中药黄连与吴茱萸的提取物联合5-氟尿嘧啶在制备治疗肠癌药物中的应用
[0083] 图5为表5的曲线图，从图5可以更加直观地看出左金方与50.00ug · ml/S-FU联合 用药24h与FHC细胞存活率的关系。
[0084] 表6列出了对照组，l.OOug · mL-Ι左金方，100.00ug · mL-15-FU以及二者联合用药 分别作用于FHC细胞24h和48h后FHC细胞的存活率(η = 6)。
[0085] 表6左金方与5-FU联合用药作用不同时间对FHC细胞存活率的影响(η = 6)
[0086]
[0087] *:联合用药组与左金方1 .OOug · mL-1组相比ρ〈0·05;#:联合用药组与5-FU lOO.OOug · mL-1 组相比ρ〈0·05
[0088] 图6为表6的曲线图，从图6可以更加直观地看出左金方与lOO.OOug · ml/S-FU联合 用药24h与FHC细胞存活率的关系。
[0089] 从试验结果可知：左金方与5-FU联合用药可大幅度地提高人正常结肠直肠黏膜上 皮细胞FHC的细胞存活率。联合用药组与左金方和5-FU单独用药相比p〈0.05,有显著的统计 学差异，即联合用药组的细胞保护作用优于各单独用药组。
[0090] 3.4左金方与5-FU联合用药对HT-29细胞凋亡率的影响
[0091] 取对数生长期细胞，用DMEM培养基调整细胞密度为2 X 105/mL，以1.5mL/wel 1种入 6孔板。每组6个复孔，培养12h，然后加入相应的药物作用24h，细胞刷刮取细胞，800r · min-1离心5min，去上清，加入roS重悬，调整细胞浓度为lX106/mL。取适量于流式管中，加入工 作液500uL，再加入荧光染料，350目尼龙网滤膜过滤去除细胞团块，室温避光染色15min后， 上流式细胞仪检测细胞凋亡率。测定数据按流式细胞仪所配置的软件进行数据处理，以右 下代表的早期凋亡率加上右上代表的中后期凋亡率的总和代表细胞调亡率。
[0092] 试验结果如表7、表8所示。表7、表8列出了对照组，选定浓度的左金方，选定浓度的 5-FU，以及选定浓度的左金方联合选定浓度的5-FU作用于HT-29细胞24h后，HT-29细胞的凋 亡率(n = 6)。
[0093] 表7左金方与5-FU联合用药作用24小时对HT-29细胞凋亡率的影响(n = 6)
[0094]
[0096] 联合用药组与左金方1.00ug · mL-1组相比ρ〈0·05;#:联合用药组与5-FU 50.00ug · mL-1 组相比ρ〈0·05
[0097] 图7为表7的曲线图，从图7可以更加直观地看出左金方与5-FU联合用药与HT-29细 胞凋亡率的关系。
[0098] 表8左金方与5-FU联合用药作用24小时对HT-29细胞凋亡率的影响(n = 6)
[0099]
[0100] 联合用药组与左金方1 .〇〇ug · mL-1组相比ρ〈0·05;#:联合用药组与5-FU lOO.OOug · mL-1 组相比ρ〈0·05
[0101] 图8为表8的曲线图，从图8可以更加直观地看出左金方与5-FU联合用药与ΗΤ-29细 胞凋亡率的关系。
[0102] 从试验结果可看出，l.OOug · mL-1 左金方分别与50.00ug · mL-1、lOO.OOug · mL-4-FU联合用药作用于HT-29细胞24h后，细胞凋亡率大幅度提高，联合用药组与左金方和5-FU 单独用药相比P〈〇.05,有显著的统计学差异，即联合用药组诱导凋亡的作用优于各单独用 药组。
[0103] 3.5左金方与5-FU联合用药对Bcl_2、Bax和Survivin蛋白的影响
[0104] 提取蛋白：将?15?1(^1^加入到11^细胞裂解液1?1?4，取经药物作用后的细胞约2.4 X106个加入该RIPA，在冰上裂解30min后，10 000r · min-1离心10min，取上清。
[0105] BCA测定蛋白浓度，酶标仪测定波长为A562,根据标准曲线计算出蛋白浓度。灌制 12%分离胶，4%浓缩胶的SDS-PAGE凝胶。吸取80yg总蛋白，恒压100V电泳直到溴酚蓝到达 分离胶底部。湿法电转恒压100V，120min，将蛋白从SDS-PAGE凝胶转至PVDF膜。3 %的脱脂奶 粉/PBS-T封闭，按1:500稀释Rabbit anti-Bcl-2/-Bax/-Survivin，4°C孵育过夜。1:3000稀 释二抗Goat anti-Rabbit IgG,孵育lh,增强化学发光（enhanced chemiluminescence, ECL)显影。UVI凝胶成像系统摄像。
[0106] 图9列出了空白对照，1.00yg/mL左金方，100.0yg/mL 5-FU以及1.00yg/mL左金方 联合100.0yg/mL 5-FU分别作用HT-29 24h后，调节细胞中BAX、Bcl-2和Survivin蛋白表达 的Western Blotting的凝胶电泳图（n = 6)。
