J< 菌属细菌N-81106株(专利文献8 日本特开2007-24420 、产玉米素副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens) ( ^ ^ ^1J5 International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology (2003), 53, 231-238)和 Paracoccus sp. PC-1 株(专利文献 9 :W0 2005/118812)等。然而，上述的类胡萝卜素制造方法存在若干问题。例如，从安全性的观点来看，化学合成法是会给与消费者不优选的印象的方法。此外，从天然物中提取制造成本高。而且， 利用绿藻类或酵母进行生产，则因为生产性低下并且具有坚固的细胞壁，因此存在难于提取类胡萝卜素的问题。另一方面，属于副球菌属的细菌具有增殖速度快、类胡萝卜素的生产性高、容易从该细菌提取类胡萝卜素等优点。然而，副球菌属细菌将一部分类胡萝卜素以小泡(vesicle) 的形式分泌至细胞外，而大多类胡萝卜素以极小微粒的形式分散在液体中，因此从培养物除去上清、以高收率回收类胡萝卜素是困难的。在作为副球菌属细菌以外的类胡萝卜素生产微生物而传统公知的绿藻类雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)、红色酵母红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)中，类胡萝卜素全部蓄积在细胞内，因此不会产生这样的问题。 在利用类胡萝卜素产生副球菌属细菌的培养中，细胞外的类胡萝卜素多时可以达到包括细胞内的类胡萝卜素在内的全部类胡萝卜素的80%。作为从副球菌属细菌的培养物分离类胡萝卜素的方法，已经提出了下述方法在足以将细胞菌饼化的第一速度下对培养物进行离心分离，回收包含类胡萝卜素的上清，在足以将类胡萝卜素小泡菌饼化的第二速度下对该上清进行离心分离(专利文献4 日本特表2001-512030)。然而，类胡萝卜素在培养上清中以极其微小的粒子的形式存在，因此为了进行菌饼化，有必要进行100，OOOXg水平的超高速离心分离，考虑到设备费和动力费并不实用。现有技术文献专利文献专利文献1专利文献2专利文献3专利文献4专利文献5专利文献6专利文献7专利文献8专利文献9非专利文献非专利文献1 =Pure Appl. Chem.，57，741，1985非专利文献2 :Helv. Chim. Acta, 64，2436，1981非专利文献 3 !International Journal of Systematic Bacteriology (1999),日本特开2007-97584号公报 日本特开平11-69969号公报 日本特开2006-191919号公报 日本特开2006-340676号公报 日本特开2008-259452号公报 日本特开平7-79796号公报 日本特表2001-512030号公报 日本特开2007-244205号公报 国际公开第2005/118812号小册子49,277-282非专禾1J 文献 4 International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology(2004)，54，1699-1702__ I 禾1J 文 5 international Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology(2003)，53，231-238
发明内容
