中药黄连与吴茱萸的提取物联合5-氟尿嘧啶在制备治疗肠癌药物中的应用
[0033] 3、细胞形态学观察
[0034]将HT-29细胞(2X105/mL)接种于6孔板内的盖玻片上，各实验组按要求给予不同 的处理因素后，加入新鲜配制的4%多聚甲醛(pH为7.4)于37 °C固定细胞30min，PBS液洗两 次，加5mg/L Hochest 33258染色液染色30min，PBS液洗后，用封片液（20mmol/L梓檬酸， 50mmol/L磷酸氢二钠，50%甘油，pH 5.5)封片后荧光显微镜观察、摄片。
[0035] 4、统计学处理
[0036]以上全部数据均采用SPSS10.0统计软件进行统计分析，数据用均数土标准差 丨丨表示，组间比较用单因素方差分析(One-way AN0VA)检验。
[0037]【实施例1】左金方或者5-FU单独用药对FHC细胞存活率的影响 [0038] 1.1左金方对FHC细胞存活率的影响
[0039]取人正常结肠直肠粘膜上皮细胞FHC对数生长期细胞，用DMEM培养基制成细胞悬 液(5X104/mL)加入96孔板，lOOyL/孔，培养12h后给药，实验组分别加入不同浓度供试药 物，分别培养24、48h，向每孔加入10yL的CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4小时，用酶 标仪测定在450nm处的吸光度(0D)。细胞抑制率=(1-实验组平均0D值/对照组平均0D值）X 100%〇
[0040] CCK-8实验结果如表1所示。表1列出了不同浓度的左金方作用于rac细胞24h和48h 后FHC细胞的存活率(n = 6)。
[00411 表1不同浓度的左金方作用不同时间对FHC细胞存活率的影响(η = 6)
[0042]
[0043] *:与对照组相比ρ〈0.05 :与对照组相比ρ〈0.01;
[0044] 图1为表1的曲线图，从图1可以更加直观地看出左金方与FHC细胞存活率的关系。
[0045] CCK-8实验结果显示：1)左金方对FHC细胞活力的影响很小，即当给药浓度增加到 一定程度后，随着给药浓度的增加，作用时间的延长，细胞活力稍有减弱；2)小剂量的左金 方能促进人正常结肠直肠粘膜上皮细胞的增殖和分裂。
[0046] 1.2 5-FU对FHC细胞存活率的影响
[0047]取人正常结肠直肠黏膜上皮细胞FHC对数生长期细胞，用DMEM培养基制成细胞悬 液(5X104/mL)加入96孔板，lOOyL/孔，培养12h后给药，实验组分别加入不同浓度供试药 物，分别培养24、48h，向每孔加入10yL的CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4小时，用酶 标仪测定在450nm处的吸光度(0D)。其中将未经处理的对照组细胞的存活率设定为100%。 细胞抑制率=(1-实验组平均0D值/对照组平均0D值）X 100%。
[0048] CCK-8实验结果如表2所示。表2列出了不同浓度的5-FU作用于FHC细胞24h和48h后 FHC细胞的存活率(n = 6)。
[0049] 表2不同浓度5-FU作用不同时间对FHC细胞存活率的影响(η = 6)。
[0050]
[0051 ] *:与对照组相比ρ〈0.05; #:与对照组相比ρ〈0.01
[0052] 图2为表2的曲线图，从图2可以更加直观地看出5-FU与Hie细胞存活率的关系(η = 6)〇
[0053] 从试验结果可知：1 )5_FU对FHC细胞的活力的影响呈现"浓度-时间依赖性"的关 系，即随着给药浓度的增加，作用时间的延长，细胞活力逐渐减弱;2)与左金方不同，小剂量 的5-FU会引起细胞毒性，随着用药浓度增加，其毒性亦增强。
[0054]【实施例2】左金方或者5-FU单独用药对HT-29细胞凋亡率的影响 [0055] 2.1左金方对HT-29细胞凋亡率的影响
[0056] 取HT-29对数生长期细胞，用DMEM培养基调整细胞密度为2 X 105/mL，以1.5mL/ well种入6孔板。每组6个复孔，培养12h，然后加入相应的药物作用24h，细胞刷刮取细胞， 800r · min-1离心5min，去上清，加入PBS重悬，调整细胞浓度为1 X 106/mL。取适量于流式管 中，加入工作液500uL，再加入荧光染料，350目尼龙网滤膜过滤去除细胞团块，室温避光染 色15min后，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。测定数据按流式细胞仪所配置的软件进行数据 处理，以右下代表的早期凋亡率加上右上代表的中后期凋亡率的总和代表细胞调亡率。 [0057] 试验结果如表3所示。表3列出了不同浓度的左金方作用于HT-29细胞24h后，HT-29 细胞的凋亡率(n = 6)。
[0058] 表3不同浓度左金方作用24h对HT-29细胞凋亡率的影响(n = 6)