[0107] 从试验结果可看出：1.00ug · mL-1左金方、lOO.OOug · mL-S-FU分别作用HT-29细 胞24h后，Bax的表达增加，而Bcl-2和Survivin蛋白的表达减少；左金方联合5-FU( 1.00+ 100.00)联合用药作用24h，Bax的表达进一步增加，而Bcl-2和Survivin蛋白的表达进一步 减少，与各单独用药组比较P〈〇. 05，差异显著。
[0108] 3.6左金方与5-FU联合用药对HT-29细胞形态学的影响
[0109]将HT-29细胞(2 X105 · ml/1)接种于6孔板内的盖玻片上，各实验组按要求给予相 应的药物，加入新鲜配制的4%多聚甲醛(pH为7.4)，于37°C固定细胞30min，PBS液洗2次，加 5mg/L Hochest 33258染色液染色30min，PBS液洗后，用封片液（20mmol .L-1梓檬酸， 50mmol · Γ1磷酸氢二钠，50%甘油，pH 5.5)封片后荧光显微镜观察、摄片。
[0110] 试验结果如图10所示，图10是空白对照，1.00yg/mL左金方，50.0yg/mL 5-FU， 100.00yg/mL 5-FU，1.00yg/mL左金方联合50.0yg/mL 5-FU以及 1.00yg/mL左金方联合 100.0 yg/mL 5-FU作用于HT-2924h的细胞形态学显微镜观察图（X 200)。
[0111] 从试验结果可看出，经Hoehest33258荧光染色后，荧光显微镜下见空白组HT-29细 胞膜均完整，核形态饱满，核质着色浅，密度均匀一致，见图10A;1.00ug · ml/1左金方、 50.00ug · mL-S-FIMOO.OOug · mL-S-FU作用24h后，细胞出现典型凋亡形态特征：细胞膜 皱缩，细胞核相对变小荧光明显增强，成高度块状，见图10B、10C、10D;左金方+5-FU( 1.00+ 50.00)、左金方+5-FU(l.00+100.00)联合用药作用24h，细胞除上述特征外，可见凋亡小体 数目明显多于各单独用药组，见图10E、10F。
[0112] 综上可得，左金方与5-FU联合用药比左金方，或者5-FU单独用药对肠癌的治疗效 果更好，左金方与5-FU联合用药，显著提高了人正常结肠直肠黏膜上皮细胞FHC的细胞存活 率，大幅降低了 5-FU的细胞毒性作用，通过促进肠癌细胞HT-29细胞中Bax蛋白的高表达和 Be 1 -2、Surv i v in蛋白的低表达，促进结肠癌细胞的凋亡。本发明的研究成果对降低临床抗 肠癌化疗药物的毒副作用，提高治疗效果，具有重大的意义。
【主权项】
1. 中药黄连与吴茱萸的提取物与5-氟尿嘧啶联合在制备治疗肠癌的药物中的用途。2. 如权利要求1所述的用途，其中所述中药黄连与吴茱萸的提取物为质量比为6:1的中 药黄连与吴茱萸的提取物。3. 如权利要求2所述的用途，其中所述提取物为水提物。4. 如权利要求1所述的用途，其中所述联合为将5-氟尿嘧啶在中药黄连与吴茱萸的提 取物之前、同时或者之后给予患者。5. 如权利要求1所述的用途，其中所述中药黄连与吴茱萸的提取物按照中药复方左金 方的方法制备。6. 如权利要求5所述的用途，其中所述左金方的制备方法包括:取30g黄连与5g吴茱萸， 加8倍蒸馏水浸泡30分钟，加水煎煮3次，每次30分钟，过滤，合并3次滤液，冷冻干燥，每克干 粉含生药3.98g;经HPLC法测定，左金方冻干粉中含小檗碱39.85 %，巴马汀9.19 %，药根碱 4.86 %，吴朱英喊0.17 %，吴朱英次喊0.19 %。7. 如权利要求1所述的用途，其中所述肠癌为结肠癌。
【专利摘要】本发明提供了中药黄连与吴茱萸的提取物（左金方）与5?FU联合在制备治疗肠癌的药物中的用途。左金方与5?FU联合用药，显著提高了细胞的存活率，大幅降低了5?FU的毒副作用，通过促进细胞中Bax蛋白的高表达和Bcl?2、Survivin蛋白的低表达，促进肠癌细胞HT?29的凋亡，比左金方，或者5?FU单独用药对肠癌的治疗效果更好。
【IPC分类】A61K36/718, A61K31/513, A61P35/00, A61K36/754
【公开号】CN105726726
【申请号】CN201610122172
【发明人】余惠旻, 周红祖, 周禹练
【申请人】深圳大学
【公开日】2016年7月6日
【申请日】2016年3月2日
文档序号 :
【 9933695 】
技术研发人员：余惠旻,周红祖,周禹练
技术所有人：深圳大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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