发明所要解决的问题鉴于上述实际状况，本发明的目的在于提供从产生类胡萝卜素的细菌的培养物除去上清、并以高收率回收类胡萝卜素的方法。解决问题的方法本发明人为解决上述问题进行了各种研究，结果发现通过在将产生类胡萝卜素的细菌的培养物的PH调整至酸性侧后，进行离心分离、过滤分离或滗析(decantation)，能够以高收率分离类胡萝卜素，从而完成了本发明。SP，本发明如下(1)分离类分离类胡萝卜素的方法，该方法包括在酸性条件下从生产类胡萝卜素的细菌的培养物沉淀含有类胡萝卜素和菌体的浓缩物的步骤。(2)制造类胡萝卜素的方法，该方法包括在酸性条件下从生产类胡萝卜素的细菌的培养物沉淀含有类胡萝卜素和菌体的浓缩物，并从所得沉淀物回收类胡萝卜素的步骤。(3)根据⑴或⑵所述的方法，其中，酸性条件为pH5. 5以下的条件。(4)根据⑴或⑵所述的方法，其中，酸性条件是通过在培养物中加入酸来调整的。(5)根据(4)所述的方法，其中，酸是选自硫酸、盐酸、硝酸、醋酸、柠檬酸、琥珀酸、 磷酸、苹果酸、丁酸、丙酸、草酸、葡糖酸、酒石酸、苯二甲酸(7々>酸)、碳酸以及抗坏血酸中的至少1种。(6)根据⑴或⑵所述的方法，其中，类胡萝卜素是选自虾青素、角黄素、 玉米黄质、隐黄素、番茄红素、胡萝卜素、绿蝇黄质、侧金盏花黄质、海胆烯酮、 Asteroidenone以及3_羟基海胆烯酮中的至少1种。(7)根据⑴或⑵所述的方法，其中，细菌是属于副球菌属(Paracoccus)的细菌。(8)根据(1)或⑵所述的方法，其中，所述细菌的与16S核糖体RNA对应的DNA 的碱基序列与SEQ ID NO 1所述的碱基序列95%以上同源。(9)根据(1)或(2)所述的方法，其中，细菌是Ε-396株(FERM ΒΡ-4283)或Α-581-1 株(FERM ΒΡ-4671)或它们的突变株。(10)根据(1)所述的方法，其中，沉淀浓缩物的步骤通过选自离心分离、过滤分离和滗析中的至少1种进行。(11)通过⑴ (10)中任一项所述的方法得到的含有类胡萝卜素的组合物。发明效果根据本发明，能够从培养物除去上清，以高收率回收类胡萝卜素。
[图1]显示通过离心分离分离的各pH下的类胡萝卜素的回收率的图。[图2]显示通过离心分离分离、然后再提供给加热处理的各pH下的类胡萝卜素的回收率的图。发明的
具体实施例方式以下，对本发明进行更具体的说明。本发明的范围不局限于这些说明，除了以下的示例以外，可以在不违背本发明的要旨的范围内适当进行改变来进行实施。需要说明的是，将本说明书中引用的全部出版物，例如现有技术文献、公开公报、 专利公报以及其它专利文献中的全部内容并入本说明书中作为参考。本说明书包含作为本申请要求优先权的基础的日本特愿2009-019935号说明书(申请日2009年1月30日)的内容。本发明涉及培养产生类胡萝卜素的细菌、并从其培养物制造类胡萝卜素的方法， 本方法包括如下步骤在酸性条件下进行从培养物通过离心分离、过滤分离或滗析沉淀包含类胡萝卜素的浓缩物的步骤。通过本发明的方法，能够以低成本制造类胡萝卜素。对于用于本发明的细菌没有任何限制，只要是产生类胡萝卜素的细菌即可，优选使用属于副球菌属、鞘氨醇单胞菌属、短波单胞菌属或赤细菌属的细菌，这其中优选属于副球菌属的细菌。在属于副球菌属的细菌中，优选使用Paracoccus carotinifaciens、 马氏副球菌、Paracoccus haeundaensis和产玉米素副球菌,特别优选使用Paracoccus carotinifaciens。作为属于副球菌属的细菌的具体菌株的例子，可以列举出Paracoccus carotinifaciens E-396 株(FERM BP-4283)和副球菌属细菌 A-581-1 株(FERM BP-4671)， 它们的突变株也优选用于本发明。此外，作为产生类胡萝卜素的细菌，优选使用与16S核糖体RNA对应的DNA的碱基序列与SEQ ID NO :1记载的E-396株的碱基序列具有高同源性的细菌。这里所称的“具有高同源性”是指SEQ ID NO 1记载的碱基序列与目的细菌的对应碱基序列优选95%以上、 更优选96%以上、进一步优选97%以上、特别优选98%以上、最优选99%以上同源。与16S核糖体RNA对应的DNA的碱基序列是指将16S核糖体RNA的碱基序列中的U(尿嘧啶)替换为T(胸腺嘧啶)而得到的碱基序列。基于该16S核糖体RNA的碱基序列的同源性的微生物分类法近年来成为主流。