[0059]
[0060] *:与对照组相比p〈0 · 05 :与对照组相比p〈0 · 01
[0061 ]图3为表3的曲线图，从图3可以更加直观地看出5-FU与HT-29细胞凋亡率的关系(η =6)〇
[0062] 从试验结果可知：1)左金方对ΗΤ-29凋亡率的影响呈现"浓度-时间依赖性"的关 系，即随着给药浓度的增加，作用时间的延长，细胞凋亡率逐渐增加；2)小剂量的左金方就 能促进ΗΤ-29细胞的凋亡。
[0063] 2.2 5-FU对ΗΤ-29细胞凋亡率的影响
[0064] 取对数生长期细胞，用DMEM培养基调整细胞密度为2 X 105/mL，以1.5mL/wel 1种入 6孔板。每组6个复孔，培养12h，然后加入相应的药物作用24h，细胞刷刮取细胞，800r · min-1离心5min，去上清，加入roS重悬，调整细胞浓度为lX106/mL。取适量于流式管中，加入工 作液500uL，再加入荧光染料，350目尼龙网滤膜过滤去除细胞团块，室温避光染色15min后， 上流式细胞仪检测细胞凋亡率。测定数据按流式细胞仪所配置的软件进行数据处理，以右 下代表的早期凋亡率加上右上代表的中后期凋亡率的总和代表细胞调亡率。
[0065] 试验结果如表4所示。表4列出了不同浓度的5-FU作用于HT-29细胞24h后HT-29细 胞的凋亡率(n = 6)。
[0066] 表4不同浓度的5-FU作用24h对HT-29细胞凋亡率的影响(η = 6)
[0067]
[0068] *:与对照组相比ρ〈0 · 05; #:与对照组相比ρ〈0 · 01
[0069] 图4为表4的曲线图，从图4可以更加直观地看出5-FU与ΗΤ-29细胞凋亡率的关系。 [0070]从试验结果可知：1 )5-FU对ΗΤ-29凋亡率的影响呈现"浓度-时间依赖性"的关系， 即随着给药浓度的增加，作用时间的延长，细胞凋亡率逐渐增加；2)50.OOug · ml/1与 100.OOug · mL-S-FU作用HT-29细胞24h后的细胞凋亡率分别为（50.40± 1.45) %和(65.30 ±1.27)%〇
[0071]【实施例3】左金方与5-FU联合用药 [0072] 3.1联合用药浓度的选定
[0073] 左金方浓度为1.00叫.11^-1时，作用？!1(：细胞2411，细胞存活率为（106.68± 1 · 65) %，48h为（100 · 16 ± 1 · 23) %，作用HT-29细胞24h，细胞凋亡率为（37 · 90 ± 1 · 06) %，选 定1 .OOug · ml/1为左金方联合用药的浓度。
[0074] 3.2 5-FU联合用药浓度的选定
[0075] 5-FU浓度为50 · 00ug · mL-1时，作用FHC细胞24h，细胞存活率为(47 · 76 ± 1 · 48) %， 48h为（37.69±1.62)%，作用HT-29细胞24h，细胞凋亡率为（50.40 ± 1.45) %。
[0076] 5-FU浓度为lOO.OOug · mL-1时，作用FHC细胞24h，细胞存活率为（42.42土 1.74)%，4811为（32.79±1.95)%，作用!11'-29细胞2411，细胞凋亡率为（65.30±1.27)%，选 定50.00、100.001^.1111^-1为5-?1]联合用药的浓度。
[0077] 3.3左金方与5-FU联合用药对FHC细胞存活率的影响
[0078]取人正常结肠直肠黏膜上皮细胞FHC对数生长期细胞，用DMEM培养基制成细胞悬 液(5X104/mL)加入96孔板，lOOyL/孔，培养12h后给药，实验组分别加入不同浓度供试药 物，分别培养24、48h，向每孔加入10yL的CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4小时，用酶 标仪测定在450nm处的吸光度(0D)。细胞抑制率=(1-实验组平均0D值/对照组平均0D值）X 100%〇
[0079] 试验结果如表5、表6所示。表5、表6列出了对照组，l.OOug · ml/1左金方，50.00ug · mL 一 b-FU以及二者联合用药分别作用于FHC细胞24h和48h后FHC细胞的存活率(n = 6)。
[0080] 表5左金方与5-FU联合用药作用不同时间对FHC细胞存活率的影响(n = 6)
[0081]
[008
文档序号 :
【 9933695 】
技术研发人员：余惠旻,周红祖,周禹练
技术所有人：深圳大学
备 注：该技术已申请专利，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
声 明 ：此信息收集于网络，如果你是此专利的发明人不想本网站收录此信息请联系我们，我们会在第一时间删除
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