传统的微生物分类法是基于该微生物的运动性、营养要求性、糖同化性等菌学性质来分类的， 因此当出现自然突变引起的性状变化等时，存在将微生物错误分类的情况。相对于此，16S 核糖体RNA的碱基序列在遗传上极为稳定，因此基于其同源性的分类法与传统的分类法相比分类的可靠性大幅度提高。Paracoccus carotinifaciens E-396株的16S核糖体RNA的碱基序列与其他的产生类胡萝卜素的细菌马氏副球菌DSM 11574株、副球菌属细菌N-81106株、Paracoccus haeundaensis BC 74171株、副球菌属细菌A-581-1株、产玉米素副球菌ATCC 21588株和Paracoccus sp. PC-I株的16S核糖体RNA的碱基序列之间的同源性，分别为99. 7%、 99. 7%,99. 6%,99. 4%,95. 7%和95. 4%，可见这些菌株在分类学上为亲缘关系极近的菌株。因此，可以说这些菌株作为产生胡萝卜素的细菌组成了一个群组。因此，这些菌株在本发明中优选使用，能够有效地产生类胡萝卜素。在本发明中，也可以使用类胡萝卜素的生产性得到改良的突变株。作为得到改良的突变株的例子，可以列举虾青素生产性能高的菌株(日本特开2001-95500)、能够选择性地产生大量角黄素的菌株(日本特开2003-30487 、能够选择性地产生大量玉米黄质和 β-隐黄素的菌株(日本特开2005-87097)、能够选择性地产生番茄红素的菌株(日本特开 2005-87100)、沉降性提高的菌株等。类胡萝卜素的生产性得到改良的突变株，可以通过突变处理和筛选来取得。进行突变处理的方法只要能够诱发突变即可，对其没有特殊限制。例如，可以采用使用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和甲磺酸乙酯(EMS)等突变剂的化学方法、紫外线照射和X射线照射等物理方法、利用基因重组和转座子等的生物学方法等。对进行突变处理的微生物没有特别限制，优选为产生类胡萝卜素的细菌。此外，突变株也可以是由自然发生的突变所产生的。对突变株的筛选方法没有特殊限制，例如，除了通过琼脂培养基上的菌落的颜色来对目标突变株进行选择的方法之外，可以列举在试管、烧瓶、发酵罐等中对突变株进行培养，利用吸光度、高效液相色谱、薄层层析等进行类胡萝卜素色素分析而选择目标突变株的方法等。突变和筛选的步骤可以是一次，此外，例如可以将突变和筛选步骤反复进行两次以上，从而由突变处理和筛选而得到突变株，并且对其进一步进行突变处理和筛选而获得生产性得到改良的突变株。对于本发明生产的类胡萝卜素没有特殊限制，可以是例如虾青素、角黄素、 玉米黄质、隐黄素、番茄红素、胡萝卜素、绿蝇黄质、侧金盏花黄质、海胆烯酮、 Asteroidenone或3_羟基海胆烯酮，优选作为叶黄素(Xanthophyll，即含氧类胡萝
卜素)的虾青素、角黄素、玉米黄质、隐黄素、绿蝇黄质、侧金盏花黄质、海胆烯酮、 Asteroidenone或3-羟基海胆烯酮。更优选虾青素、角黄素、绿蝇黄质、侧金盏花黄质、玉米黄质或β-隐黄素，更优选虾青素。通过本发明制造的类胡萝卜素可以是一种，也可以是多种的组合。此外，对于虾青素、玉米黄质、隐黄素、绿蝇黄质、侧金盏花黄质等具有羟基的类胡萝卜素而言，可以有与脂肪酸形成的酯、或与糖结合而成的糖苷、未与化合物结合的游离体等存在形式。通过本发明的方法得到的类胡萝卜素可以是任何存在形式，特别优选游离体。下面对本发明中的培养所述细菌的方法进行说明。用于本发明的培养的类胡萝卜素生产用培养基可以是任何产生类胡萝卜素的细菌能够生长繁育、并生产类胡萝卜素的培养基，优选使用含有碳源、氮源、无机盐类以及视需要还含有维生素类等的培养基。作为碳源，可以列举例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇和麦芽糖等糖类，醋酸、富马酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、丙二酸和丙酮酸等有机酸，乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、异丁醇和甘油等醇类，大豆油、米糠油、橄榄油、玉米油、芝麻油和亚麻籽油等油脂类等，其中优选使用葡萄糖或蔗糖。在这些碳源中，可以使用1种或2种以上。在培养前的培养基(初始培养基)中添加的量可以依碳源的种类不同而适当调整，通常在每IL 培养基中为1 100g、优选2 50g。此外，不但可以在初始培养基中添加碳源，也优选在培养过程中逐次地或连续地进行补加供给。作为无机氮源，可以使用硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等铵盐类，硝酸钾等硝酸盐类，氨气和尿素等中的1种或2种以上。添加量可以依氮源的种类而适当进行调整，通常相对于IL培养基为0. Ig 20g，优选为0. 2 10g。作为有机氮源，可以使用例如玉米浆(corn steep liquor)(含过滤处理物)、药用培养基(pharmamedia)、大豆饼(大豆粕)、大豆粉、花生粉(peanuts meal)、酒糟可溶物 (distiller' s solubles)、干燥酵母和谷氨酸钠等中的1种或2种以上。添加浓度可以依氮源的种类而适当进行调整，通常为0 80g/L，优选为0 30g/L。无机氮源和有机氮源通常添加在初始培养基中，也优选进行逐次地或连续地补加供给。作为无机盐类，使用例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠等磷酸盐类、硫酸镁、氯化镁等镁盐类、硫酸铁、氯化铁等铁盐类、氯化钙、碳酸钙等钙盐类、碳酸钠、氯化钠等钠盐类、硫酸锰等锰盐类、氯化钴等钴盐类、硫酸铜等铜盐类、硫酸锌等锌盐类、钼酸钠等钼盐类、硫酸镍等镍盐类、硒酸钠等硒盐类、硼酸和碘化钾等中的1种或2种以上。添加量可以依无机盐的种类不同而适当进行调整，通常相对于IL培养基为0. 0001 15g。无机盐类通常添加在初始培养基中，也可以逐次地或者连续地进行补加供给。作为维生素类，可以使用例如氰钴胺素(cyanocobalamin)、核黄素、泛酸、吡哆醇、 硫胺素、抗坏血酸、叶酸、烟酸、对氨基苯甲酸、生物素、肌醇、胆碱等。添加比例可以依维生素类的种类不同而适当进行调整，通常在IL培养基中为0. 001 lOOOmg，优选0.01 IOOmgo维生素类通常添加在初始培养基中，也可以逐次地或者连续地进行补加供给。在本发明中，优选使用用于抑制培养物起泡的消泡剂。消泡剂的种类可以是任何有能够抑制泡沫的发生或消去泡沫的作用、并且对于生产菌的抑制作用小的消泡剂。例如， 可以列举醇类消泡剂、聚醚类消泡剂、酯类消泡剂、脂肪酸类消泡剂、有机硅类消泡剂、磺酸类消泡剂等。添加量可以依消泡剂种类的不同而适当进行调整，通常相对于IL培养基为 0. Olg 10g。消泡剂通常添加在灭菌前的初始培养基中。而且，可以在培养过程中连续或者间歇地补加添加。本发明中使用的类胡萝卜素生产用培养基是在进行了杀菌处理后用于细菌的培养。杀菌处理只要是本领域技术人员即可适当进行。例如可以使用高压灭菌锅对适当容器中的培养基进行加热灭菌。或者，可以使用灭菌过滤器进行过滤灭菌。本发明中使用的类胡萝卜素生产用培养基的初期PH调整为2 12、优选调整为 6 9、更优选调整为6. 5 8.0。优选培养中也保持上述范围的pH。作为pH调整剂，可以示例出氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、碳酸钠水溶液、氨水、氨气、硫酸水溶液或它们的混合物。在本发明中，将类胡萝卜素生产细菌接菌在如上所述制备的类胡萝卜素生产用培养基中，并在一定的条件下进行培养。接菌可以如下方式进行通过使用试管、烧瓶或者发酵罐等的种子培养对菌株进行适宜增殖，再将所得培养物加入到类胡萝卜素生产用培养基中。在种子培养中所用的培养基只要是能够使类胡萝卜素生产菌良好增殖的培养基即可， 没有特殊限制。
培养可以在适当的培养容器中进行。培养容器可以依照培养容量而适当选择，可以列举例如试管、烧瓶、发酵罐等。培养温度为15 80°C、优选20 35°C、更优选25°C 32°C，通常在需氧条件下进行培养1 20天、优选2 12天、更优选3 9天。作为需氧条件，例如可以列举振荡培养或通气搅拌培养等，优选将溶解氧浓度控制在一定的范围内。溶解氧浓度的控制，例如可以通过改变搅拌转速、通气量、内压等来进行。优选将溶解氧浓度控制在0. 3 lOppm、更优选0. 5 7ppm、进一步优选1 5ppm。本发明的特征是，在酸性条件下进行如下步骤将从如上述地培养产生类胡萝卜素的细菌而得到的培养物通过离心分离、过滤分离或滗析沉淀包含类胡萝卜素和菌体的浓缩物的步骤(即、类胡萝卜素的分离)。通过使之为酸性条件，分散于培养上清中的类胡萝
卜素发生凝集，由于类胡萝卜素的粒径变大，并且沉降性提高，因此，在分离步骤中将培养物分离为上清以及含有类胡萝卜素和菌体的浓缩物变得非常容易。这里，在本说明书中， “培养物”是指培养上清、培养菌体或菌体的破碎物中的任何种类。将培养物调整为酸性条件的方法，通常通过在培养物中加入酸来进行。此外，作为其他方法，由于本发明的培养中在碳源消耗的同时PH降低，因此还有在培养后期停止利用碱进行的PH控制、在到达适于分离的酸性pH时结束培养的方法。使培养物为酸性条件时使用的酸可以是任何的酸，可以示例出例如硫酸、盐酸、硝酸、醋酸、柠檬酸、琥珀酸、磷酸、苹果酸、丁酸、丙酸、草酸、葡糖酸、酒石酸、苯二甲酸、碳酸、 抗坏血酸等。这些酸可以使用最浓液，也可以使用用水等稀释后的酸。酸性条件只要是酸性区域即可，可以是任何pH。上限优选pH5.5以下、更优选 PH5. 2以下、更优选pH4. 9以下。对下限没有限制，优选pHO. 5以上、更优选pHl. 5以上。pH 调整通常一边用pH电极监测培养物的pH，一边加入酸来进行。培养物可以在将pH调整至酸性区域后直接实施分离操作，但为了提高不需要的成分的除去效果，优选用水将培养物稀释后进行分离。此时的培养物的PH调整可以是在加水之前，也可以是在加水之后。此外，还可以在离心分离、过滤分离、滗析等操作的过程中加水。对于为了进行稀释而加入的水的量没有限制，优选为培养物容积的0 10倍、更优选 0. 5 3. 0倍。此外，培养结束后至进行分离的期间，为了杀死培养微生物，还可以进行加热杀菌。此时的PH调整可以在加热杀菌前，也可以在加热杀菌后。本发明中的类胡萝卜素的分离方法可以是基于沉降性进行分离的方法或者基于粒子的大小进行分离的方法中的任何方法，优选采用离心分离、过滤分离或滗析。它们可以单独，也可以2种以上组合。此外，同样的分离可以反复进行2次以上，比如进行1次离心分离，然后为了进一步回收残留在上清液中的类胡萝卜素，再一次仅将上清液提供给离心分离。用于离心分离的离心分离机可以是连续式，也可以是间歇式，优选使用连续式。 类型可以是任意的，可以列举出例如筐型、多室型、滗析器型、盘型(喷嘴型、排渣型)、管型、转子型离心分离机。离心加速度为在一般细菌的菌体分离中所采用的水平即可，优选 500 100，000 X g、更优选 1，000 50，OOOXgo用于过滤分离的膜过滤装置可以是静止型，也可以是错流型，优选为容易防止堵塞的错流型。所使用的膜的材质可以示例出例如滤纸、滤布、化学纤维、陶瓷等。此外，还可以使用硅藻土等作为过滤助剂。作为促进过滤的力的方式，可以示例出加压型、减压型、离心过滤型、压滤型等；作为膜的形状，可以示例出平膜、中空纤维膜、筒型膜等。膜的孔径可以是通常适合于分离细菌的任何孔径，优选0. OOlym 100 μπκ更优选0.01 ΙΟμπκ进一步优选0. 1 1 μ m。优选使用微滤膜、超滤膜，特别优选使用微滤膜。用于滗析的容器可以是任何容器，可以使用例如通常的圆筒形罐。滗析中对培养物进行静置的时间没有特殊限制，优选0. 5h 48h、更优选Ih Mh。对提供给分离的培养物的温度没有特殊限制，通常的温度即可，优选0°C 90°C、 更优选2°C 75°C、进一步优选4°C 60°C。在通过上述分离步骤、即离心分离、过滤分离或滗析或它们组合而从培养物得到的沉淀浓缩物中浓缩有类胡萝卜素和菌体。还优选对分离速度、分离强度等进行适宜调整， 使得沉淀浓缩物具有适于后续步骤的粘度、水分含量。分离步骤后的类胡萝卜素在浓缩物中的回收率可以因类胡萝卜素的分解/劣化、在装置内表面等上附着、向上清液的泄漏等的影响而变化，优选70 100%、更优选80 100%、进一步优选90 100%。通过对所得沉淀浓缩物进行干燥，能够得到含类胡萝卜素的干燥菌体。这样所得的干燥菌体可以直接作为饲料添加剂使用。此外，从干燥菌体提取类胡萝卜素，并视需要进行纯化，可以作为食品用、化妆品用、饲料用类胡萝卜素使用。通过不对沉淀浓缩物进行干燥而提取回收类胡萝卜素，能够制造类胡萝卜素。对干燥的方法没有特殊限制，可以列举出例如喷雾干燥、流动干燥、喷雾造粒干燥、喷雾造粒流动干燥、旋转式鼓干燥、冷冻干燥等。 此外，在培养物、沉淀浓缩物或干燥菌体的阶段，可以进行使用碱试剂或表面活性剂等的化学处理、使用溶菌酶、脂质分解酶或蛋白质分解酶等的生物化学处理、或者超声波、粉碎、加热等物理处理中的一种或二种以上的处理。在从培养物提取类胡萝卜素时，对用于提取和洗涤的溶剂没有特殊限制，可以列举出甲醇、乙醇、异丙醇等低级醇类、丙酮、四氢呋喃、甲乙酮、甲基异丁基酮、二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、己烷等。这样所得的提取物可以直接作为类胡萝卜素使用，也可以进一步进行纯化来使用。对从提取操作后的提取物分离菌体等的方法没有特殊限制，可以采用过滤、离心分离、 滗析等。作为从提取液得到类胡萝卜素沉淀物的方法，可以列举出例如通过冷却、加热、减压浓缩、添加不良溶剂、酸/碱药剂等各种盐类的添加，和它们的组合进行沉淀的方法。为了洗涤，所得类胡萝卜素沉淀物可以视需要使用少量的低级醇类等溶剂进行悬浮搅拌。对洗涤的方法没有特殊限制，作为实用方法优选可以列举出例如在悬浮搅拌后进行滤取的方法、或者从沉淀物之上通入液体的方法等。在希望极力防止培养物、沉淀浓缩物、干燥菌体、提取液、纯化物和各步骤操作中的类胡萝卜素的氧化分解的情况下，也可以在氮气等非活性气体氛围中进行。此外，也可以选择添加医药品、食品中使用的抗氧化剂。或者，组合采用这些处理。此外，为了极力防止光引起的类胡萝卜素的分解，应当在避光条件下进行。如上述得到的沉淀浓缩物、干燥菌体、提取物或纯化物可以各自单独作为类胡萝卜素使用，也可以将它们以任意比例混合使用。以下给出实施例对本发明进行具体的说明，但本发明的范围不局限于以下的例子。
需要指出的是，在实施例中的类胡萝卜素类的定量使用高效液相色谱(HPLC)如下进行。柱是将Wakosil-II 5SIL-100 ( Φ 4. 6 X 250mm)(和光纯药制)2根连接在一起后使用的。在室温附近的一定温度下按照每分钟l.OmL通入作为流动相的正己烷-四氢呋喃-甲醇混合液GO 20 1)。在测定时，用流动相将溶解有样品的四氢呋喃稀释100倍， 并将稀释后的液体20 μ L作为注入量，柱洗脱液的检测在波长470nm进行。此外，作为定量用的标准品，使用了 Sigma公司制的虾青素(Cat. No. A9335)。在测定了标准液在477nm处的吸光度(A)以及在上述条件下进行HPLC分析时的虾青素峰的面积百分比％ (B)后，使用下述式子来设定标准液的虾青素浓度。虾青素的浓度(mg/L)= A + 2150XBX100实施例1将以下组成的培养基(蔗糖30g/L、玉米浆30g/L、磷酸二氢钾0. Mg/L、磷酸氢二钾2. 78g/L、氯化钙2水合物0. lg/L、硫酸镁7水合物12g/L、硫酸铁7水合物0. 3g/L、 pH7. 2) IOOml装入500ml容量的三角烧瓶，在121 °C高压灭菌锅杀菌15分钟，制备了种子用
烧瓶培养基。然后，将以下组成的培养基(蔗糖20g/L、玉米浆30g/L、磷酸二氢钾1. 5g/L、磷酸氢二钠12水合物3. 8g/L、氯化钙2水合物0. 2g/L、硫酸镁7水合物3. Og/L、硫酸铁7水合物1. Og/L、醇类消泡剂0. 5g/L)2. OL装入5L容量的发酵罐，在121°C高压灭菌锅杀菌30分钟。在种子用烧瓶培养基中接菌一钼金接种环的Paracoccus carotinifaciens E-396株(FERM BP-4283)，、150rpm旋转振荡培养2天。然后，将其培养物80mL接菌在发酵罐中，在进行100小时的通气量Ivvm的需氧培养。用20% NaOH进行连续控制，使得培养中的PH保持在7. 2。在培养的第1天和第2天分别添加30g葡萄糖，使得碳源不枯竭。此外，最低搅拌转数为200rpm，并改变搅拌转数使得培养物中的溶解氧浓度保持在2 4ppm。通过用气泡传感器感知起泡来自动添加醇类消泡剂，从而抑制了起泡。测定培养结束时的培养物中的类胡萝卜素浓度，结果如表1所示。此外，测定培养物的PH为pH6. 7。[表 1]
权利要求
1.一种分离类胡萝卜素的方法，其包括在酸性条件下从生产类胡萝卜素的细菌的培养物沉淀含有类胡萝卜素和菌体的浓缩物的步骤。
2.一种制造类胡萝卜素的方法，其包括在酸性条件下从生产类胡萝卜素的细菌的培养物沉淀含有类胡萝卜素和菌体的浓缩物，并从所得沉淀物回收类胡萝卜素的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述酸性条件为pH5.5以下的条件。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，通过在培养物中加入酸来调整酸性条件。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述酸是选自硫酸、盐酸、硝酸、醋酸、柠檬酸、琥珀酸、磷酸、苹果酸、丁酸、丙酸、草酸、葡糖酸、酒石酸、苯二甲酸、碳酸以及抗坏血酸中的至少1种。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述类胡萝卜素是选自虾青素、角黄素、 玉米黄质、隐黄素、番茄红素、胡萝卜素、绿蝇黄质、侧金盏花黄质、海胆烯酮、 Asteroidenone和3_羟基海胆烯酮中的至少1种。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述细菌是属于副球菌属(Paracoccus)的细菌。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述细菌的与16S核糖体RNA对应的DNA的碱基序列与SEQ ID NO :1所述的碱基序列95%以上同源。
9.根据权利要求1或2所述的方法，所述细菌是Ε-396株(FERMΒΡ-4283)或Α-581-1 株(FERM ΒΡ-4671)或它们的突变株。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，通过选自离心分离、过滤分离和滗析中的至少1 种来进行沉淀浓缩物的步骤。
11.通过权利要求1 10中任一项所述的方法得到的含有类胡萝卜素的组合物。
全文摘要
本发明提供从产生类胡萝卜素的细菌的培养物以高收率回收类胡萝卜素的方法。具体地，本发明提供包括在酸性条件下从生产类胡萝卜素的细菌的培养物沉淀含有类胡萝卜素的浓缩物的步骤的分离类胡萝卜素的方法；以及包括在酸性条件下从生产类胡萝卜素的细菌的培养物沉淀含有类胡萝卜素的浓缩物、并从所得沉淀物回收类胡萝卜素的步骤的制造类胡萝卜素的方法。
文档编号C12P23/00GK102300998SQ20108000570
公开日2011年12月28日 申请日期2010年1月28日 优先权日2009年1月30日
发明者坪仓章, 平泽和明 申请人:吉坤日矿日石能源株式会社
文档序号 :
【 391790 】
技术研发人员：平泽和明
技术所有人：吉坤日矿日石能源株式会社
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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